Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Summary

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Abstract

U roślin kwitnących, przejście od losu komórek somatycznych do rozrodczych jest zaznaczone przez specyfikację komórek macierzystych zarodników (SMC) w organach kwiatowych dorosłej rośliny. Samica SMC (komórka macierzysta megaspory, MMC) różnicuje się w zawiązku zalążka i ulega mejozy. Wyselekcjonowana haploidalna megaspora przechodzi następnie mitozę, tworząc wielokomórkowy żeński gametofit, który da początek gametom, komórce jajowej i komórce centralnej, wraz z komórkami dodatkowymi. Ograniczona dostępność MMC, mejocytów i żeńskiego gametofitu wewnątrz zalążka stanowi techniczne wyzwanie dla analiz cytologicznych i cytogenetycznych na poziomie pojedynczej komórki. W szczególności bezpośrednia lub pośrednia immunodetekcja epitopów komórkowych lub jądrowych jest upośledzona przez słabą penetrację odczynników do wnętrza komórki roślinnej, a obrazowanie pojedynczych komórek jest utrudnione przez brak przejrzystości optycznej w tkankach pełnomocowanych.

Dlatego opracowaliśmy skuteczną metodę analizy organizacji jądra i modyfikacji chromatyny w wysokiej rozdzielczości pojedynczej komórki w zalążkach Arabidopsis osadzonych w całości. Polega ona na rozwarstwieniu i zatopieniu utrwalonych zalążków w cienkiej warstwie żelu akrylowego na mikroskopijnym szkiełku. Osadzone zalążki poddawane są zabiegom chemicznym i enzymatycznym mającym na celu poprawę klarowności tkanek i przepuszczalności odczynników do barwienia immunologicznego. Zabiegi te zachowują organizację komórkową i chromatynę, DNA i epitopy białek. Próbki mogą być wykorzystywane do różnych dalszych analiz cytologicznych, w tym barwienia immunologicznego chromatyny, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i barwienia DNA do analizy heterochromatyny. Obrazowanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) o wysokiej rozdzielczości, a następnie rekonstrukcja 3D pozwala na pomiary ilościowe w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Introduction

U roślin kwitnących, tworzenie linii rozrodczych zaczyna się od różnicowania SMC, żeńskiego MMC i męskiego mikrosporu komórki macierzystej. MMC rozwija się z podnaskórkowej komórki jądrowej na dystalnym końcu zalążka zalążka, a komórka macierzysta mikrospor rozwija się z tkanki sporogennej w pylniku, które znajdują się głęboko w narządach kwiatowych¹. SMC przechodzą mejozę w celu wytworzenia haploidalnych zarodników, które następnie powodują powstawanie gametofitów po mitozie. Żeński gametofit, czyli worek zarodkowy, składa się z jednej komórki jajowej, jednej komórki centralnej, dwóch synergidów i trzech antypodali. Męski gametofit lub pyłek składa się z j....

Protocol

Procedura jest opisana w przepływie pracy na rysunku 1, a konfiguracja do sekcji i zatapiania tkanek jest przedstawiona na rysunku 2.

1. Utrwalenie tkanek

1. Zbierz 20-30 owocolistków w probówce do mikrofugi zawierającej świeżo przygotowany bufor utrwalający BVO na lodzie.
2. Utrwal tkankę przez 30 minut, delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.
3. Odwirować probówki zawierające owocolistki w utrwalaczu w mikrowirówce stołowej przez 1 minutę przy 400 x g.
4. Ostrożnie usunąć bufor utrwalający i dodać 1 ml PBT, umieścić probówki na lodzie.

Results

Zapewniamy solidny protokół do przygotowania i przetwarzania na dużą skalę zalążków Arabidopsis nadających się do barwienia cytologicznego w całym wierzchowaniu. Dzięki osadzeniu zalążki zachowują trójwymiarową strukturę (ryc. 3). Ponadto przetwarzanie tkanek, w tym klarowanie optyczne, umożliwia obrazowanie struktur subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości. Rycina 4 przedstawia barwienie DNA w zawiązkach zalążków z całą górą, gdzie heterochromatyna pojawia się jako jasne, dobrz.......

Discussion

U roślin kwitnących żeńska linia rozrodcza jest otoczona kilkoma warstwami komórek, w tym jądrem i osłonkami zalążka, co sprawia, że barwienie cytologiczne w całości jest technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczny protokół umożliwiający przygotowanie i przetworzenie dużej liczby zalążków nadających się do barwienia cytologicznego, takiego jak barwienie immunologiczne, barwienie DNA i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całości. Z powodzeniem wykorzystaliśmy go do analizy żeńskiej reprodukcyjnej.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwory
BVO Bufor utrwalający (na podstawie32)			2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldehyd, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2,5% (v/v) formaldehyd
30% Akrylamid:bisakryloamid			3 g akrylamidu, 0,33 g bisakryloamidu, 1x PBS (przygotować 10 ml, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C)
200 ml 5% mieszanki akryloamidu w PBS			34 ml 30% akryloamidu: bisakryloamidu, 166 ml 1x PBS (świeży z 30% bulionu)
20% siarczanu			amonu 0,2 g siarczanu amonu, 1 ml sterylnej wody (przygotować podwielokrotności z 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °; C)
20% siarczyn			sodu 0,2 g siarczynu sodu, 1 ml sterylnej wody (przygotować porcje z 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °; C)
		enzymów ściany komórkowej	0,5% (w/v) celulazy, 1% (w/v) drylazy, 0,5% (w/v) pektoliazy
Odczynniki i materiały
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Etanol	Schaurlau	ET00102500
Metanol	Schaurlau	ME03062500
ksylen	ROTH	4436.1
Celulaza	Sigma	1794
Drisolase	Sigma	D8037
pektolyaza	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
akrylamid	Sigma	A-3553
bisakryloamid	Sigma	M2022	toksyczny
siarczan amonu	Sigma	A9164
Siarczyn sodu	Fluka	71988
Anty-trimetylo-histon H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anty-monometylo-histon H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488 ~ koza ~ anti ~ królik (H + L)	Sonda molekularna	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Jodek propidyny	Sigma	P4170	toksyczny
DAPI	Sigma	D9542	toksyczny
RNAzya A	Roche	10109169001
Słoik z kopliny	Huber & CO	10.055
Kleszcze	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Komora			Plastikowe pudełko z wilgotnym ręcznikiem papierowym w środku, do pudełka wkłada się plastikową podpórkę do podparcia zjeżdżalni i utrzymania zjeżdżalni przed wodą.
Prowadnica Superfrost Plus	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä ser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek