Artykuł metodologiczny

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

DOI:

10.3791/51528

⸱

14 sierpnia 2014

 ,  , 
1Department of Biology, College of William & Mary

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przeprowadzone na zarodkach i larwach Drosophila melanogaster dostarczają kluczowych informacji na temat procesów rozwojowych, takich jak specyfikacja losu komórki i organogeneza. Barwienie immunologiczne pozwala na wizualizację rozwijających się tkanek i narządów. Jednak ochronny naskórek, który tworzy się pod koniec embriogenezy, zapobiega przenikaniu przeciwciał do późnych zarodków i larw. Podczas gdy sekcja przed barwieniem immunologicznym jest regularnie stosowana do analizy tkanek larwalnych Drosophila, okazuje się nieskuteczna w przypadku niektórych analiz, ponieważ małe tkanki mogą być trudne do zlokalizowania i wyizolowania. Sonikacja stanowi alternatywę dla sekcji w protokołach barwienia immunologicznego larw Drosophila. Pozwala na szybkie, jednoczesne przetwarzanie dużej liczby zarodków i larw w późnym stadium rozwoju oraz utrzymuje morfologię in situ. Po utrwaleniu w formaldehydzie próbka jest poddawana sonikacji. Próbka jest następnie poddawana barwieniu immunologicznemu za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych specyficznych dla antygenu i fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał drugorzędowych w celu wizualizacji docelowych typów komórek i specyficznych białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Podczas procesu sonikacji kluczowe znaczenie ma właściwe umieszczenie sondy sonizacyjnej nad próbką, a także czas trwania i intensywność sonikacji. W przypadku barwienia wysokiej jakości mogą być wymagane dodatkowe drobne modyfikacje standardowych protokołów barwienia immunologicznego. W przypadku przeciwciał o niskim stosunku sygnału do szumu zwykle konieczne są dłuższe czasy inkubacji. Jako dowód słuszności koncepcji tego protokołu wspomaganego sonikacją, pokazujemy barwienia immunologiczne trzech typów tkanek (jąder, jajników i tkanek nerwowych) na różnych etapach rozwoju.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki i larwy Drosophila stanowią doskonały model do badania procesów rozwojowych w wielu narządach i tkankach. Obrazowanie pojedynczych komórek jest często konieczne w tych badaniach w celu ustalenia złożonych środowisk, w których rozwijają się komórki. Wizualizację komórek w tkankach można osiągnąć za pomocą barwienia immunologicznego. Istnieją dobrze opisane protokoły barwienia immunologicznego dla embrionalnych tkanek Drosophila <17 godzin po złożeniu jaj (AEL)1-3. Jednak pod koniec embriogenezy tworzy się ochronny naskórek, uniemożliwiając skuteczne przenikanie przeciwciał. W związku z tym te protokoły barwienia immunologicznego są nieskuteczne w analizie tkanek w późnych stadiach rozwoju zarodków i w kolejnych stadiach rozwoju larwalnego (1. stadium (L1), 2. stadium (L2) i 3. stadium (L3)). Ta nieefektywność stanowi barierę dla naszego zrozumienia dynamicznych procesów, które zachodzą podczas tego wydłużonego okresu rozwojowego 4. Sekcja tkanek jest szeroko stosowaną techniką obchodzenia tej bariery 5-7. Jednak sekcja może okazać się nieefektywna. Ekstrakcja może być utrudniona ze względu na trudności w zlokalizowaniu lub wyizolowaniu tkanek zarodkowych i larwalnych. Ponadto fizyczne usunięcie tkanek docelowych może spowodować uszkodzenie poprzez ich rozerwanie lub niemożność wydobycia ich w całości.

