Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Technika przesiewania buka amerykańskiego pod kątem odporności na owada łuskowatego (Cryptococcus fagisuga Lind.)

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51515

⸱

27 maja 2014

 , 
1Northern Research Station, US Forest Service

W tym artykule

Podsumowanie

Choroba kory buka jest inicjowana przez działania żywieniowe owadów łuskowych, które tworzą punkty wejścia grzyba w korze. Drzewa, które są odporne na owada łuskowego, są również odporne na choroby. Tutaj prezentujemy opracowany przez nas protokół do badania poszczególnych drzew bukowych pod kątem odporności na łuski.

Streszczenie

Choroba kory buka (BBD) powoduje wysoki poziom początkowej śmiertelności, pozostawiając ocalałe drzewa, które są znacznie osłabione i zdeformowane. Choroba jest inicjowana przez żerowanie inwazyjnego owada łuskowatego, Cryptococcus fagisuga, który tworzy punkty wejścia dla infekcji przez jednego z Neonectria gatunki grzybów. Bez porażenia łuskami szansa na infekcję grzybiczą jest niewielka. Użycie jaj łuskowych do sztucznego nasiewania zdrowych drzew w drzewostanach silnie dotkniętych BBD wykazało, że drzewa te były odporne na część kompleksu chorobowegozawierającą owady łuskowate 1. Tutaj przedstawiamy opracowany przez nas protokół, oparty na technice sztucznego pochłaniania przez Houston2, który można wykorzystać do przesiewania drzew odpornych na łuski na polu oraz w mniejszych sadzonkach doniczkowych i szczepach. Identyfikacja drzew odpornych na łuski jest ważny element zarządzania BBD poprzez programy poprawy jakości drzew i manipulację w gospodarce leśnej.

Wprowadzenie

Choroba kory buka (BBD) miała szkodliwy wpływ na buk amerykański w Ameryce Północnej od czasu wprowadzenia inwazyjnego owada łuskowatego Cryptococcus fagisuga, w kanadyjskiej prowincji Nowa Szkocja pod koniec lat 90.XIX wieku 3. Ten kompleks owado-chorobowy jest inicjowany, gdy owad łuskowy buka wprowadza swój żerowisko do kory, tworząc małe szczeliny, które stanowią wejście dla infekcji przez jednego z Neonectria gatunek grzyba (Neonectria ditissima lub Neonectria faginata). W miarę wzrostu grzybni duże obszary tkanki mogą obumrzeć, ostatecznie całkowicie opasując drzewo. Uszkodzenia spowodowane chorobą osłabiają drzewo, czyniąc je podatnym na pękanie przy silnym wietrze4. Śmiertelność w pierwszej fali choroby wynosi nawet 50%5. Drzewa, które przetrwały, są często mocno zdeformowane, ponieważ zrakowacenia obniżają wartość drzewa jako produktu drzewnego. Takie drzewa mają skłonność do kiełkowania korzeniowego, co prowadzi do powstawania "bukowych zarośli", które uniemożliwiają zadomowienie się innym, bardziej pożądanym gatunkom, obniżając wartość ekonomiczną i ekologiczną drzewostanu.. Chociaż jest mało prawdopodobne, aby choroba kory buka doprowadziła do wyginięcia buka amerykańskiego, zmienia ona skład drzewostanu i zdrowie, prowadząc do zmniejszenia ilości pożywienia i siedlisk dla dzikich zwierząt7,8.

W drzewostanach dotkniętych BBD przez wiele lat, drzewa, które pozostają wolne od jakichkolwiek objawów choroby, zostały zgłoszone. Próby sztucznego zaszczepienia wykazały, że te drzewa są odporne na owadałuskowatego 2. Bez inwazji łusek, istnieje niewielka szansa na infekcję Neonectria, minimalizując wpływ grzyba. Duża śmiertelność u buka amerykańskiego z powodu Neonectria nigdy nie zgłoszono zakażenia przy braku wcześniejszej inwazji łusek, więc odporność na owada z łuski bukowej skutkuje odpornością na BBD.

