Artykuł metodologiczny

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

DOI:

10.3791/51525

⸱

23 listopada 2014

 ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler School of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podskórny test czopów matrygelowych u myszy jest metodą z wyboru do oceny in vivo czynników pro- i antyangiogennych. W tej metodzie pożądane czynniki są wprowadzane do zimno-płynnego żelu naśladującego ECM, który po wstrzyknięciu podskórnym krzepnie, tworząc środowisko naśladujące środowisko nowotworowe. Macierz ta umożliwia przenikanie do komórek gospodarza, takich jak komórki śródbłonka, a tym samym tworzenie naczyń krwionośnych.

Tutaj proponujemy nowy zmodyfikowany test czopów matrigelowych, który może być wykorzystany do zilustrowania potencjału angiogennego puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe, w przeciwieństwie do konkretnego czynnika (np. bFGF i VEGF) lub czynnika. Zatyczka zawierająca żel naśladujący ECM jest wykorzystywana do wprowadzenia gospodarza (tj. Myszy) z pulą czynników wydzielanych do CM szybko rosnących komórek glejaka wytwarzającego nowotwór. Wcześniej opisaliśmy obszerne porównanie potencjału angiogennego ludzkiego glejaka wielopostaciowego U-87 MG i jego uśpionego klonu, w tym modelu systemu, wykazując indukowaną angiogenezę w komórkach rodzicielskich U-87 MG. CM przygotowuje się przez filtrowanie zebranych pożywek z nakładających się płytek do hodowli tkankowych dowolnej linii komórkowej po 48-godzinnej inkubacji. W związku z tym zawiera tylko czynniki wydzielane przez komórki, bez samych komórek. Opisano tutaj połączenie dwóch modalności obrazowania, obrazowania ultrasonograficznego z mikropęcherzykami ze wzmocnieniem kontrastowym i endomikroskopii konfokalnej przyżyciowej, w celu dokładnej charakterystyki w czasie rzeczywistym zakresu, morfologii i funkcjonalności nowo powstałych naczyń krwionośnych w obrębie czopów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test angiogenezy z korkiem matrigelowym został po raz pierwszy opisany przez Kibbeya i wsp. w 1992 roku, gdzie został użyty do oceny stymulacji angiogenezy przez peptyd SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val)1. W przeciwieństwie do innych testów angiogenezy in vivo, takich jak angiogeneza rogówki myszy lub testy błony omoczniowej kosmówki piskląt, ten test jest stosunkowo łatwy do wykonania2. Wstrzykiwany żel naśladujący ECM może zawierać komórki, związki i/lub czynniki proangiogenne lub antyangiogenne. Oceniając aktywność związku antyangiogennego, czop zwykle zawiera mieszaninę czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), a substancja antyangiogenna może być podawana bezpośrednio do czopa lub ogólnoustrojowo3,4.

Żel naśladujący ECM jest wstrzykiwany podskórnie, gdzie krzepnie w ciągu kilku minut. Ocenę rekrutacji naczyń krwionośnych w powstałym czopie zwykle przeprowadza się poprzez pomiar poziomu hemoglobiny w czopie, pomiar sygnału fluorescencji po wstrzyknięciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), barwienie immunologiczne skrawków histologicznych pod kątem markerów specyficznych dla śródbłonka lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)2,5,6. Jednak ocena ta pozwala tylko na analizę punktu końcowego i brakuje informacji na temat funkcjonalności i morfologii naczyń krwionośnych. Ponadto pomiary objętości osocza, zarówno za pomocą poziomu hemoglobiny, jak i przy użyciu dekstranu-FITC jako wskaźnika, mogą być mylące, ponieważ na zawartość krwi ma wpływ wielkość naczyń krwionośnych i zakres zastoju krwi. Jest to szczególnie istotne, gdy rekrutowane unaczynienie charakteryzuje się zwiększonym efektem przepuszczalności i retencji (EPR)7.

Proponujemy tutaj nową, bardziej precyzyjną metodę wizualizacji rekrutowanych naczyń krwionośnych poprzez połączenie dwóch uzupełniających się metod obrazowania. Ultrasonografia ultrasonograficzna o wysokiej rozdzielczości z kontrastem (US) w połączeniu z endomikroskopią przyżyciową włóknisto-konfokalną może dostarczyć informacji nie tylko o gęstości naczyń krwionośnych, ale także o ich morfologii i funkcjonalności. Co więcej, analiza ta może być wykonywana w kilku punktach czasowych, co umożliwia monitorowanie kinetyki angiogenezy. US jest szeroko stosowaną metodą obrazowania, która ma wysoką rozdzielczość przestrzenną do obrazowania naczyń krwionośnych po dożylnym wstrzyknięciu (iv) mikropęcherzyków, które pozostają wyłącznie w przedziale naczyniowym8-11. Mikropęcherzyki to mikropęcherzyki wypełnione gazem, które po wzbudzeniu impulsem amerykańskim wytwarzają silny sygnał echogeniczny, a tym samym służą jako dobry środek kontrastowy. Obrazy 3D wtyczki są uzyskiwane za pomocą amerykańskiego oprogramowania systemu obrazowania po zniszczeniu mikropęcherzyków. Powstałe obrazy składają się z klatek obrazu przed i po zniszczeniu mikropęcherzyków i odzwierciedlają różnicę w intensywności wideo w kolorze. Te nałożone obrazy są automatycznie wyświetlane przez oprogramowanie. W związku z tym można określić ilościowo procent funkcjonalnych naczyń w korku. Endomikroskopia konfokalna z włóknami o wysokiej rozdzielczości służy jako uzupełniająca metoda obrazowania, informując o morfologii naczyń krwionośnych. W tej minimalnie inwazyjnej metodzie obrazy są uzyskiwane po dożylnym podaniu dekstranu12 sprzężonego z FITC. Polimer fluorescencyjny barwi krwioobieg i w ten sposób służy jako "środek kontrastowy" dla morfologii naczyń krwionośnych i przepływu krwi. Co więcej, ponieważ wstrzyknięty polimer ma wielkość 70 KDa, może przenikać tylko przez nieszczelne naczynia, jak w unaczynieniu guza. Spowoduje to wysokie tło od dekstranu znakowanego FITC na zewnątrz naczyń krwionośnych. W związku z tym włóknista endomikroskopia konfokalna może być stosowana do wizualizacji typowych cech efektu EPR w neowaskulaturze guza - powiększone, nieszczelne, silnie splątane naczynia z końcami.

Ten model systemu został opisany w porównaniu potencjału angiogennego ludzkiego glejaka U-87 MG i jego uśpionego klona13. Unaczynienie w obrębie zatyczek oceniano trzy tygodnie po inokulacji żelu naśladującego ECM. Wykazano, że unaczynienie w obrębie czopów zawierających CM z szybko rosnących komórek tworzących nowotwór U-87 MG było znacznie zwiększone pod względem liczby, gęstości i funkcjonalności, w porównaniu z unaczynieniem w obrębie czopów zawierających CM z uśpionych komórek tworzących nowotwór. W związku z tym autorzy byli w stanie stwierdzić, że CM wyizolowany z szybko rosnących komórek tworzących nowotwór U-87 MG zawiera wyższy poziom czynników pro-angiogennych w porównaniu z CM z uśpionych komórek tworzących nowotwór. Czynniki te stymulują tworzenie funkcjonalnych naczyń krwionośnych, wpływając pozytywnie na wszystkie etapy kaskady angiogennej (tj. proliferację, kiełkowanie, migrację i wreszcie tworzenie kanalikowatych struktur komórek śródbłonka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie ze standardami Tel Aviv University Sackler School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Kondycjonowane przygotowanie podłoża

  1. Wysiew 2 x 106 komórek U-87 MG na 10 cm płytce hodowlanej w objętości 8 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem ołówka/streptomycyny/nystatyny.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C; 5 % CO2 aż do osiągnięcia pełnej konfluencji po 48 godzinach.
  3. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml pobrać całe podłoże z płytki i przefiltrować przez filtr 0,45 μm do probówki o pojemności 15 ml.
  4. Nie myjąc płytki komórkowej, dodać 1 ml roztworu trypsyny (0,25%) i inkubować.
  5. Gdy wszystkie komórki zostaną odłączone, dezaktywuj trypsynę za pomocą co najmniej 5 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS i wstępnie uformuj liczbę komórek.
  6. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek i oblicz liczbę komórek zgodnie z zastosowaną metodą liczenia.
    UWAGA: Będzie stosowany później w celu normalizacji stężenia CM.
  7. Przenieść CM do szklanej kolby okrągłodennej i zagęścić pod obrotową wyparką wysokopróżniową. Aby przyspieszyć ten proces, w razie potrzeby zwiększ temperaturę kąpieli do 37 °C. Kontynuuj, aż CM uzyska konsystencję przypominającą pastę.
  8. Zawiesić CM z każdej płytki hodowlanej w 400 μl soli fizjologicznej. W przypadku korzystania z więcej niż jednej płytki należy użyć równoważnej objętości. Na przykład w przypadku 2 płytek hodowlanych użyj 800 μl. Użyj każdej płytki dla 4 myszy.
  9. Aby porównać różne linie komórkowe lub zabiegi, dostosuj objętość zgodnie ze stosunkiem komórek otrzymanym w kroku 1.6. Na przykład, jeśli jedna płytka zawiera 1,5 raza więcej komórek, dodaj 200 μl soli fizjologicznej do istniejących wcześniej 400 μl. Będzie to skorygowany CM.

2. Inokulacja wtyczką żelową naśladującą ECM u myszy

  1. Przed zaszczepieniem myszom żelu naśladującego ECM należy przygotować następujące materiały:
    1. Czynniki wzrostu zredukowały bezfenolowy żel naśladujący ECM (rozmrozić przez noc, dzień przed eksperymentem, w temperaturze 4 °C na lodzie).
    2. Golarka elektryczna.
    3. Ketamina i ksylazyna w celu znieczulenia myszy.
    4. Lodowate sterylne końcówki o pojemności 1 000 μl.
    5. Lodowata strzykawka 1 ml i igły 27 G.
  2. Przygotuj dla każdej myszy probówkę Eppendorfa o pojemności 1,5 ml zawierającą 80 μl wyregulowanego CM i trzymaj na lodzie.
  3. Do każdej probówki dodać 600 μl lodowatego żelu naśladującego ECM, o obniżonej liczbie lodowatych czynników wzrostu, o obniżonej zawartości fenolu, który rozmrażano przez noc w temperaturze 4 °C na lodzie. Żel naśladujący ECM jest płynny w temperaturze 4 °C i krzepnie w temperaturze ciała; Aby zapobiec zestaleniu się żelu ECM-mimic, należy użyć lodowatych końcówek o pojemności 1 000 μl. Ostrożnie wymieszaj probówki, nie tworząc bąbelków i trzymaj na lodzie.
  4. Znieczulenie 6-tygodniowych myszy BALB/c za pomocą ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (12 mg/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie zgodnie z instytucjonalną komisją ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, tj. przed rozpoczęciem eksperymentu. Zwierzęta osiągnęły właściwy poziom znieczulenia, gdy nie reagują już na mocne szczypanie palca u nogi.
  5. Ogolić okolice brzucha myszy i zdezynfekować za pomocą chirurgicznego peelingu/alkoholu.
  6. Za pomocą zimnej strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27 G należy wstrzyknąć podskórnie zawartość rurki Eppendorfa. Wstrzyknięcie należy wykonywać bardzo powoli, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Po podaniu całej objętości nie należy wysuwać igły przez kilka minut, aż do zastygnięcia.

3. Ocena unaczynienia zatyczki żelowej naśladującej ECM za pomocą ultradźwięków

UWAGA: Ta część protokołu wymaga wcześniejszej wiedzy na temat obsługi systemu obrazowania ultrasonograficznego lub pomocy autoryzowanego technika.

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące materiały i instrumenty:
    1. Golarka elektryczna.
    2. Krem do depilacji.
    3. Ketamina i ksylazyna w celu znieczulenia myszy.
    4. Mikropęcherzyki niedocelowe.
    5. Urządzenie aktywacyjne.
    6. Amerykański system obrazowania, w tym sonda 55 MHz 708 i mikromanipulator akwizycji 3D.
  2. Zmierz unaczynienie w obrębie zatyczek trzy tygodnie po inokulacji:
    UWAGA: W modelu zwierzęcym opartym na MG U-87 stwierdzono, że 3 tygodnie stanowią idealny punkt czasowy do obrazowania. W różnych ustawieniach skalibruj kinetykę unaczynienia, zaczynając od kilku dni po zaszczepieniu czopów.
    1. Znieczulenie myszy za pomocą ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (12 mg/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie zgodnie z instytucjonalną komisją ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, tj. przed rozpoczęciem eksperymentu. Zwierzęta osiągnęły właściwy poziom znieczulenia, gdy nie reagują już na mocne szczypanie palca u nogi.
    2. Ogol okolice brzucha myszy i potraktuj kremem do depilacji.
    3. Zamocuj myszy na wznak na stoliku mikromanipulatora.
    4. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej sól fizjologiczną i igły 30 G umieścić igłę w żyle ogonowej, mocno zamocować igłę i poluzować strzykawkę.
    5. Konfiguracja sesji akwizycji obrazu w trybie kontrastu 3D:
      1. Naciśnij "3D", aby zainicjować stopień motoryczny 3D i umieść przetwornik na środku żądanego obszaru skanowania.
      2. Naciśnij "3D" i wprowadź odległość skanowania i rozmiar kroku, a następnie naciśnij "Skanuj".
      3. Upewnij się, że cała wtyczka została zeskanowana w wyświetlonych danych obrazu 3D. Jeśli nie, wyreguluj przetwornik tak, aby cała wtyczka była widoczna na skanie i powtórz krok 3.5.2.
      4. Naciśnij "Kontrast" i przesuń elementy sterujące kompensacją wzmocnienia czasowego (TGC) w lewo, aby przyciemnić obraz.
    6. Aktywować mikropęcherzyki za pomocą mieszadła do fiolek, który jest przeznaczony do aktywacji mikropęcherzyków na 45 sekund.
    7. Wymieszać w strzykawce o pojemności 1 ml 50 μl mikropęcherzyków z 50 μl soli fizjologicznej.
    8. Wymienić poluzowaną strzykawkę zawierającą sól fizjologiczną na strzykawkę zawierającą aktywowane mikropęcherzyki. Wstrzyknij rozcieńczone mikropęcherzyki do żyły ogonowej myszy, odczekaj kilka sekund, aż pęcherzyki osiągną stan ustalony, a następnie uzyskaj pętlę cine wtyczki ze wzmocnionym kontrastem 3D, używając silnika akwizycji 3D:
      1. Naciśnij "3D" i wybierz "Skanuj", aby uzyskać obrazy 3D ze wzmocnionym kontrastem, a następnie naciśnij "Cine Store", aby zapisać dane obrazu.
      2. Naciśnij "3D" i kliknij "Zniszcz 3D", aby zniszczyć mikropęcherzyki.
      3. Naciśnij ponownie "3D" i wybierz "Skanuj", aby uzyskać pętlę filmową po zniszczeniu, a następnie naciśnij "Cine Store".
    9. Wygeneruj ramki obrazu nakładki przed i po zniszczeniu mikropęcherzyków:
      1. W "Ustawieniach referencji" po lewej stronie ekranu kliknij "Utwórz odniesienie".
      2. Naciśnij "Zarządzanie badaniem", aby otworzyć nabytą pętlę cine przed zniszczeniem.
      3. Kliknij "Przetwarzaj film", aby wygenerować zieloną nakładkę kontrastu, a następnie kliknij "Załaduj do 3D".
    10. Użyj amerykańskiego oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo wynikowy obraz 3D dla objętości krwi w zatyczkach:
      1. Naciśnij "Skanuj/Zamroź", a następnie naciśnij "Ustawienia trybu".
      2. Kliknij "Głośność" i wybierz "Równolegle".
      3. Utwórz objętość 3D tkanki docelowej, dzieląc serię konturów.
      4. Kliknij "Zakończ", aby zakończyć segmentację.
        UWAGA: Objętość środka kontrastowego zostanie wyświetlona w lewym dolnym rogu ekranu.
    11. Pod koniec zabiegu umieść myszy w ciepłym, czystym, suchym i cichym miejscu, z dala od innych zwierząt. Zapewnij ciepło za pomocą dostępnej w handlu chirurgicznej poduszki grzewczej lub żarówki (50-75 W), umieszczonej w odległości 12-14 cali od gryzonia. Monitoruj myszy w sposób ciągły, aż utrzymasz wyprostowaną postawę i będziesz normalnie chodzić.

4. Ocena morfologii naczyń krwionośnych czopa żelowego naśladującego ECM za pomocą endomikroskopii konfokalnej z włókna

UWAGA: ta część protokołu jest wykonywana bezpośrednio po obrazowaniu w USA i wymaga wcześniejszej wiedzy na temat obsługi systemu obrazowania endomikroskopii konfokalnej z włóknami lub pomocy autoryzowanego technika.

  1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące materiały i instrumenty:
    1. Narzędzia chirurgiczne, takie jak kleszcze, nożyczki i wchłanialne nici do szycia.
    2. Dekstran sprzężony z FITC (70 KDa).
    3. Roztwory kalibracyjne (trzy probówki zawierające nadtlenek wodoru, wodę lub roztwór fluorescencyjny).
    4. System obrazowania i sonda odpowiednie do obrazowania naczyń krwionośnych według producenta.
  2. Znieczulenie myszy za pomocą ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (12 mg/kg).
  3. Podawać dożylnie przez żyłę ogonową 200 μl 10 mg/ml dekstradu znakowanego FITC.
  4. Zdezynfekuj okolice brzucha za pomocą peelingu chirurgicznego/alkoholu i wykonaj małe nacięcie w odległości około 1 cm od zatyczki.
  5. Delikatnie umieść sondę endomikroskopową na wtyczce, utrzymując wtyczkę w stanie nienaruszonym.
  6. nabycie:
    1. Po umieszczeniu sondy na wtyczce naciśnij "Start laser" za pomocą pedału nożnego. Fluorescencja powinna być pokazana na ekranie.
    2. Nagrywaj krótkie filmy (do 30 sekund), naciskając przycisk "Nagrywaj" na ekranie lub "Wybierz" za pomocą pedału nożnego.
    3. Pomiędzy filmami umyj sondę, umieszczając końcówkę w rurce zawierającej wodę.
    4. Po zakończeniu wyjmij sondę i wyczyść końcówkę bawełnianą końcówką.
  7. Aby przeanalizować średnią średnicę naczynia:
    1. Kliknij ikonę "Wykryj mikronaczynia" w górnym panelu, aby otworzyć okno modułu wykrywania naczyń.
    2. Kliknij "Preferencje" i zaznacz "Średnia średnica naczynia" w "Interesującej nas statystyce" i "Wyświetl paski histogramu" w "Trybie wyświetlania".
    3. Kliknij "Wykryj", aby wyświetlić wybrane pomiary.
  8. Aby przeanalizować natężenie sygnału fluorescencyjnego w obszarach przylegających do naczyń krwionośnych:
    1. Kliknij "Utwórz okrąg ROI" w lewym panelu i utwórz okrąg w obszarze zainteresowania.
    2. Kliknij "Oblicz histogram w ramach ROI", aby obliczyć wartości związane z tym regionem.

5. Leczenie pozabiegowe myszy

  1. Pod koniec każdej procedury obrazowania umieść myszy w ciepłym, czystym, suchym i cichym miejscu, z dala od innych zwierząt. Zapewnij ciepło za pomocą dostępnej w handlu chirurgicznej poduszki grzewczej lub żarówki (50-75 W), umieszczonej w odległości 12-14 cali od gryzonia. Monitoruj myszy w sposób ciągły, aż utrzymasz wyprostowaną postawę i będziesz normalnie chodzić.  
  2. W celu dalszej analizy unaczynienia czopów w dodatkowych punktach czasowych należy zastosować następujące warunki odzyskiwania:
    1. Zszyj małe nacięcie za pomocą szwów wchłanialnych.
    2. Podaj myszom środek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (1 mg/kg) podskórnie i wróć do indywidualnych klatek.
    3. Obserwuj wszystkie zwierzęta, aby ustalić, czy konieczne jest dalsze leczenie przeciwbólowe i codziennie dokonuj ponownej oceny, aby monitorować i oceniać stres.
  3. Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji, najpierw stosując izofluran, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Jeśli dodatkowe obrazowanie zostanie wykonane w ciągu kilku tygodni po początkowych etapach obrazowania, wszystkie procedury powinny być utrzymywane w jak najbardziej sterylnym stanie. Należy wykonać chirurgiczny peeling skóry, do czyszczenia sondy endomikroskopowej należy użyć sterylnej wody i sterylnych bawełnianych końcówek, a sondę należy zdezynfekować między każdym zwierzęciem przy użyciu sterylnej wody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszczepienie naśladujących ECM zatyczek żelowych z CM z szybko rosnącej angiogennej linii komórkowej U-87 MG generującej angiogenne nowotwory, powoduje rozległą angiogenezę. To unaczynienie można szeroko badać przy użyciu dwóch uzupełniających się metod obrazowania.

Obrazowanie US z kontrastowym wzmocnieniem mikropęcherzyków ujawnia rozległą rekrutację funkcjonalnych naczyń krwionośnych do czopa, ilustrując rozległy przepływ krwi w czopach U-87 MG C.M., w przeciwieństwie do niewykrywalnego prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie uzupełniających się metod obrazowania pozwala na uzyskanie informacji na temat gęstości, funkcjonalności i morfologii mikronaczyń różnych komponentów angiogenezy. Ładowanie CM na zatyczki żelowe naśladujące ECM generuje mikrośrodowisko guza, które jest oddzielane od innych populacji komórek, takich jak komórki śródbłonka, które są rekrutowane i wynaczyniane do czopa.

Wykonując równolegle obrazowanie USG z mikropęcherzykami ze wzmocnieniem kontrastowym i obrazowanie endomikroskopii k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium badawcze Satchi-Fainaro jest częściowo wspierane przez Stowarzyszenie Międzynarodowych Badań nad Rakiem (AICR), Fundację Niemiecko-Izraelską (GIF), IZRAELSKĄ FUNDACJĘ NAUKOWĄ (Grant nr 1309/10), Swiss Bridge Award, oraz przez granty z Izraelskiej Narodowej Inicjatywy Nanotechnologicznej (INNI), programu Focal Technology Area (FTA): Nanomedycyna dla Spersonalizowanej Teranostyki, oraz przez The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obrotowa wyparka próżniowa---
Czynniki wzrostu zredukowane bez fenolu MatrigelBD BioscienceFAL356231Rozmrozić przez noc, w temperaturze 4 & stopni; C na lodzie
Krem do depilacji---
Vevo2100 US system obrazowaniaVisualSonics Inc.-Wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu obsługi lub pomocy autoryzowanego technika
Sonda 55 MHz 708VisualSonics, Inc.--
Oprogramowanie do obrazowania Vevo2100VisualSonics Inc.-
-VialMixDEFINITY ImagingVMIX-DEFINITY
mikropęcherzykiDEFINITY ImagingDE4Aktywuj na 45 sekund za pomocą VialMix przed użyciem
CellVizio (Fibered confocal endomikroskop)Mauna Kea Technologies-Wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu obsługi lub pomocy autoryzowanego technika
Sonda ProFlex MiniO/30Mauna Kea Technologie--
70 kD dekstran znakowany FITCSigma-Aldrich46945-Oprogramowanie
ImageCellMauna Kea Technologies--
Zestaw kalibracyjnyMauna Kea Technologies-
-Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Gibco Life Tecchnologies41965-039
Surowica bydlęca płodu (FBS)Biological Industries04-007-1A
Roztwór penicyliny/streptomycyny/nystatynyPrzemysł biologiczny03-032-1B

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
  2. Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
  3. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
  4. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
  5. Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
  6. Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
  7. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
  8. Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
  9. Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
  10. Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
  11. Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
  12. Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test z u yciem zatyczek z Matrigeluobrazowanie ultrad wi kowew knista endoskopia konfokalnakontrast mikrop cherzykowypo ywka kondycjonowanapotencja angiogennyg sto naczy krwiono nychanaliza morfologii naczyczynniki wydzielane przez guzobrazowanie przy yciowe

Powiązane artykuły