Sonikacja to metoda, która wykorzystuje fale dźwiękowe do zakłócania oddziaływań międzycząsteczkowych. Stosuje się go w celu zakłócenia integralności naskórka larwalnego Drosophila w celu immunobarwienia rozwijających się komórek nerwowych typu 6. Protokół ten został dostosowany do barwienia immunologicznego gonad embrionalnych i larwalnych w późnym stadium, które mogą mieć nawet 50 μm średnicy 8-10. Dzięki takim badaniom scharakteryzowano proces tworzenia się niszy męskich komórek macierzystych linii rozrodczej (GSC) w późnym stadium rozwoju zarodków Drosophila 8-10, a mechanizmy regulujące rozwój i różnicowanie komórek macierzystych w późnym stadium zarodków i larw 9-12. W ten sposób sonikacja stanowi skuteczną alternatywę dla rozwarstwienia tkanek, które może być trudne ze względu na rozmiar tkanki. Ponadto umożliwia barwienie immunologiczne tkanek Drosophila in situ, pozostawiając komórki w kontekście całego organizmu i zachowując morfologię in situ. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół fluorescencyjnego barwienia immunologicznego tkanek w późnym stadium zarodkowym przez wczesne/środkowe L3 in situ. Analiza gonad Drosophila i tkanki nerwowej jest pokazana w reprezentatywnych wynikach w celu wykazania skuteczności tego protokołu. Co więcej, ten protokół barwienia immunologicznego może być dostosowany do analizy innych tkanek Drosophila, a także tkanek innych organizmów z zewnętrznym naskórkiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie klatki na zbiórkę

  1. Znieczulenie młodych, płodnych much za pomocą CO2 . Przenieś znieczulone muchy do klatki. Aby uzyskać optymalny plon, użyj 100-120 dorosłych much w wieku od 2 do 7 dni w stosunku 4:1 samic do samców. Pozwól muchom na odpowiedni okres aklimatyzacji, ~ 24 godziny przed pobraniem próbki do utrwalenia. Jeśli klatka została założona z dziewiczymi samicami krytymi samcami, należy zastosować 36-48-godzinny okres aklimatyzacji.
  2. Na otwartym końcu klatki umieść wstępnie przygotowany talerz agarowy z sokiem jabłkowym z kroplą pasty drożdżowej wielkości dziesięciocentówki pośrodku nad otworem klatki. Następnie zabezpiecz taśmą. Uszczelnij połączenie między płytką agarową z sokiem jabłkowym a klatką za pomocą Parafilm.
  3. Umieść klatkę w dodatkowym pojemniku z płytką agarową z sokiem jabłkowym jako podstawą i pozwól muchom rozmnażać się w określonej temperaturze przez odpowiedni okres czasu, jak określono w doświadczeniu.
    Uwaga: Czasy pobierania próbek będą się różnić. Na przykład, podczas pobierania zarodków w późnym stadium rozwoju/wczesnych larw L1 (17–24 godziny), należy pozwolić muszkom na złożenie jaj na płytkach agarowych z sokiem jabłkowym przez 7 godzin w temperaturze 25 °C, a następnie poddać próbce starzenie się przez 17 godzin w temperaturze 25 °C. Podobnie w przypadku zbioru larw pierwszego stadium rozwojowego w średnim okresie (36–48 godzin) należy pozwolić muchom na składanie jaj przez 12 godzin w temperaturze 25 °C przed leżakowaniem próbki przez 36 godzin w temperaturze 25 °C.
  4. Po upływie tego czasu postukaj klatką o stół, aby muchy spadły z talerza z sokiem jabłkowym bez znieczulenia. Szybko wymień zużyty talerz na świeży zawierający kroplę pasty drożdżowej. Zabezpiecz świeżą płytkę taśmą i parafolią i przechowuj klatkę z płytą agarową z sokiem jabłkowym jako podstawą.
  5. Ostrożnie usuń kroplę drożdży z używanej płytki metalową szpatułką. Przykryj pokrywką talerz z zużytym sokiem jabłkowym i pozwól złożonym zarodkom dożakować do starzenia się, jeśli jest to konieczne eksperymentalnie.
    Uwaga: Podczas starzenia próbek płytki mogą być przechowywane w temperaturze 25 °C, chyba że doświadczalnie wymagane są wyższe temperatury. Przykłady starzenia zarodków do pobrania opisano powyżej (patrz uwaga do kroku 1.3). Usuwanie pasty drożdżowej przed starzeniem próbki jest wykonywane, aby zapobiec wpełzaniu larw do drożdży i rozbijaniu agaru pod spodem. Pozostały sok jabłkowy, agar i pozostałości pasty drożdżowej dostarczają składników odżywczych dla wzrostu larw. Podczas gdy zarodki złożone bezpośrednio w paście drożdżowej są tracone w wyniku usunięcia pasty drożdżowej, utrata ta jest lepsza niż pozostałości drożdży i agaru w próbce, co może zmniejszyć wydajność barwienia. W przypadku nieusuwania pasty drożdżowej, drożdże można upłynnić za pomocą buforu fosforanowego Triton X-100 (PBTx), zmieszać pędzlem, a następnie usunąć z próbki za pomocą sitka do komórek przed utrwaleniem.

2. Fiksacja

  1. Gdy zarodki ułożone na płytce agarowej z sokiem jabłkowym osiągną wiek dojrzały, użyj małego pędzla zwilżonego roztworem buforu fosforanowego Triton X-100 (PBTx), aby ostrożnie usunąć próbkę z płytki.
    Uwaga: Starsze larwy są ruchome i mogą pełzać po wewnętrznej stronie pokrywy. Próbkę tę można pobrać w podobny sposób, usuwając ją pędzlem.
  2. Przetrzyj pędzel z próbką o skierowany do wewnątrz grzbiet sitka do komórek. Następnie spłucz ścianki sitka i pędzel butelką ze spryskiwaczem zawierającą roztwór PBTx. Umieść pokrywę szalki Petriego pod sitkiem, aby uchwycić roztwór PBTx.
  3. Po przeniesieniu całej próbki do sitka wlej do sitka tyle PBTx, aby podnieść próbkę z siatki. Następnie podnieś sitko i wlej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.
  4. Powtórzyć krok 2.3 trzy razy, aby usunąć odpadki drożdży i much, które mogły zostać przeniesione wraz z próbką.
  5. Wlej wystarczającą ilość 50% roztworu wybielacza (NaOCl)/wody (ddH2O) do sitka, aby podnieść larwy z siatki. Pozostaw larwy w roztworze na 5 minut. Następnie podnieś sitko i wylej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.
    Uwaga: Wybielacz jest wymagany tylko w próbkach embrionalnych w wieku od 0 do 22 godzin w celu usunięcia błony kosmówkowej. Stosowanie wybielacza do starszych próbek można pominąć, ale jego włączenie nie jest szkodliwe. Jeśli pożądane jest pominięcie, zastąp wybielacz na tym etapie PBTx. Rozcieńczony wybielacz należy zużyć w ciągu 24 godzin od przygotowania roztworu.
  6. Przemyć próbkę w sitku za pomocą PBTx, wlewając do sitka tyle PBTx, aby podnieść próbkę z siatki. Pozostawić próbkę w roztworze na 3 minuty. Następnie podnieś sitko i wlej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.
  7. Powtórz krok 2.6 pięć razy.
  8. Osuszyć dno sitka do komórek, a następnie przenieść próbkę do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 1,75 ml roztworu PEMS za pomocą pędzla.
  9. Pracując w wentylowanym dygestorium, dodaj 250 μl 37% formaldehydu i 8 ml odczynnika heptanu do fiolki scyntylacyjnej.
    Uwaga: Formaldehyd i heptan są niebezpieczne. Ze względów bezpieczeństwa należy kontynuować pracę pod wentylowanym wyciągiem i nosić odpowiednie rękawice do czynności 2.9 – 3.3.
  10. Pozostawić fiolkę do wstrząsania z prędkością 200 obr./min lub podobną umiarkowaną prędkością przez 20 minut.
  11. Dodać 10 ml metanolu do fiolki scyntylacyjnej bez usuwania poprzedniej fazy wodnej i pozostawić fiolkę do energicznego wstrząsania z prędkością 500 obr./min przez 1 min.
    Uwaga: Metanol jest niebezpieczny. Kontynuuj pracę w wentylowanym dygestorium i noś odpowiednie rękawice.
  12. Wyjąć fiolkę z shakera i natychmiast wlać zawartość do sitka komórkowego nad pojemnikiem na odpady płynne w kapturze. Dodać dodatkową ilość metanolu do fiolki i w razie potrzeby przepuścić przez sitko do komórek, aby upewnić się, że cała próbka została usunięta.
    Uwaga: Sitka do komórek mogą powoli spływać. Aby temu zaradzić, należy przyłożyć tkankę laboratoryjną do dna sitka komórkowego, aby szybciej przeciągnąć roztwór przez sitko. Metanol, formaldehyd i heptan powinny być przechowywane w odpowiednich pojemnikach na odpady do czasu właściwej utylizacji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  13. Osuszyć dno sitka komórkowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej, a następnie za pomocą pędzla przenieść próbkę pobraną z sitka do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,5 ml metanolu.
    Uwaga: Jeśli używanych jest wiele fiolek scyntylacyjnych, należy wykonywać kroki 2.12 i 2.13 po jednej fiolce na raz, aby zapobiec wysychaniu próbki na sitkach do komórek.
  14. Po dodaniu próbki do probówki mikrowirówki usuń metanol za pomocą pipety. Upewnij się, że próbka osiadła na dnie probówki.
  15. Przepłukać próbkę w probówce do mikrowirówki, dodając do probówki około 0,5 ml metanolu. Poczekaj, aż próbka się uspokoi, a następnie usuń metanol za pomocą pipety.
  16. Powtórz krok 15 trzy razy.
  17. Dodaj 0,5 ml metanolu do probówki, a następnie przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

3. Rehydratacja i przygotowanie próbki do barwienia immunologicznego

  1. Usunąć metanol z probówki mikrowirówki za pomocą pipety, pozostawiając próbkę w probówce. Odpady metanolu należy przechowywać w odpowiednim pojemniku na odpady do czasu ich prawidłowej utylizacji.
    Uwaga: Aby zwiększyć skuteczność sonikacji, należy użyć nie więcej niż 3 mm próbki osadzonej na dnie probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Nadmiar próbki można przenieść do oddzielnej probówki za pomocą pipety przed rozpoczęciem powyższego etapu hydratacji. Aby zapobiec zatkaniu końcówki pipety za pomocą czystej żyletki, można przeciąć końcówkę pipety.
  2. Dodaj 1,0 ml 50% roztworu metanolu/buforu fosforanowego (PBTw) do probówki i miażdż przez 3 minuty.
  3. Usunąć roztwór metanolu do odpowiedniego pojemnika na odpady i dwukrotnie spłukać 1,0 μl PBTw. Po każdym płukaniu należy odczekać, aż próbka osiada, a następnie pobrać PBTw za pomocą pipety.
  4. Dodać 1,0 ml mieszanki albuminy bydlęcej i buforu fosforanowego (BBTw) do fiolki i rozdrabniać. Po 3 minutach na kołysce poczekaj, aż próbka się uspokoi i wyjmij BBTw za pomocą pipety.
  5. Powtórz krok 3.4 dwa razy, uważając, aby usunąć jak najwięcej BBTw bez utraty próbki po ostatnim praniu.
  6. Dodać 0,5 ml BBTw do probówki i umieścić probówkę na lodzie.

4. Sonikacja próbki

  1. Ustaw sonikator na maksymalną amplitudę 10% i wyznacz czas pracy 2 sekundy stałej sonikacji.
    Uwaga: Ustawienia te są specyficzne dla sonikatora wskazanego w Tabeli Materiałów i Sprzętu i mogą wymagać optymalizacji dla różnych sonikatorów.
  2. Przed sonikacją próbki należy oczyścić sondę sonikatora, umieszczając końcówkę sondy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej wodą dejonizowaną i uruchomić sonikator w celu wyczyszczenia sondy. Sucha sonda sonicyjna z tkanką laboratoryjną po uruchomieniu.
  3. Zanurz sondę w probówce mikrowirówki zawierającej próbkę tak, aby znajdowała się około 3 do 4 mm nad próbką i rozpocznij sonikację.
  4. Wyjmij probówkę do mikrowirówki i umieść ją na lodzie na co najmniej 30 sekund, aby rozproszyć ciepło z sonikacji i pozwolić, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrowirówki.
  5. W razie potrzeby powtórzyć kroki 4.3 i 4.4 w zależności od wieku przetwarzanej próbki.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalną objętość próbki sonikacji, zarodki młodsze niż 17 godzin nie wymagają sonikacji, ale te między 17 a 24 godzinami (stadium 17/wczesny L1) wymagają dwóch sonikacji. Larwy w wieku od 24 do 36 lat (wczesne/środkowe L1), 36 - 48 (średnie/późne L1), 48 - 60 (wczesne/średnie-L2), 60 - 72 (średnie/późne-L2), 72 - 84 (wczesne/średnie-L3), 84 - 96 - 96 (wczesne/średnie-L3) wymagają odpowiednio 5, 9, 11, 13, 15, 18 i 22 sonikacji. Zobacz dyskusję w celu dalszego opracowania na temat czasów sonikacji.
  6. Dwukrotnie spłukać 1,0 ml BBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się uspokoi, a następnie pobrać BBTw za pomocą pipety.
  7. Dodać 1,0 ml BBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 3 minutach na kołysce poczekaj, aż próbka się uspokoi i wyjmij BBTw za pomocą pipety.
  8. Powtórz krok 4.7 dwa razy.

5. Barwienie immunologiczne

  1. Zablokować próbkę, dodając 5% normalnej surowicy rozcieńczonej w BBTw do probówki mikrowirówkowej. Usuń blok po kołysaniu przez 1 godz.
    Uwaga: Należy użyć normalnej surowicy z gatunku, w którym wytwarzane są przeciwciała drugorzędowe.
  2. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do odpowiedniego stężenia roboczego w 5% normalnym roztworze surowicy/BBTw.
  3. Próbkę skały w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała O/N w temperaturze 4 °C lub przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (około 22 °C.
    Uwaga: Czas inkubacji przeciwciał i temperatury mogą się różnić. Inkubacja O/N w temperaturze 4 °C lub 3 godziny w temperaturze pokojowej jest zazwyczaj wystarczająca. Jednak dwudniowy okres inkubacji może poprawić jakość barwienia, szczególnie w przypadku starszych próbek lub gdy stosowane są przeciwciała pierwotne o niskim powinowactwie. Dłuższe inkubacje przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze 4 °C. Podobne względy należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu przeciwciał drugorzędowych (patrz ppkt 5.10).
  4. Pozwól, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrofuge. Pobrać przeciwciała pierwotne za pomocą pipety. W razie potrzeby zachowaj przeciwciała do ponownego użycia.
  5. Dwukrotnie spłukać 1,0 ml BBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się osadzi, a następnie pobrać BBTw za pomocą pipety.
  6. Dodać 1,0 ml BBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 3 minutach na wahaczu pozostawić próbkę do osiadania i usunąć BBTw za pomocą pipety.
  7. Powtórz krok 5.6 pięć razy.
  8. Zablokować próbkę, dodając 5% normalnego roztworu surowicy/BBTw do probówki mikrowirówkowej. Usuń blok po kołysaniu przez 30 minut do 1 godz.
    Uwaga: Ten dodatkowy etap blokowania nie jest wymagany, ale może poprawić jakość barwienia dla określonych przeciwciał.
  9. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe do odpowiedniego stężenia roboczego w 5% normalnym roztworze surowicy/BBTw.
  10. Owiń probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby zmniejszyć blaknięcie spowodowane ekspozycją na światło. Próbkę skalną w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 12–48 godzin w temperaturze 4 °C lub przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (około 22 °C).
  11. Pozwól, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrofuge. Pobrać przeciwciała wtórne za pomocą pipety.
  12. Dwukrotnie przepłukać 1,0 ml PBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się uspokoi, a następnie pobrać PBTw za pomocą pipety.
  13. Dodać 1,0 ml PBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 5 minutach na wahaczu poczekaj, aż próbka się uspokoi i usuń PBTw za pomocą pipety.
  14. Powtórz krok 5.13 trzy razy.
  15. OPCJONALNIE: Dodać DAPI rozcieńczony w stosunku 1:1 000 w PBTw. Próbkę skały zawinąć w folię aluminiową na 3 minuty, a następnie usunąć roztwór DAPI za pomocą pipety. Przepłukać pięć razy 1,0 ml PBTw, pozwalając próbce osiąść przed usunięciem PBTw za pomocą pipety.
  16. Dodać 80 - 100 μl roztworu 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO) do probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: Można zastąpić inny środek zapobiegający blaknięciu na bazie glicerolu.

6. Analiza

  1. Przed zamontowaniem próbki na szkiełkach należy dodać dodatkowe 5 - 10 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu DABCO/p-fenylenodiaminy (PPD) do probówki mikrowirówkowej.
    Uwaga: Próbkę można dodawać do slajdów bez sekcji. Objętość próbki dodanej do szkiełka zmienia się w zależności od rozmiaru szkiełka nakrywkowego. Podczas pipetowania próbki na szkiełko można odciąć końcówkę pipety za pomocą żyletki, aby zapobiec ścinaniu próbki. Często przydatne jest ułożenie próbki w rzędach w celu łatwej analizy. Dodanie PPD jako dodatkowego środka zapobiegającego blaknięciu może nie być wymagane, ale może zapobiec fotowybielaniu, jeśli próbki są przechowywane przez długi czas.
  2. Delikatnie umieść szkiełko pokrywy szklanej na próbce. Następnie zabezpiecz szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci.
  3. Widok zamontowanej próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować skuteczność barwienia immunologicznego opartego na sonikacji w analizie późnych tkanek embrionalnych i larwalnych in situ, zarodki i larwy dzikich typów zostały przetworzone pod kątem barwienia immunologicznego jąder, jajników i tkanki nerwowej. Próbki zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej i przedstawiono reprezentatywne wyniki (ryc. 1 i ryc. 2). Wyniki pokazują, że opisany protokół jest skuteczny w wizualizacji cech morfologicznych, a także pojedynczy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia metodę skutecznego barwienia immunologicznego docelowych tkanek embrionalnych i larwalnych Drosophila in situ, eliminując w ten sposób potrzebę sekcji. Zgodnie z wcześniejszymi protokołami barwienia wczesnych zarodków1,2,3, błona kosmówkowa jest usuwana przy użyciu 50% wybielacza (NaOCl). Próbki utrwala się w formaldehydzie i metanolu. Ponieważ naskórek larwy powoduje, że starsza próbka unosi się na wodzie, cała próbka jest następnie przepuszczana przez sitko komórkowe, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Ruth Lehman i Dorthei Godt, które uprzejmie dostarczyły przeciwciała Vasa i Traffic Jam. Chcielibyśmy podziękować Bloomington Stock Center na Uniwersytecie Indiana za utrzymanie dostarczonych zapasów oraz Developmental Studies Hybridoma Bank opracowany pod auspicjami NICHD i utrzymywany przez Uniwersytet Iowa. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Wawersik za rady i wsparcie. Praca ta została sfinansowana z Monroe Scholars Program Grant (dla AF i LB) oraz grantu NSF IOS0823151 (dla MW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabela 1: Odczynniki i
Bufor fosforanowy Triton X-100 (PBTx)Dla 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Sklep w RT.
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna 10X (PBS 10X)Dla 1 l w dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Dodaj składniki i wypełnij do odpowiedniej objętości. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Triton 10%Na 50 ml: 5 ml Tritonu, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Skała do wymieszania. Sklep w RT.
PEMS0,1 m Rury (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Sklep w RT.
RuryNa 400 ml 0,25 M roztworu (pH 6,9): 30,24 g Rury dH20 NaOH. Rozpuść rury w 300 ml dH2O, a następnie dostosuj do pH 6,9 za pomocą NaOH. Doprowadzić całkowitą objętość do 400 ml za pomocą dH2O i autoklawu. Sklep w RT.
Formaldehyd37% wagowo formaldehydu w metanolu. Przechowywać w RT. Mieszaninę odpadów formaldehydu, heptanu i metanolu należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w dygestoriach przed utylizacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
HeptanCAS 142-82-5n-heptan. Przechowywać w RT. Mieszaninę odpadów formaldehydu, heptanu i metanolu należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w dygestoriach przed utylizacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
MetanolCAS 67-56-1Przechowywać w RT. Przechowywać mieszaninę odpadów formaldehydu, heptanu i metanolu w szczelnie zamkniętym pojemniku w dygestorium przed utylizacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
Bufor fosforanowy Tween (PBTw)Do przygotowania 1 l: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filtr sterylizować po dodaniu wszystkich składników. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Tween 10%Na 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Skała do wymieszania. Sklep w RT.
Bufor albuminowo-fosforanowy surowicy bydlęcej Tween (BBTw)Aby przygotować 1 l: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodaj BSA, a następnie wysterylizuj za pomocą 0,2 μ m Jednostka filtra próżniowego. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Normalna surowica kozia (NGS)ackson ImmunoResearch Laboratories005-000-121Aby zrobić 10 ml: Normalna surowica kozia 10 ml ddH2O. Dodaj ddH2O do fiolki NGS i wysterylizuj za pomocą 0,2 μ m filtr syrninge. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan (DABCO)CAS: 281-57-9Aby przygotować 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g stałej DABCO, 3,5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml glicerolu. Do zlewki o pojemności 250 ml z mieszadłem dodać ddH2O, Tris HCl i DABCO. Wymieszaj, a następnie dodaj 6N HCl, 10 N NaOH i glicerol. Następnie dodawać kroplami 10N NaOH, aż roztwór osiągnie pH 7,5. Podwielokrotnej. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
p-fenylenodiaminy (PPD)1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Rozpuścić PPD w roztworze NaHCO3 i NaCO3. Dodaj 60 μ l roztworu PPD do 500 μ l z DABCO. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
z sokiem jabłkowymAby przygotować ~200 talerzy: 45 g agaru (CAS#9002-18-0), 45 g cukru pudru (kupionego w sklepie), 500 ml soku jabłkowego (kupionego w sklepie), 15 ml Tegosept 10%, 1,5 ml ddH2O. Dodaj agar do ddH2O w kolbie o pojemności 4 litrów, a następnie autoklaw przez 30 min. Wymieszaj sok jabłkowy i cukier na rozgrzanym talerzu. Stopniowo dodawaj mieszaninę soku jabłkowego do autoklawowanego agaru. Wymieszać na rozgrzanej płytce mieszającej, a następnie podzielić 10 ml objętości na szalki Petriego o średnicy 35 mm i odstawić na temperaturę sitową do zestalenia. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Tegosept 10%Aby przygotować 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml etanolu. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
Pasta drożdżowa~ 50 g suchych aktywnych drożdży. Stopniowo dodawać ddH2O do zlewki zawierającej drożdże, mieszając aż do uzyskania konsystencji pasty. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Tabela 2: Materiały barwiące
DAPIInvitrogenD35711:1000, zapas 5 mg/ml.
Królik anty-Vasa1:250, prezent od Ruth Lehmann.
Mysia anty-Fasciclin IIIDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)7G101:10
Mysie anty-1B1Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)1B11:4
Guniea pig anti-Traffic Jam1:2500, prezent od Dorthei Godt (Li i wsp., 2003).
myszy anty-ProsperoBank hybrydoma (DSHB)Prospero MR1A1:10
anty-ElavHybridoma Bank (DSHB)7EBA101:30
mysie badania rozwojowe anty-RepoHybridoma Bank (DSHB)8D121:10
Kozioł anty-królik Alexa546InvitrogenA110101:500
Kozioł anty-mysz Alexa488InvitrogenA110291:500
Koza anty-guniea świnia Alexa633InvitrogenA211051:500
Koza anty-szczur Alexa488InvitrogenA110061:500
Tabela 3: Materiały i sprzęt
Klatki na muchyRęcznie robione; Genesee Scientific CorporationNie dotyczy; Butelki: 32-130; Gotowa klatka: 59-101Wykonana przez cięcie przezroczystych rurek akrylowych (o średnicy 1 3/4 cala) na segmenty o wysokości 4 cali za pomocą złożonej piły ukośnej przy 400 obr./min. Bardzo drobne sitko ze stali nierdzewnej (zostało przymocowane do jednego końca wanny za pomocą kleju akrylowego. Alternatywną metodę wykorzystującą pustą butelkę po pokarmie dla much można znaleźć w Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Klatki można również zakupić w Genesee Scientific Corporation.
Sonikator: Branson 250 Digital SonifierBransonModel: Sonda Branson Digital Sonifier 250
SonicatorBransonModel #: 102C (CE)EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Filtr strzykawkowyNalgene190-25-200,2 μ m celuloza, filtr membranowy octanowy
System obrazowania: Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem z wielobarwnym źródłem światła, cyfrową kamerą CCD i oprogramowaniem do obrazowaniaMikroskop: Olympus, Źródło światła: Lumen Dynamics, Kamera: Q-Imaging, Oprogramowanie do obrazowania: Intelligent Imaging Inc.Mikroskop: BX51 wyposażony w wirującą tarczę DSU, Źródło światła: X-Cite 120Q, Kamera: RETIGA-SRV, Oprogramowanie do obrazowania: Slidebook 5.0
Filtr próżniowyNalgene450-00200.2 μ M Filtr membranowy z azotanu celulozy
DABCO + roztwór Talerze Badania rozwojowe Badania rozwojowe szczurów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202(2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunofluorescencja z u yciem sonikacjimikroskopia fluorescencyjnapenetracja przeciwciausuwanie kutykulifiksacja pr bekprzeciwcia a pierwotneprzeciwcia a wt rnemikroskopia konfokalnamontowanie tkanek

Powiązane artykuły