Ostatnie badania nad zarządzaniem BBD skupiały się na identyfikacji, rozmnażaniu, hodowli i zachowaniu amerykańskich buków z odpornością na owada łuskowego. Badania genetyczne wykazały, że odporność na owada łuskowego jest dziedziczna, a staranna selekcja i hodowla odpornych drzew może skutkować znaczną poprawą w ciągu jednego pokolenia9. Odkrycie to podsyciło wysiłki stanowych i krajowych zarządców lasów w Stanach Zjednoczonych w celu założenia regionalnych sadów nasiennych odpornego buka amerykańskiego, aby zapewnić źródło genetycznie zróżnicowanych nasion odpornych na BBD do nasadzeń rekultywacyjnych10,11. Badania wykazały również, że manipulacja genetyką drzewostanu w uprawie leśnej poprzez usuwanie drzew podatnych i zachowanie drzew odpornych może prowadzić do poprawy stanu drzewostanu9,12.

Zarządzanie BBD poprzez działania związane z ulepszaniem drzew lub poprzez realizację zaleceń dotyczących uprawy leśnej wymaga umiejętności selekcji i rozróżniania między drzewami odpornymi na łuski buka a wrażliwymi. Przedstawione tutaj metody zostały zaadaptowane z metody wprowadzonej po raz pierwszy przez Dave'a Houstona do sztucznego zaszczepiania sadzonek jajami z łuski buka1. Metoda może być stosowana jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji loci cech ilościowych (QTL) związanych z opornością lub do rozróżnienia między odpornymi i podatnymi siewkami doniczkowymi lub szczepionymi rametami w badaniach genetycznych. Alternatywnie może być stosowana do przesiewania dojrzałych drzew na polu w celu zidentyfikowania odpornych drzew do rozwoju sadu nasiennego lub utrzymania na polu. Podatne drzewa można zidentyfikować i usunąć, aby zminimalizować skutki choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Materiał roślinny: dojrzałe drzewa polne, sadzonki doniczkowe lub przeszczepy doniczkowe

  1. Do badań terenowych wybierz dojrzałe, zdrowe buki amerykańskie, które nie wykazują oznak porażenia łuskami lub choroby, do testów pod kątem możliwej odporności. Konieczne będzie również zidentyfikowanie drzew o widocznej podatności, aby można je było wykorzystać jako kontrolę (rys. 1).
  2. W celu przetestowania sadzonek doniczkowych lub szczepów należy zebrać i wykiełkować orzechy bukowe zgodnie z opisem w Koch & Carey, 2004 lub zrazik szczepionki, jak opisano w Carey i in., 2013.
  3. Hoduj sadzonki lub szczepy w mieszance gleby doniczkowej wzbogaconej o 47 g mikroelementów, 477 g nawozu o spowolnionym uwalnianiu 15N-3.9P-9.9K, 700 g gruboziarnistego perlitu i 75 g siarczanu glinu na worek o pojemności 2,8 stopy sześciennej. W razie potrzeby w dalszej części sezonu wegetacyjnego nawozić rośliny co tydzień rozpuszczalnym 17N-1,3P-14,1K w ilości 200 ppm azotu.
  4. W okresie wegetacji trzymaj rośliny w zacienionym domu. Pozwól roślinom przejść w stan spoczynku na zewnątrz jesienią przed przeniesieniem ich do magazynu o kontrolowanej temperaturze (~4 °C) od listopada do kwietnia.

2. Kolekcja jaj łusek bukowych

  1. W drzewostanie zaatakowanym przez BBD należy sprawdzić silnie porażone drzewa (łatwe do zidentyfikowania po ich "wybielonym" wyglądzie, Ryc. 1A) za pomocą ręcznego szkła powiększającego, aby potwierdzić obecność jaj, zwykle obfitych od połowy lipca do połowy sierpnia.
  2. Za pomocą pędzla delikatnie zetrzyj białe, woskowe grudki dorosłych owadów łuskowych, jaj i innych zanieczyszczeń do plastikowej, zamykanej torby na odpady o pojemności jednego galona (Rysunek 1B). Zbierz z co najmniej trzech różnych drzew oddalonych od siebie o co najmniej 12 m.
  3. W razie potrzeby przechowuj jaja w szczelnie zamkniętym worku zbiorczym przez okres do dwóch tygodni w temperaturze 4 °C. Przyklej mały kawałek (2,5 cm kwadratowy) zwilżonej pianki polietylenowej do wnętrza worka, aby zapobiec wysychaniu jaj.
  4. Aby oddzielić jaja łuskowe (0,15 x 0,25 mm) od dorosłych (0,60 mm) i zanieczyszczeń, należy skonstruować sito za pomocą krótkiego kawałka rury PVC o długości 2 stóp i złączki do podparcia kwadratowego kawałka siatki nylonowej o grubości 250 mikronów (rysunek 2).
  5. Opróżnij mieszaninę dorosłych, wosku, jaj i zanieczyszczeń z worka zbiorczego na sito i użyj małego pędzelka, aby delikatnie zachęcić jaja do przejścia przez siatkę do szklanej szalki Petriego poniżej. Należy unikać plastikowych szalek Petriego, ponieważ zatrzymują one więcej elektryczności statycznej, co utrudnia przesuwanie jaj. Jaja przed i po przesianiu pokazano na rysunku 3.
  6. Oczyszczone jaja można przechowywać na szalce Petriego w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień. Aby zapobiec wysychaniu jaj, przyklej wilgotny kawałek pianki do pokrywki i uszczelnij Parafilmem.

3. Testy żywotności jaj

  1. Aby ocenić żywotność jaj, użyj strzykawki o pojemności 10 cm3 i nałóż cienki pierścień wazeliny na obwód dna szklanej szalki Petriego o średnicy 60 mm (ryc. 4A).
  2. Przenieś około 100 jaj na środek pierścienia, umieść pokrywkę na szalce Petriego i zamknij Parafilmem. Pozostawić szczelnie zamkniętą szalkę Petriego w temperaturze pokojowej na 2 tygodnie lub 3 tygodnie, jeżeli jaja były przechowywane w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem oznaczania.
  3. Wyklute nimfy utkną w wazelinie i można je łatwo policzyć, a puste jaja można łatwo odróżnić od niewyklutych jaj po ich kolorze i połysku (ryc. 4B). Oblicz żywotność, dzieląc liczbę nimf przez sumę pustych jaj i pozostałych pełnych jaj. Dobra żywotność powinna mieścić się w przedziale od 75% do 90% jaj wyklutych.

4. Badanie odporności na skalę dużych dojrzałych buków na polu

  1. W celu przeprowadzenia testu ilościowego odlicz 500 jaj za pomocą mikroskopu preparacyjnego i za pomocą małej szpatułki delikatnie rozsyp je na środku wstępnie zwilżonego, otwartokomórkowego prostokąta z pianki polietylenowej o wymiarach 10 x 15 x 1,3 cm. Aby zwilżyć pianę, zwilż ją, a następnie wyciśnij jak najwięcej wody. W przypadku testu jakościowego można policzyć 500 jaj i umieścić je w małej szklanej fiolce i narysować linię "wypełnienia", którą można użyć do odmierzenia dodatkowych partii około 500 jaj.
  2. Umieść podkładkę piankową na drzewie testowym stroną z jajkiem skierowaną do kory. Przytrzymaj podkładkę na miejscu za pomocą liny, sznurka, sznurka lub drutu metalowego pokrytego tworzywem sztucznym. Należy używać materiałów na bazie tworzyw sztucznych lub metalu, a nie materiałów z włókien naturalnych, które są łatwiej zbierane przez dzikie zwierzęta.
  3. Wyłóż górną i boki wstępnie przyciętego kawałka paroprzepuszczalnej wodoodpornej folii domowej o wymiarach 23 x 30 cm klejem silikonowym na bazie octanu i umieść go na podkładce testowej z pianki. Dociśnij krawędzie folii domowej do drzewa, aby uzyskać wodoodporne uszczelnienie. Umieść nylonowy sznurek lub drut sprzętowy pokryty tworzywem sztucznym wokół drzewa i owijki domowej, aby utrzymać go na miejscu, gdy klej twardnieje (Rysunek 5).
  4. Umieść co najmniej dwie podkładki testowe na każdym drzewie testowym, najlepiej po przeciwnych stronach pnia. W każdym miejscu umieść podkładki testowe na co najmniej 2 podatnych drzewach (z widocznym naturalnym porażeniem łusek) jako kontrolę. Przed umieszczeniem poduszek testowych na drzewach kontrolnych należy usunąć wszelkie naturalnie występujące owady łuskowate lub jaja za pomocą szczotki o twardym włosiu.
    Uwaga: Piankowe podkładki z jajami można również umieszczać na drzewach w celu hodowli jaj łuskowatych, co może być szczególnie pomocne na obszarach, gdzie poziom porażenia jest niski.

