Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podskórny test czopów matrygelowych u myszy jest metodą z wyboru do oceny in vivo czynników pro- i antyangiogennych. W tej metodzie pożądane czynniki są wprowadzane do zimno-płynnego żelu naśladującego ECM, który po wstrzyknięciu podskórnym krzepnie, tworząc środowisko naśladujące środowisko nowotworowe. Macierz ta umożliwia przenikanie do komórek gospodarza, takich jak komórki śródbłonka, a tym samym tworzenie naczyń krwionośnych.
Tutaj proponujemy nowy zmodyfikowany test czopów matrigelowych, który może być wykorzystany do zilustrowania potencjału angiogennego puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe, w przeciwieństwie do konkretnego czynnika (np. bFGF i VEGF) lub czynnika. Zatyczka zawierająca żel naśladujący ECM jest wykorzystywana do wprowadzenia gospodarza (tj. Myszy) z pulą czynników wydzielanych do CM szybko rosnących komórek glejaka wytwarzającego nowotwór. Wcześniej opisaliśmy obszerne porównanie potencjału angiogennego ludzkiego glejaka wielopostaciowego U-87 MG i jego uśpionego klonu, w tym modelu systemu, wykazując indukowaną angiogenezę w komórkach rodzicielskich U-87 MG. CM przygotowuje się przez filtrowanie zebranych pożywek z nakładających się płytek do hodowli tkankowych dowolnej linii komórkowej po 48-godzinnej inkubacji. W związku z tym zawiera tylko czynniki wydzielane przez komórki, bez samych komórek. Opisano tutaj połączenie dwóch modalności obrazowania, obrazowania ultrasonograficznego z mikropęcherzykami ze wzmocnieniem kontrastowym i endomikroskopii konfokalnej przyżyciowej, w celu dokładnej charakterystyki w czasie rzeczywistym zakresu, morfologii i funkcjonalności nowo powstałych naczyń krwionośnych w obrębie czopów.
Wprowadzenie
Test angiogenezy z korkiem matrigelowym został po raz pierwszy opisany przez Kibbeya i wsp. w 1992 roku, gdzie został użyty do oceny stymulacji angiogenezy przez peptyd SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val)1. W przeciwieństwie do innych testów angiogenezy in vivo, takich jak angiogeneza rogówki myszy lub testy błony omoczniowej kosmówki piskląt, ten test jest stosunkowo łatwy do wykonania2. Wstrzykiwany żel naśladujący ECM może zawierać komórki, związki i/lub czynniki proangiogenne lub antyangiogenne. Oceniając aktywność związku antyangiogennego, czop zwykle zawiera mieszaninę czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i czynnik....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie ze standardami Tel Aviv University Sackler School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Kondycjonowane przygotowanie podłoża
- Wysiew 2 x 106 komórek U-87 MG na 10 cm płytce hodowlanej w objętości 8 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem ołówka/streptomycyny/nystatyny.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C; 5 % CO2 aż do osiągnięcia pełnej konfluencji po 48 godzinach.
- Za pomocą strz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Implantacja wtyczek z żelu naśladującego ECM z C.M. z szybko rosnącej, angiogennej linii komórkowej generującej guzy U-87 MG prowadzi do rozległej angiogenezy. Układ naczyniowy ten można szczegółowo zbadać, stosując dwie komplementarne metody obrazowania.
Obrazowanie US z kontrastem w postaci mikropęcherzyków ujawnia rozległą rekrutację funkcjonalnych naczyń krwionośnych do zatyczki, obrazując intensywny przepływ krwi w zatyczkach obciążonych C.M. z linii U-87 MG, w przeciwieństwie do niewykry.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Połączenie uzupełniających się metod obrazowania pozwala na uzyskanie informacji na temat gęstości, funkcjonalności i morfologii mikronaczyń różnych komponentów angiogenezy. Ładowanie CM na zatyczki żelowe naśladujące ECM generuje mikrośrodowisko guza, które jest oddzielane od innych populacji komórek, takich jak komórki śródbłonka, które są rekrutowane i wynaczyniane do czopa.
Wykonując równolegle obrazowanie USG z mikropęcherzykami ze wzmocnieniem kontrastowym i obrazowanie endomikroskopii k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Laboratorium badawcze Satchi-Fainaro jest częściowo wspierane przez Stowarzyszenie Międzynarodowych Badań nad Rakiem (AICR), Fundację Niemiecko-Izraelską (GIF), IZRAELSKĄ FUNDACJĘ NAUKOWĄ (Grant nr 1309/10), Swiss Bridge Award, oraz przez granty z Izraelskiej Narodowej Inicjatywy Nanotechnologicznej (INNI), programu Focal Technology Area (FTA): Nanomedycyna dla Spersonalizowanej Teranostyki, oraz przez The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Obrotowa wyparka próżniowa | - | -- | |
| Czynniki wzrostu zredukowane bez fenolu Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Rozmrozić przez noc, w temperaturze 4 & stopni; C na lodzie |
| Krem do depilacji | - | -- | |
| Vevo2100 US system obrazowania | VisualSonics Inc. | - | Wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu obsługi lub pomocy autoryzowanego technika |
| Sonda 55 MHz 708 | VisualSonics, Inc. | - | - |
| Oprogramowanie do obrazowania Vevo2100 | VisualSonics Inc. | - | |
| -VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX-DEFINITY | |
| mikropęcherzyki | DEFINITY Imaging | DE4 | Aktywuj na 45 sekund za pomocą VialMix przed użyciem |
| CellVizio (Fibered confocal endomikroskop) | Mauna Kea Technologies | - | Wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu obsługi lub pomocy autoryzowanego technika |
| Sonda ProFlex MiniO/30 | Mauna Kea Technologie | - | - |
| 70 kD dekstran znakowany FITC | Sigma-Aldrich | 46945-Oprogramowanie | |
| ImageCell | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Zestaw kalibracyjny | Mauna Kea Technologies | - | |
| -Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Roztwór penicyliny/streptomycyny/nystatyny | Przemysł biologiczny | 03-032-1B |
Bibliografia
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
