Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Podsumowanie

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Streszczenie

U roślin kwitnących, przejście od losu komórek somatycznych do rozrodczych jest zaznaczone przez specyfikację komórek macierzystych zarodników (SMC) w organach kwiatowych dorosłej rośliny. Samica SMC (komórka macierzysta megaspory, MMC) różnicuje się w zawiązku zalążka i ulega mejozy. Wyselekcjonowana haploidalna megaspora przechodzi następnie mitozę, tworząc wielokomórkowy żeński gametofit, który da początek gametom, komórce jajowej i komórce centralnej, wraz z komórkami dodatkowymi. Ograniczona dostępność MMC, mejocytów i żeńskiego gametofitu wewnątrz zalążka stanowi techniczne wyzwanie dla analiz cytologicznych i cytogenetycznych na poziomie pojedynczej komórki. W szczególności bezpośrednia lub pośrednia immunodetekcja epitopów komórkowych lub jądrowych jest upośledzona przez słabą penetrację odczynników do wnętrza komórki roślinnej, a obrazowanie pojedynczych komórek jest utrudnione przez brak przejrzystości optycznej w tkankach pełnomocowanych.

Dlatego opracowaliśmy skuteczną metodę analizy organizacji jądra i modyfikacji chromatyny w wysokiej rozdzielczości pojedynczej komórki w zalążkach Arabidopsis osadzonych w całości. Polega ona na rozwarstwieniu i zatopieniu utrwalonych zalążków w cienkiej warstwie żelu akrylowego na mikroskopijnym szkiełku. Osadzone zalążki poddawane są zabiegom chemicznym i enzymatycznym mającym na celu poprawę klarowności tkanek i przepuszczalności odczynników do barwienia immunologicznego. Zabiegi te zachowują organizację komórkową i chromatynę, DNA i epitopy białek. Próbki mogą być wykorzystywane do różnych dalszych analiz cytologicznych, w tym barwienia immunologicznego chromatyny, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i barwienia DNA do analizy heterochromatyny. Obrazowanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) o wysokiej rozdzielczości, a następnie rekonstrukcja 3D pozwala na pomiary ilościowe w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

U roślin kwitnących, tworzenie linii rozrodczych zaczyna się od różnicowania SMC, żeńskiego MMC i męskiego mikrosporu komórki macierzystej. MMC rozwija się z podnaskórkowej komórki jądrowej na dystalnym końcu zalążka zalążka, a komórka macierzysta mikrospor rozwija się z tkanki sporogennej w pylniku, które znajdują się głęboko w narządach kwiatowych¹. SMC przechodzą mejozę w celu wytworzenia haploidalnych zarodników, które następnie powodują powstawanie gametofitów po mitozie. Żeński gametofit, czyli worek zarodkowy, składa się z jednej komórki jajowej, jednej komórki centralnej, dwóch synergidów i trzech antypodali. Męski gametofit lub pyłek składa się z jednej komórki wegetatywnej i dwóch plemników. Podczas gdy męski gametofit pozostaje stosunkowo dostępnym obiektem badań, żeński gametofit jest osadzony w zalążku, który sam jest zamknięty w owocolistku kwiatowym, a zatem stanowi szczególne wyzwanie dla analiz molekularnych i cytologicznych. Ostatnio jednak mikrodysekcja wspomagana laserem zaoferowała eleganckie rozwiązanie umożliwiające analizy transkryptomiczne w MMC i żeńskich komórkach gametofitycznych^2-4. Oprócz analiz ekspresji genów kandydujących, wykorzystujących np. hybrydyzację RNA in situ lub testy genów reporterowych, analizy cytologiczne pozwalają na badanie dynamiki endogennych składników komórkowych za pomocą specyficznego bezpośredniego barwienia komórkowego lub pośredniego barwienia immunologicznego. W szczególności barwienie cytogenetyczne za pomocą barwienia FISH i DNA, wraz z barwieniem immunologicznym modyfikacji chromatyny lub składników chromatyny, są kluczowymi podejściami do wyjaśnienia dynamiki chromatyny i organizacji jądrowej u Arabidopsis⁵. Zazwyczaj mejoza pociąga za sobą specyficzną dynamikę chromosomów, która została dobrze zbadana w mejocytach męskich roślin^6,7; Dalsza wielkoskalowa, specyficzna dla komórek reorganizacja chromatyny, prawdopodobnie odzwierciedlająca dynamiczne przeprogramowanie epigenetyczne, została opisana podczas rozwoju pyłku^8-10. W przeciwieństwie do tego, ze względu na względną niedostępność żeńskich mejocytów i gametofitów, badania te pozostają technicznie trudne do zastosowania i często wymagają sekcji lub ręcznej sekcji i trawienia enzymatycznego (patrz poniżej). Ponadto powszechny brak przejrzystości optycznej w pełnym montażu jest przeszkodą w obrazowaniu komórek rozrodczych w nienaruszonych zalążkach w wysokiej rozdzielczości.

