Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Zarodki i larwy Drosophila stanowią doskonały model do badania procesów rozwojowych w wielu narządach i tkankach. Obrazowanie pojedynczych komórek jest często konieczne w tych badaniach w celu ustalenia złożonych środowisk, w których rozwijają się komórki. Wizualizację komórek w tkankach można osiągnąć za pomocą barwienia immunologicznego. Istnieją dobrze opisane protokoły barwienia immunologicznego dla embrionalnych tkanek Drosophila <17 godzin po złożeniu jaj (ael)^1-3. Jednak pod koniec embriogenezy tworzy się ochronny naskórek, uniemożliwiając skuteczne przenikanie przeciwciał. W związku z tym te protokoły barwienia immunologicznego są nieskuteczne w analizie tkanek w późnych stadiach rozwoju zarodków i w kolejnych stadiach rozwoju larwalnego (1. stadium (L1), 2^{. stadium (}L2) i 3. stadium (L3)). Ta nieefektywność stanowi barierę dla naszego zrozumienia dynamicznych procesów, które zachodzą podczas tego wydłużonego okresu rozwojowego ⁴. Sekcja tkanek jest szeroko stosowaną techniką obchodzenia tej bariery ^5-7. Jednak sekcja może okazać się nieefektywna. Ekstrakcja może być utrudniona ze względu na trudności w zlokalizowaniu lub wyizolowaniu tkanek zarodkowych i larwalnych. Ponadto fizyczne usunięcie tkanek docelowych może spowodować uszkodzenie poprzez ich rozerwanie lub niemożność wydobycia ich w całości.

Sonikacja to metoda, która wykorzystuje fale dźwiękowe do zakłócania oddziaływań międzycząsteczkowych. Stosuje się go w celu zakłócenia integralności naskórka larwalnego Drosophila w celu immunobarwienia rozwijających się komórek nerwowych ^{typu 6}. Protokół ten został dostosowany do barwienia immunologicznego gonad embrionalnych i larwalnych w późnym stadium, które mogą mieć nawet 50 μm średnicy ^8-10. Dzięki takim badaniom scharakteryzowano proces tworzenia się niszy męskich komórek macierzystych linii rozrodczej (GSC) w późnym stadium rozwoju zarodków Drosophila ^8-10, a mechanizmy regulujące rozwój i różnicowanie komórek macierzystych w późnym stadium zarodków i larw ^9-12. W ten sposób sonikacja stanowi skuteczną alternatywę dla rozwarstwienia tkanek, które może być trudne ze względu na rozmiar tkanki. Ponadto umożliwia barwienie immunologiczne tkanek Drosophila in situ, pozostawiając komórki w kontekście całego organizmu i zachowując morfologię in situ. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół fluorescencyjnego barwienia immunologicznego tkanek w późnym stadium zarodkowym przez wczesne/środkowe L3 in situ. Analiza gonad Drosophila i tkanki nerwowej jest pokazana w reprezentatywnych wynikach w celu wykazania skuteczności tego protokołu. Co więcej, ten protokół barwienia immunologicznego może być dostosowany do analizy innych tkanek Drosophila, a także tkanek innych organizmów z zewnętrznym naskórkiem.

1. Przygotowanie klatki na zbiórkę

1. Znieczulenie młodych, płodnych much za pomocą CO₂ . Przenieś znieczulone muchy do klatki. Aby uzyskać optymalny plon, użyj 100-120 dorosłych much w wieku od 2 do 7 dni w stosunku 4:1 samic do samców. Pozwól muchom na odpowiedni okres aklimatyzacji, ~ 24 godziny przed pobraniem próbki do utrwalenia. Jeśli klatka została założona z dziewiczymi samicami krytymi samcami, należy zastosować 36-48-godzinny okres aklimatyzacji.
2. Na otwartym końcu klatki umieść wstępnie przygotowany talerz agarowy z sokiem jabłkowym z kroplą pasty drożdżowej wielkości dziesięciocentówki pośrodku nad otworem klatki. Następnie zabezpiecz taśmą. Uszczelnij połączenie między płytką agarową z sokiem jabłkowym a klatką za pomocą Parafilm.
3. Umieść klatkę w dodatkowym pojemniku z płytką agarową z sokiem jabłkowym jako podstawą i pozwól muchom rozmnażać się w określonej temperaturze przez odpowiedni okres czasu, jak określono w doświadczeniu.
   Uwaga: Czasy pobierania próbek będą się różnić. Na przykład, podczas pobierania zarodków w późnym stadium rozwoju/wczesnych larw L1 (17–24 godziny), należy pozwolić muszkom na złożenie jaj na płytkach agarowych z sokiem jabłkowym przez 7 godzin w temperaturze 25 °C, a następnie poddać próbce starzenie się przez 17 godzin w temperaturze 25 °C. Podobnie w przypadku zbioru larw pierwszego stadium rozwojowego w średnim okresie (36–48 godzin) należy pozwolić muchom na składanie jaj przez 12 godzin w temperaturze 25 °C przed leżakowaniem próbki przez 36 godzin w temperaturze 25 °C.
4. Po upływie tego czasu postukaj klatką o stół, aby muchy spadły z talerza z sokiem jabłkowym bez znieczulenia. Szybko wymień zużyty talerz na świeży zawierający kroplę pasty drożdżowej. Zabezpiecz świeżą płytkę taśmą i parafolią i przechowuj klatkę z płytą agarową z sokiem jabłkowym jako podstawą.
5. Ostrożnie usuń kroplę drożdży z używanej płytki metalową szpatułką. Przykryj pokrywką talerz z zużytym sokiem jabłkowym i pozwól złożonym zarodkom dożakować do starzenia się, jeśli jest to konieczne eksperymentalnie.
   Uwaga: Podczas starzenia próbek płytki mogą być przechowywane w temperaturze 25 °C, chyba że doświadczalnie wymagane są wyższe temperatury. Przykłady starzenia zarodków do pobrania opisano powyżej (patrz uwaga do kroku 1.3). Usuwanie pasty drożdżowej przed starzeniem próbki jest wykonywane, aby zapobiec wpełzaniu larw do drożdży i rozbijaniu agaru pod spodem. Pozostały sok jabłkowy, agar i pozostałości pasty drożdżowej dostarczają składników odżywczych dla wzrostu larw. Podczas gdy zarodki złożone bezpośrednio w paście drożdżowej są tracone w wyniku usunięcia pasty drożdżowej, utrata ta jest lepsza niż pozostałości drożdży i agaru w próbce, co może zmniejszyć wydajność barwienia. W przypadku nieusuwania pasty drożdżowej, drożdże można upłynnić za pomocą buforu fosforanowego Triton X-100 (PBTx), zmieszać pędzlem, a następnie usunąć z próbki za pomocą sitka do komórek przed utrwaleniem.