5. Badanie odporności na skalę sadzonek doniczkowych lub szczepów

  1. Do testowania wybierz drzewa doniczkowe o minimalnej średnicy 1 cm (suwmiarka 5 cm nad linią gleby), które są wystarczająco wysokie, aby umieścić na nich co najmniej 2 oddzielne podkładki testowe. W razie potrzeby przycinaj małe boczne gałęzie, aby zrobić miejsce na podkładki testowe.
  2. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby odliczyć 150 jaj i rozsypać je na wstępnie przyciętej i zwilżonej podkładce z pianki polietylenowej o wymiarach 2,5 x 7,6 x 1,3 cm.
  3. Przymocuj podkładkę piankową do sadzonki stroną jajową do kory za pomocą drutu pokrytego tworzywem sztucznym. Owiń mały kwadrat owijki domowej wokół sadzonki tuż nad pianką i uszczelnij go silikonem na bazie octanu (patrz rysunek 6A).
  4. Uwzględnij znane podatne rodziny sadzonek lub szczepy jako kontrole.

6. Gromadzenie danych

Uwaga: Około 52 do 57 tygodni po umieszczeniu piankowych podkładek i jajek na drzewach testowych, dane mogą być zbierane. Ważne jest, aby nie robić tego, dopóki dorosłe osobniki nie zaczną składać jaj, aby można było określić ich zdolność do rozmnażania. Na niektórych odpornych drzewach nie jest niczym niezwykłym obserwowanie niewielkiej liczby dorosłych osobników, ale bez rozmnażania.

  1. Ostrożnie zdejmij podkładkę piankową i policz liczbę dorosłych owadów łuskowych osadzonych na korze za pomocą soczewki ręcznej lub szkła powiększającego (10X).
  2. Po usunięciu podkładki piankowej nierzadko zdarza się, że niektóre dorosłe osobniki i większość skupisk jaj są ściągane z drzewa wraz z pianką (patrz ryc. 7). Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz skupiska jaj i dorosłe osobniki, które pozostały przyczepione do piankowej podkładki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia siewkę odporną (C) oraz dwie siewki podatne (D, E) wykazujące różny stopień podatności. Przykład wyglądu podatnego dojrzałego drzewa 57 tygodni po przeprowadzeniu testu sztucznego zarażenia pokazano na Rysunku 5B. Po oddarciu pianki z drzewa często zdarza się, że czerwce i ich klastry jaj pozostają przyklejone do pianki, co pokazano na Rysunku 7; dlatego niezbędne jest gromadzenie danych zarówno z d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki wymagane do powodzenia tego testu obejmują przeprowadzenie testu żywotności jaj i zastosowanie podatnych kontroli w każdym badanym miejscu oraz w przypadku materiałów doniczkowych. Ważne jest również, aby użyć więcej niż jednej podkładki testowej na drzewo lub sadzonkę. Odkryliśmy, że zarówno w terenie, jak i w bardziej kontrolowanych testach na roślinach doniczkowych, Częstym źródłem błędów może być awaria klocków. Na przykład w terenie, nawet przy naszej modyfikacji przykrycia podkładki testowej folią d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie z Programów Monitorowania Oceny Ochrony Zdrowia Leśnego i Rozwoju Technologii Specjalnych Służby Leśnej Stanów Zjednoczonych, które wsparły rozwój, modyfikację i zastosowanie opisanego tutaj protokołu w celu identyfikacji drzew, które są odporne i podatne na owady łuskowe buka. Jesteśmy również wdzięczni Holden Arboretum, Kirtland, OH, za ich nieustające partnerstwo i wsparcie naszego amerykańskiego programu badań przesiewowych odporności buka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siatka nylonowa, 250 mikronówfigure-materials-1 Małe częściCMN-0250-DWielkość oczek siatki: 250 mikronów kwadratowych, % powierzchni otwartej: 34, średnica drutu: 180 mikronów, szerokość: 24”, Długość: 12”, Ilość w opakowaniu: 1
membrana paroizolacyjna Tyvek HomeWrapfigure-materials-2 DuPontD1349991rolka o wymiarach 9 stopi x 150 stopi, z możliwością zamówienia cięcia na pół.
pianka polietylenowa, ½” gruba/y/e figure-materials-3 Columbus Foam Productsrolka 2 ft x 50 ft
MetroMix 510figure-materials-4 Sun Gro Horticulture2,8 st. stopnia sześciennego kory, torfu wysokiego, wermikulitu, popiołu z kory, startowej dawki składników odżywczych (z gipsem), azotowego nawozu o spowolnionym uwalnianiu i wapień dolomitowy
Osmocote Plus 15-9-12figure-materials-5 EverrisE903206Standardowe uwalnianie w ciągu 3–4 miesięcy
Sight Savers 10Xfigure-materials-6 Bausch & Lomb813434oświetlony okular Coddington z 10-krotnym powiększeniem
Nikon Mini Field Stereoscopefigure-materials-7 Nikon7314powiększenie 20x
Silikon II przeźroczystyfigure-materials-8 Inżynieria genetyczna159538przezroczyste okienko 82 g & uszczelka do drzwi

Bibliografia

  1. Houston, D. R. A technique to artificially infest beech bark with the scale, Cryptococcus fagisuga (Lindinger). U.S. Forest Service. , Northeastern Forest Experiment Station. Broomhall, PA. (1982).
  2. Houston, D. R. American beech resistance to Cryptococcus fagisuga. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 38-42 (1983).
  3. Ehrlich, J. The beech bark disease: a nectria disease of Fagus, following Cryptococcus fagi. 10, 593-692 (1934).
  4. Papaik, M. J., Canham, C. D., Latty, E. F., Woods, K. D. Effects of an introduced pathogen on resistance to natural disturbance: beech bark disease and withdrow. 35, 1832-1843 (2005).
  5. Miller-Weeks, M. Current status of beech bark disease in New England and New York. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 21-23 (1983).
  6. Houston, D. R. Beech bark disease: The aftermath forests are structured for a new outbreak. J. For. 73, 660-663 (1975).
  7. Twery, M. J., Patterson, W. A. Variations in beech bark disease and its effects on species composition and structure of northern hardwood stands in central New. 14, 565-574 (1984).
  8. Jakubus, W. J., McLaughlin, C. R., Jensen, P. G., McNulty, S. A., et al. Alternate year beechnut production and its influence on bear and marten populations. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 79-87 (2005).
  9. Koch, J. L., Carey, D. W., Mason, M. E., Nelson, C. D. Assessment of beech scale resistance in full- and half-sib families. Can. J. For. Res. 40, 265-272 (2010).
  10. Koch, J. L. Beech bark disease: The oldest “new” threat to American beech in the United States. Outlooks Pest Manag. 21, 64-68 (2010).
  11. Koch, J. L., Mason, M. E., Carey, D. W., et al. Screening for resistance to beech bark disease: improvements and results from seedlings and grafted field selections. Proceedings of the 4th International Workshop on Genetics of Host-Parasite Interactions in Forestry. Palmieri, K., et al. , U.S. Forest Service, Pacific Southwest Research Station. Albany, CA. (2012).
  12. Leak, W. B. Fifty year impacts of the beech bark disease in the Bartlett Experimental Forest, New Hampshire. Northern J. Appl. For. 23, 141-143 (2006).
  13. Koch, J. L., Carey, D. W., et al. Controlled cross-pollinations with American beech trees that are resistant to beech bark disease. Proceedings of the 14th Central Hardwood Forest Conference. Yaussy, D. A., et al. , U.S. Forest Service, Northeastern Research Station. 358-364 (2004).
  14. Carey, D. W., Mason, M. E., Bloese, P., Koch, J. L. Hot callusing for propagation of American beech by grafting. HortSci. 48, 620-624 (2013).
  15. Koch, J. L., Carey, W. W., et al. The genetics of resistance of American beech to beech bark disease: knowledge through 2004. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 98-105 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Buk ameryka skitest ywotno ci jajtechnika sztucznego zara aniadrzewa odporne na czerwcechoroba kory bukametoda przesiewowa w polumocowanie podk adki piankowejliczenie pod mikroskopem stereoskopowympodk adka z pianki polietylenowej
Technika przesiewania buka amerykańskiego pod kątem odporności na owada łuskowatego (Cryptococcus fagisuga Lind.)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.