Klasyczna metoda cytologicznej analizy organizacji chromosomów w zalążkach z całego wierzchowca wykorzystuje barwienie Feulgena^11-13. Polega ona na kwasowej hydrolizie (przy użyciu kwasu podchlorawego) DNA, która prowadzi do denaturacji białek, a tym samym do zniszczenia struktury chromatyny. Alternatywnie, organizację chromosomów w żeńskich mejocytach i komórkach gametofitycznych można zaobserwować za pomocą barwienia DAPI i barwienia immunologicznego na półcienkich odcinkach lub wypreparowanych woreczkach zarodkowych i MMC (na przykład patrz^14-18). Oczywiste jest jednak, że ręczne preparowanie i cięcie może być pracochłonne i utrudnia jakościową i ilościową analizę dużej liczby epitopów chromatyny.

Tutaj zapewniamy skuteczny protokół do przygotowania dużej liczby zalążków Arabidopsis odpowiednich do różnych dalszych barwień cytologicznych w całym montażu. Krótko mówiąc, pąki kwiatowe inkubuje się w roztworze utrwalającym, rzędy zalążków są wycinane z owocolistka i zatapiane w akrylamidzie na szkiełku, tak jak ma to miejsce w przypadku mejocytów pyłku^19,20. Osadzone zalążki są dalej oczyszczane i utrwalane w metanolu, etanolu i ksylenie przed trawieniem ściany komórkowej i przepuszczalnością. Omówiono możliwe warianty tych kroków. Próbki można następnie wykorzystać do barwienia DNA, barwienia immunologicznego i FISH. Tryb przygotowania jest wydajny i pozwala na równoległe przygotowanie eksperymentów (w ciągu dnia można przygotować do 16 preparatów do różnych analiz końcowych). Opisane zabiegi umożliwiają uzyskanie jednorodnych sygnałów w całej i dobrze zachowanej organizacji histologicznej, komórkowej i jądrowej w komórkach rozrodczych i otaczających komórkach jądrowych, co korzystnie wpływa na jakościowe i ilościowe porównania między typami komórek. Skalibrowane, oparte na CLSM obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, po którym następuje trójwymiarowa rekonstrukcja, umożliwia miarodajne pomiary ilościowe sygnałów fluorescencyjnych. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę procedurę do analizy dynamiki chromatyny w różnicującym MMC²¹ i rozwijającym się żeńskim gametoficie²²; prezentujemy tutaj reprezentatywne wyniki analizy heterochromatyny, barwienia immunologicznego chromatyny, barwienia immunologicznego GFP oraz FISH w zalążkach całych. Ponadto wierzymy, że nasz protokół będzie odpowiedni dla innych tkanek i gatunków roślin.

Protokół

Procedura jest opisana w przepływie pracy na rysunku 1, a konfiguracja do sekcji i zatapiania tkanek jest przedstawiona na rysunku 2.

1. Utrwalenie tkanek

1. Zbierz 20-30 owocolistków w probówce do mikrofugi zawierającej świeżo przygotowany bufor utrwalający BVO na lodzie.
2. Utrwal tkankę przez 30 minut, delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.
3. Odwirować probówki zawierające owocolistki w utrwalaczu w mikrowirówce stołowej przez 1 minutę przy 400 x g.
4. Ostrożnie usunąć bufor utrwalający i dodać 1 ml PBT, umieścić probówki na lodzie.