2. Fiksacja

1. Gdy zarodki ułożone na płytce agarowej z sokiem jabłkowym osiągną wiek dojrzały, użyj małego pędzla zwilżonego roztworem buforu fosforanowego Triton X-100 (PBTx), aby ostrożnie usunąć próbkę z płytki.
   Uwaga: Starsze larwy są ruchome i mogą pełzać po wewnętrznej stronie pokrywy. Próbkę tę można pobrać w podobny sposób, usuwając ją pędzlem.
2. Przetrzyj pędzel z próbką o skierowany do wewnątrz grzbiet sitka do komórek. Następnie spłucz ścianki sitka i pędzel butelką ze spryskiwaczem zawierającą roztwór PBTx. Umieść pokrywę szalki Petriego pod sitkiem, aby uchwycić roztwór PBTx.
3. Po przeniesieniu całej próbki do sitka wlej do sitka tyle PBTx, aby podnieść próbkę z siatki. Następnie podnieś sitko i wlej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.
4. Powtórzyć krok 2.3 trzy razy, aby usunąć odpadki drożdży i much, które mogły zostać przeniesione wraz z próbką.
5. Wlej wystarczającą ilość 50% roztworu wybielacza (NaOCl)/wody (ddH₂O) do sitka, aby podnieść larwy z siatki. Pozostaw larwy w roztworze na 5 minut. Następnie podnieś sitko i wylej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.
   Uwaga: Wybielacz jest wymagany tylko w próbkach embrionalnych w wieku od 0 do 22 godzin w celu usunięcia błony kosmówkowej. Stosowanie wybielacza do starszych próbek można pominąć, ale jego włączenie nie jest szkodliwe. Jeśli pożądane jest pominięcie, zastąp wybielacz na tym etapie PBTx. Rozcieńczony wybielacz należy zużyć w ciągu 24 godzin od przygotowania roztworu.
6. Przemyć próbkę w sitku za pomocą PBTx, wlewając do sitka tyle PBTx, aby podnieść próbkę z siatki. Pozostawić próbkę w roztworze na 3 minuty. Następnie podnieś sitko i wlej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.
7. Powtórz krok 2.6 pięć razy.
8. Osuszyć dno sitka do komórek, a następnie przenieść próbkę do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 1,75 ml roztworu PEMS za pomocą pędzla.
9. Pracując w wentylowanym dygestorium, dodaj 250 μl 37% formaldehydu i 8 ml odczynnika heptanu do fiolki scyntylacyjnej.
   Uwaga: Formaldehyd i heptan są niebezpieczne. Ze względów bezpieczeństwa należy kontynuować pracę pod wentylowanym wyciągiem i nosić odpowiednie rękawice do czynności 2.9 – 3.3.
10. Pozostawić fiolkę do wstrząsania z prędkością 200 obr./min lub podobną umiarkowaną prędkością przez 20 minut.
11. Dodać 10 ml metanolu do fiolki scyntylacyjnej bez usuwania poprzedniej fazy wodnej i pozostawić fiolkę do energicznego wstrząsania z prędkością 500 obr./min przez 1 min.
    Uwaga: Metanol jest niebezpieczny. Kontynuuj pracę w wentylowanym dygestorium i noś odpowiednie rękawice.
12. Wyjąć fiolkę z shakera i natychmiast wlać zawartość do sitka komórkowego nad pojemnikiem na odpady płynne w kapturze. Dodać dodatkową ilość metanolu do fiolki i w razie potrzeby przepuścić przez sitko do komórek, aby upewnić się, że cała próbka została usunięta.
    Uwaga: Sitka do komórek mogą powoli spływać. Aby temu zaradzić, należy przyłożyć tkankę laboratoryjną do dna sitka komórkowego, aby szybciej przeciągnąć roztwór przez sitko. Metanol, formaldehyd i heptan powinny być przechowywane w odpowiednich pojemnikach na odpady do czasu właściwej utylizacji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
13. Osuszyć dno sitka komórkowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej, a następnie za pomocą pędzla przenieść próbkę pobraną z sitka do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,5 ml metanolu.
    Uwaga: Jeśli używanych jest wiele fiolek scyntylacyjnych, należy wykonywać kroki 2.12 i 2.13 po jednej fiolce na raz, aby zapobiec wysychaniu próbki na sitkach do komórek.
14. Po dodaniu próbki do probówki mikrowirówki usuń metanol za pomocą pipety. Upewnij się, że próbka osiadła na dnie probówki.
15. Przepłukać próbkę w probówce do mikrowirówki, dodając do probówki około 0,5 ml metanolu. Poczekaj, aż próbka się uspokoi, a następnie usuń metanol za pomocą pipety.
16. Powtórz krok 15 trzy razy.
17. Dodaj 0,5 ml metanolu do probówki, a następnie przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

3. Rehydratacja i przygotowanie próbki do barwienia immunologicznego

1. Usunąć metanol z probówki mikrowirówki za pomocą pipety, pozostawiając próbkę w probówce. Odpady metanolu należy przechowywać w odpowiednim pojemniku na odpady do czasu ich prawidłowej utylizacji.
   Uwaga: Aby zwiększyć skuteczność sonikacji, należy użyć nie więcej niż 3 mm próbki osadzonej na dnie probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Nadmiar próbki można przenieść do oddzielnej probówki za pomocą pipety przed rozpoczęciem powyższego etapu hydratacji. Aby zapobiec zatkaniu końcówki pipety za pomocą czystej żyletki, można przeciąć końcówkę pipety.
2. Dodaj 1,0 ml 50% roztworu metanolu/buforu fosforanowego (PBTw) do probówki i miażdż przez 3 minuty.
3. Usunąć roztwór metanolu do odpowiedniego pojemnika na odpady i dwukrotnie spłukać 1,0 μl PBTw. Po każdym płukaniu należy odczekać, aż próbka osiada, a następnie pobrać PBTw za pomocą pipety.
4. Dodać 1,0 ml mieszanki albuminy bydlęcej i buforu fosforanowego (BBTw) do fiolki i rozdrabniać. Po 3 minutach na kołysce poczekaj, aż próbka się uspokoi i wyjmij BBTw za pomocą pipety.
5. Powtórz krok 3.4 dwa razy, uważając, aby usunąć jak najwięcej BBTw bez utraty próbki po ostatnim praniu.
6. Dodać 0,5 ml BBTw do probówki i umieścić probówkę na lodzie.

4. Sonikacja próbki

1. Ustaw sonikator na maksymalną amplitudę 10% i wyznacz czas pracy 2 sekundy stałej sonikacji.
   Uwaga: Ustawienia te są specyficzne dla sonikatora wskazanego w Tabeli Materiałów i Sprzętu i mogą wymagać optymalizacji dla różnych sonikatorów.
2. Przed sonikacją próbki należy oczyścić sondę sonikatora, umieszczając końcówkę sondy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej wodą dejonizowaną i uruchomić sonikator w celu wyczyszczenia sondy. Sucha sonda sonicyjna z tkanką laboratoryjną po uruchomieniu.
3. Zanurz sondę w probówce mikrowirówki zawierającej próbkę tak, aby znajdowała się około 3 do 4 mm nad próbką i rozpocznij sonikację.
4. Wyjmij probówkę do mikrowirówki i umieść ją na lodzie na co najmniej 30 sekund, aby rozproszyć ciepło z sonikacji i pozwolić, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrowirówki.
5. W razie potrzeby powtórzyć kroki 4.3 i 4.4 w zależności od wieku przetwarzanej próbki.
   Uwaga: Aby uzyskać optymalną objętość próbki sonikacji, zarodki młodsze niż 17 godzin nie wymagają sonikacji, ale te między 17 a 24 godzinami (stadium 17/wczesny L1) wymagają dwóch sonikacji. Larwy w wieku od 24 do 36 lat (wczesne/środkowe L1), 36 - 48 (średnie/późne L1), 48 - 60 (wczesne/średnie-L2), 60 - 72 (średnie/późne-L2), 72 - 84 (wczesne/średnie-L3), 84 - 96 - 96 (wczesne/średnie-L3) wymagają odpowiednio 5, 9, 11, 13, 15, 18 i 22 sonikacji. Zobacz dyskusję w celu dalszego opracowania na temat czasów sonikacji.
6. Dwukrotnie spłukać 1,0 ml BBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się uspokoi, a następnie pobrać BBTw za pomocą pipety.
7. Dodać 1,0 ml BBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 3 minutach na kołysce poczekaj, aż próbka się uspokoi i wyjmij BBTw za pomocą pipety.
8. Powtórz krok 4.7 dwa razy.

5. Barwienie immunologiczne

1. Zablokować próbkę, dodając 5% normalnej surowicy rozcieńczonej w BBTw do probówki mikrowirówkowej. Usuń blok po kołysaniu przez 1 godz.
   Uwaga: Należy użyć normalnej surowicy z gatunku, w którym wytwarzane są przeciwciała drugorzędowe.
2. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do odpowiedniego stężenia roboczego w 5% normalnym roztworze surowicy/BBTw.
3. Próbkę skały w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała O/N w temperaturze 4 °C lub przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (około 22 °C.
   Uwaga: Czas inkubacji przeciwciał i temperatury mogą się różnić. Inkubacja O/N w temperaturze 4 °C lub 3 godziny w temperaturze pokojowej jest zazwyczaj wystarczająca. Jednak dwudniowy okres inkubacji może poprawić jakość barwienia, szczególnie w przypadku starszych próbek lub gdy stosowane są przeciwciała pierwotne o niskim powinowactwie. Dłuższe inkubacje przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze 4 °C. Podobne względy należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu przeciwciał drugorzędowych (patrz ppkt 5.10).
4. Pozwól, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrofuge. Pobrać przeciwciała pierwotne za pomocą pipety. W razie potrzeby zachowaj przeciwciała do ponownego użycia.
5. Dwukrotnie spłukać 1,0 ml BBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się osadzi, a następnie pobrać BBTw za pomocą pipety.
6. Dodać 1,0 ml BBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 3 minutach na wahaczu pozostawić próbkę do osiadania i usunąć BBTw za pomocą pipety.
7. Powtórz krok 5.6 pięć razy.
8. Zablokować próbkę, dodając 5% normalnego roztworu surowicy/BBTw do probówki mikrowirówkowej. Usuń blok po kołysaniu przez 30 minut do 1 godz.
   Uwaga: Ten dodatkowy etap blokowania nie jest wymagany, ale może poprawić jakość barwienia dla określonych przeciwciał.
9. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe do odpowiedniego stężenia roboczego w 5% normalnym roztworze surowicy/BBTw.
10. Owiń probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby zmniejszyć blaknięcie spowodowane ekspozycją na światło. Próbkę skalną w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 12–48 godzin w temperaturze 4 °C lub przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (około 22 °C).
11. Pozwól, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrofuge. Pobrać przeciwciała wtórne za pomocą pipety.
12. Dwukrotnie przepłukać 1,0 ml PBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się uspokoi, a następnie pobrać PBTw za pomocą pipety.
13. Dodać 1,0 ml PBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 5 minutach na wahaczu poczekaj, aż próbka się uspokoi i usuń PBTw za pomocą pipety.
14. Powtórz krok 5.13 trzy razy.
15. OPCJONALNIE: Dodać DAPI rozcieńczony w stosunku 1:1 000 w PBTw. Próbkę skały zawinąć w folię aluminiową na 3 minuty, a następnie usunąć roztwór DAPI za pomocą pipety. Przepłukać pięć razy 1,0 ml PBTw, pozwalając próbce osiąść przed usunięciem PBTw za pomocą pipety.
16. Dodać 80 - 100 μl roztworu 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO) do probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: Można zastąpić inny środek zapobiegający blaknięciu na bazie glicerolu.

6. Analiza

1. Przed zamontowaniem próbki na szkiełkach należy dodać dodatkowe 5 - 10 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu DABCO/p-fenylenodiaminy (PPD) do probówki mikrowirówkowej.
   Uwaga: Próbkę można dodawać do slajdów bez sekcji. Objętość próbki dodanej do szkiełka zmienia się w zależności od rozmiaru szkiełka nakrywkowego. Podczas pipetowania próbki na szkiełko można odciąć końcówkę pipety za pomocą żyletki, aby zapobiec ścinaniu próbki. Często przydatne jest ułożenie próbki w rzędach w celu łatwej analizy. Dodanie PPD jako dodatkowego środka zapobiegającego blaknięciu może nie być wymagane, ale może zapobiec fotowybielaniu, jeśli próbki są przechowywane przez długi czas.
2. Delikatnie umieść szkiełko pokrywy szklanej na próbce. Następnie zabezpiecz szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci.
3. Widok zamontowanej próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Aby zademonstrować skuteczność barwienia immunologicznego opartego na sonikacji w analizie późnych tkanek embrionalnych i larwalnych in situ, zarodki i larwy dzikich typów zostały przetworzone pod kątem barwienia immunologicznego jąder, jajników i tkanki nerwowej. Próbki zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej i przedstawiono reprezentatywne wyniki (ryc. 1 i ryc. 2). Wyniki pokazują, że opisany protokół jest skuteczny w wizualizacji cech morfologicznych, a także pojedynczych komórek in situ w późnych fazach rozwoju Drosophila od późnego embrionalnego do wczesnego/środkowego L3.

Wyniki badania immunologicznego jądra:
Rozwój jąder jest szczególnie dobrym systemem do zilustrowania skuteczności protokołu, ponieważ dojrzewanie jąder jest dynamiczne przez cały okres rozwoju larw. Dorosłe jądra Drosophila tworzą zwiniętą rurkę z jednym ślepym końcem, w której znajduje się nisza komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) (patrz 13,14 w celu zapoznania się z opiniami). W tej niszy GSC są rozmieszczone wokół ciasnego skupiska niemitotycznych komórek somatycznych zwanych hubem. GSC przechodzą asymetryczny podział, aby wytworzyć jeden GSC, który pozostaje zakotwiczony w piaście, oraz potomny gonialblast, który jest przemieszczany z dala od niszy komórek macierzystych. Gdy gonialblast dzieli się niecałkowicie, tworzą się rozszerzenia cytoplazmatyczne zwane dysome'ami, łączące komórki w spermatogonium. Po 4 kolejnych podziałach spermatogonium inicjuje mejozę, aby utworzyć plemniki.

Tworzenie jąder zaczyna się od połączenia pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) i somatycznych komórek prekursorowych gonad (SGP) podczas embriogenezy (zobacz 15,16 dla recenzji). Związek ten prowadzi do powstania funkcjonalnej niszy GSC pod koniec embriogenezy 8-10. W połowie L1 asymetryczne podziały GSC w niszy GSC powodują różnicowanie spermatogonii z rozgałęzionymi dyosomami 9. Asymetryczny podział GSC trwa przez cały okres rozwoju larw, co skutkuje wytwarzaniem dodatkowych spermatogonii i postępującym wzrostem wielkości gonad. Pokazano reprezentatywne obrazy jąder późnego zarodka i wczesnego/środkowego L1, L2 i L3, wybarwionych immunologicznie dla komórek rozrodczych, komórek piasty i oparów (ryc. 1A-D). Obrazy te ilustrują dynamiczne zmiany w wielkości gonad i różnicowaniu komórek rozrodczych obserwowane w jądrach w czasie.

Wyniki badania immunologicznego jajników:
Dorosłe jajniki Drosophila składają się z 16-20 pojedynczych jednostek produkujących jaja zwanych jajnikami (patrz 17,18 w celu zapoznania się z opiniami). Na jednym końcu każdego jajnika znajduje się struktura zwana germarium, w której znajduje się nisza komórek macierzystych. Wnęka jajnika składa się z niezróżnicowanych GSC i dwóch populacji komórek somatycznych: komórek czapeczki i komórek włókien końcowych (TF). Podobnie jak jądro, GSC przechodzą asymetryczny podział, aby wytworzyć jeden GSC, który pozostaje w sąsiedztwie komórek czapeczki i różnicującej się komórki potomnej, zwanej cystoblastem, która jest wypychana z niszy. Cystoblast przechodzi następnie 4 rundy podziału komórek, tworząc torbiel linii zarodkowej, połączoną rozgałęzionym dymem. Każda torbiel linii zarodkowej jest następnie otoczona komórkami pęcherzykowymi, aby wytworzyć komorę jajową, która nadal dojrzewa, przesuwając się w dół jajnika.

Podobnie jak jądra, jajniki powstają po raz pierwszy podczas embriogenezy 16,18. Mnogie jajniki powstają z pojedynczej gonady embrionalnej składającej się z PGC i SGP. W połowie L3 SGP powodują powstawanie prekursorów TF w przedniej części jajnika, podczas gdy komórki rozrodcze lokalizują się w tylnej części jajnika i łączą się z mieszanymi komórkami pochodzącymi z SGP (IC)19-22. Pod koniec L3 komórki TF różnicują się i organizują w stosy znajdujące się w niszy dorosłych komórek macierzystych, ustanawiają się GSC i komórki czapeczki oraz obserwuje się różnicowanie torbieli linii zarodkowej 19,20,23. Pokazano reprezentatywne obrazy jajników w późnym stadium rozwoju zarodka i wczesnego/środkowego L3, wybarwionych immunologicznie dla komórek rozrodczych, SGP, IC, prekursorów TF i dyzomy (ryc. 1E,F). Obrazy te pokazują normalną morfologię i postęp rozwojowy jak na ich wiek.

Wyniki badania immunologicznego neuronów:
Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) Drosophila wywodzi się z nerwowych komórek macierzystych, zwanych neuroblastami (NB), które powstają z embrionalnego neuroepithelium (patrz 24,25 w celu zapoznania się z opiniami). Nanocząsteczki w zarodkach i larwach dzielą się asymetrycznie, tworząc zwojowe komórki macierzyste (GMC), które z kolei generują neurony i komórki glejowe znajdujące się w dorosłym mózgu i brzusznym rdzeniu nerwowym. Ponieważ larwy NB dają początek większości dorosłych neuronów i można je rozróżnić na podstawie ich położenia w mózgu, mózgi larw stały się ważnym modelem do badania zachowania NB i różnicowania neuronalnego.

Mózg L3 składa się z dwóch płatów i centralnie położonego brzusznego rdzenia nerwowego 24. Pokazano reprezentatywne obrazy mózgów środkowego L3 wybarwionych immunologicznie pod kątem NB, GMC, niezróżnicowanych neuronów, niedojrzałych i pierwotnych neuronów oraz komórek glejowych (Figura 2A-C)26-30. Obrazy te pokazują silne zabarwienie w wyraźnych wzorcach ekspresji w płatach mózgu i brzusznym rdzeniu nerwowym. W zależności od orientacji montażu, obrazowanie pozwala na wizualizację tkanki mózgowej od powierzchni grzbietowej (ryc. 2A), brzusznej (ryc. 2B) lub w przekroju strzałkowym (ryc. 2C).

Skuteczność barwienia:
Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że procedura barwienia immunologicznego oparta na sonikacji jest wszechstronna. Nie tylko może być używany do identyfikacji określonych typów komórek, ale może być również używany do wskazywania obecności określonych białek i organelli. Jednak niejednoznaczne wyniki mogą wynikać z oczekiwanych różnic w skuteczności barwienia. Na przykład, anty-vasa zabarwiła co najmniej jedną gonadę u 73,2% wszystkich badanych larw (n=781), podczas gdy anty-Elav zabarwiła mózgi u 86% larw (n=115). Ponadto obserwujemy, że skuteczność barwienia jest mniej więcej odwrotnie proporcjonalna do etapu rozwoju. W zarodkach w późnym stadium zarodki anty-vasa wybarwiły 89,8% gonad (n=206), podczas gdy barwienie było obecne tylko u 59,8% i 46,9% larw odpowiednio w L2 i połowie L3 (n=132 i 49). Ponadto sonikacja powoduje utratę próbki. Gdy policzono liczbę zarodków i larw obecnych w optymalnej objętości próbki sonikacyjnej przed i po sonikacji, stwierdzono, że średnio 41,0% próbki nie nadaje się do analizy (n=1165). Aby zmaksymalizować skuteczność barwienia, protokoły powinny być zoptymalizowane pod kątem określonych przeciwciał poprzez zmianę opublikowanych stężeń przeciwciał lub czasu inkubacji przeciwciał.

Ryc. 1. Barwienie immunologiczne gonad Drosophila in situ.(A-D) Obrazy jąder in situ w zarodkach w późnym stadium (stadium 17/wczesne-L1) do larw wczesnych/środkowych L3 barwionych immunologicznie anty-Vasa (A-D, czerwony; A'-D' sam) do wykrywania komórek rozrodczych, anty-Fasicilin III (Fas III) i anty-1B1 (A-D, zielony; A''-D'' sam) do wykrywania odpowiednio komórek piasty i dyzonów, oraz DAPI (A-D, niebieski; A'''-D''') do wykrywania jąder. (A) Stadium 17 / wczesne jądro L1 pokazuje nowo połączone dysomy piasty i kuliste dysomy w niezróżnicowanych komórkach rozrodczych. (B) Jądro wczesne/środkowe L1 wykazuje kuliste dyzomy w GSC zlokalizowanych w pobliżu piasty oraz w niektórych tylnych komórkach rozrodczych wydłużone dyzomy wskazujące na wczesne różnicowanie spermatogoniów. (C) Jądra wczesne/środkowe L2 i (D) wczesne/środkowe L3 wykazują utrzymanie GSC ze sferycznymi dyzonami w pobliżu piasty i rozgałęzieniami dymów wskazującymi na późne różnicowanie plemników w tylnych komórkach rozrodczych. Jądro wczesne/środkowe L3 znacznie się powiększyło i wykazuje znaczne rozgałęzienia dymne. (E-F) Obrazy jajników in situ w zarodkach w późnym stadium rozwoju i larw środkowego L3 barwionych immunologicznie anty-Vasa (E-F, czerwony; E'-F' sam) do wykrywania komórek rozrodczych, anty-1B1 (E-F, zielony; E''-F'' sam) do wykrywania dyosomów i somatycznych błon komórkowych w L3 oraz anty-Traffic Jam (TJ)(E-F, niebieski; E'''-F''' sam) do wykrywania somatycznych komórek jajnika. (E) Stadium 17 / wczesny jajnik L1 pokazuje, że komórki somatyczne są rozmieszczone w całej gonadzie i że komórki rozrodcze mają kuliste opary. (F) Wczesny/środkowy jajnik L3 jest nieznacznie powiększony, a w przednich komórkach somatycznych wykrywa się związaną z błoną ekspresję 1B-1 wskazującą na rozwój progenitora TF. Komórki rozrodcze w połowie L3 znajdują się w jądrach tylnych, wykazują kuliste dyzomy i wiążą się z TJdodatnimi / 1B1dim somatycznymi układami scalonymi. Wszystkie obrazy są projekcjami Z 4 kolejnych warstw konfokalnych z gonadą skierowaną do przodu w lewo. Gonady są obrysowane, a piasta jest oznaczona żółtą strzałką w jądrach. Podziałka skali wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Barwienie immunologiczne tkanek nerwowych Drosophila in situ.Larwy wczesne/środkowe L3 barwione immunologicznie anty-Elav (A-C, czerwony; A'') do wykrywania jąder niedojrzałych i pierwotnych neuronów, oraz albo anty-Prospero (Plusy) (A, zielony; A' sam) do wykrywania jąder w GMC i niezróżnicowanych neuronach lub anty-odwróconej polaryzacji (Repo) (B-C, zielony; B'-C' w monoterapii) do wykrywania komórek glejowych. jądra i DAPI (A-C, niebieskie; A''') użyto do wykrycia wszystkich jąder komórkowych. Wszystkie obrazy zorientowane przodem do góry. Przekrój strzałkowy zorientowany brzusznie w lewo. (A) Odcinek grzbietowy wykazuje silne zabarwienie dla Pros i Elav w obwodowych obszarach płata mózgu (BL) oraz wzdłuż linii środkowej i obwodu brzusznego rdzenia nerwowego (VNC). Wstawka w panelu A pokazuje barwienie Plusy i Elav w odrębnych jądrach wzdłuż linii środkowej VNC. (B) Przekrój brzuszny wykazuje szeroką ekspresję komórek glejowych Repododatnich z silniejszym zabarwieniem wzdłuż linii środkowej VNC i obwodu. (C) Przekrój strzałkowy pokazuje wzbogacenie barwienia Repo na brzusznej powierzchni VNC. Wszystkie obrazy są pojedynczymi sekcjami konfokalnymi. Podziałka wynosi 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.