2. Sekcja i osadzanie

1. Przygotuj pięć probówek Eppendorf z każdymi 200 μl świeżo przygotowanej mieszanki 5% akrylamidu.
2. Przygotuj pięć szkiełek Superfrost wstępnie oczyszczonych 70% etanolem i oznaczonych ołówkiem.
3. Rozmrozić na lodzie jedną porcję 20% APS i 20% NaPS każdy.
4. Weź 4-5 owocolistków z odciętą końcówką, umieść je na czystym szkiełku, usuń nadmiar płynu.
5. Wykonać podłużne nacięcia cienką igłą i oderwać ścianki owocolistka, aby uwolnić rzędy zalążków, jak pokazano na rysunku 2, unikać suszenia przez przykrycie PBS (nie więcej niż 10 μl).
6. Szybko dodaj i wymieszaj 12 μl NaPS, 12 μl APS z podwielokrotnością 200 μl mieszanki akrylamidu.
7. Dodać 30 μl aktywowanego akrylamidu do wypreparowanych zalążków.
8. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 20 x 20 mm, pozostaw do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 45-60 min.
9. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Na tym etapie próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w słoiku Coplin zawierającym PBS.

3. Przetwarzanie tkanek

UWAGA: Wszystkie kroki z wyjątkiem 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 i 3.4.3 są przeprowadzane w słoikach Coplin z 80 ml roztworu pod kapturem chemicznym w temperaturze pokojowej. Szkiełka przenoszone są za pomocą kleszczyków z płaską końcówką.

1. Klarowanie i utrwalanie tkanek:
   1. Inkubować 5 minut w metanolu.
   2. Inkubować przez 5 minut w etanolu.
   3. Inkubować przez 30 minut w etanolu:ksylenie (1:1).
   4. Inkubować przez 5 minut w etanolu.
   5. Inkubować 5 minut w metanolu.
   6. Inkubować 15 minut w metanolu i PBT (1:1), uzupełnione 2,5% formaldehydem.
   7. Płukać 2 x 10 min w PBT. Na tym etapie szkiełka można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Trawienie ściany komórkowej:
   1. Rozmrozić porcję mieszanki do trawienia ściany komórkowej na lodzie.
   2. Weź zjeżdżalnię ze słoika Coplin, odcedź nadmiar płynu, kładąc go pionowo na ręczniku papierowym.
   3. Dodać 100 μl mieszanki do wytrawiania w ścianie komórkowej na podkładkę akrylową i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 23 x 46 mm. Powtórz te czynności dla pozostałych slajdów. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze (opisanej w Materiałach).
   4. Umyj szkiełka 2 x 5 min w PBT.
3. Leczenie RNazy A:
   1. Weź zjeżdżalnię ze słoika Coplin, odcedź nadmiar płynu jak poprzednio.
   2. Inkubować każde szkiełko ze 100 μl RNAseA w stężeniu 100 μg/ml w PBS z 1% Tween-20 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
   3. Myć szkiełka przez 2 x 5 minut w PBT.
4. Po utrwaleniu i przepuszczalności:
   1. Post-fix przez 20 minut w świeżo przygotowanym PBT-F.
   2. Płukać szkiełka przez 10 minut w PBT.
   3. Przepuszczalność przez 2 godziny w PBS z 2% Tween-20 w temperaturze 4 °C.
   4. Płukać szkiełka przez 2 x 5 min w PBT.

4. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Na tym etapie należy przetestować optymalne stężenie przeciwciała pierwszorzędowego, używając różnych rozcieńczeń (1:200, 1:500, 1:1000) przeciwciał.

1. Inkubować każde szkiełko ze 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBS z 0,2% Tween-20 przez 12-24 godziny w temperaturze 4 °C.
2. Myj szkiełka w PBT przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej pod delikatnym wstrząsaniem.
3. Zastosować przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:200 w PBS + 0,2% Tween-20 przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
4. Myj szkiełka w PBT przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym wstrząsaniem.
5. Barwieć przeciw barwieniu 10 μg/ml jodku propidyny w PBS przez 15 minut, a następnie płukać przez 15 minut w PBS pod delikatnym wstrząsem, w temperaturze pokojowej.
6. Zamontuj w płynnym utrwalaczu zapobiegającym blaknięciu uzupełnionym 10 μg/ml jodku propidyny. Pozwól medium montażowemu stwardnieć przez 1 godzinę przed uzyskaniem obrazów za pomocą CLSM.

5. Obrazowanie ilościowe

1. Akwizycja obrazu:
   1. Uzyskuj obrazy o wysokiej rozdzielczości za pomocą CLSM, najlepiej przy użyciu trybu skanowania rezonansowego, który umożliwia lepsze zachowanie sygnałów fluorescencyjnych przy długotrwałym obrazowaniu²³, oraz soczewki zanurzeniowej z glicerolem 63X.
   2. Przetestuj parametry akwizycji, takie jak intensywność lasera, wzmocnienie, otwór, rozmiar woksela i współczynnik powiększenia na początku eksperymentu, aby zdefiniować standardową procedurę akwizycji, której należy ściśle przestrzegać na wszystkich slajdach, aby uzyskać spójne pomiary ilościowe.
   3. Sprawdź brak przesłuchów między fluorochromami. Jeśli jest obecny, skonfiguruj skanowanie sekwencyjne. Obrazy transmisyjne należy pobierać oddzielnie, a nie jednocześnie.
   4. Wykonuj szeregową, trójwymiarową akwizycję obrazu z najwyższą możliwą rozdzielczością w wymiarach x i y oraz z 2x nadpróbkowaniem w wymiarze z (reguła Nyquista).
2. Przetwarzanie obrazu:
   1. Rekonstruuj obrazy seryjne w trzech wymiarach za pomocą oprogramowania komercyjnego lub open source.
   2. Zdefiniuj powierzchnie konturu wokół każdego jądra (lub komórki) zainteresowania w 3D.
   3. Określ ilościowo fluorescencję w każdym kanale jako sumę intensywności pikseli w każdym obiekcie.
   4. Eksport danych do Excela w celu przeprowadzenia analiz statystycznych. Normalizuj sygnały przeciwciał przeciwko np. sygnałom barwienia DNA.

Wyniki

Przedstawiamy sprawdzony protokół wielkoskalowego przygotowania i przetwarzania zalążków Arabidopsis, odpowiedni do barwienia cytologicznego w preparatach całych (whole-mount). Dzięki zatopieniu w medium zalążki zachowują strukturę trójwymiarową (Rysunek 3). Ponadto przetwarzanie tkanek, w tym ich klarowanie optyczne, umożliwia obrazowanie struktur subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości. Rysunek 4 przedstawia barwienie DNA w całych prymordiach zalążków, gdzie heterochromatyna ...

Dyskusja

U roślin kwitnących żeńska linia rozrodcza jest otoczona kilkoma warstwami komórek, w tym jądrem i osłonkami zalążka, co sprawia, że barwienie cytologiczne w całości jest technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczny protokół umożliwiający przygotowanie i przetworzenie dużej liczby zalążków nadających się do barwienia cytologicznego, takiego jak barwienie immunologiczne, barwienie DNA i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całości. Z powodzeniem wykorzystaliśmy go do analizy żeńskiej reprodukcyjnej...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory
BVO Bufor utrwalający (na podstawie32)			2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldehyd, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2,5% (v/v) formaldehyd
30% Akrylamid:bisakryloamid			3 g akrylamidu, 0,33 g bisakryloamidu, 1x PBS (przygotować 10 ml, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C)
200 ml 5% mieszanki akryloamidu w PBS			34 ml 30% akryloamidu: bisakryloamidu, 166 ml 1x PBS (świeży z 30% bulionu)
20% siarczanu			amonu 0,2 g siarczanu amonu, 1 ml sterylnej wody (przygotować podwielokrotności z 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °; C)
20% siarczyn			sodu 0,2 g siarczynu sodu, 1 ml sterylnej wody (przygotować porcje z 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °; C)
		enzymów ściany komórkowej	0,5% (w/v) celulazy, 1% (w/v) drylazy, 0,5% (w/v) pektoliazy
Odczynniki i materiały
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Etanol	Schaurlau	ET00102500
Metanol	Schaurlau	ME03062500
ksylen	ROTH	4436.1
Celulaza	Sigma	1794
Drisolase	Sigma	D8037
pektolyaza	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
akrylamid	Sigma	A-3553
bisakryloamid	Sigma	M2022	toksyczny
siarczan amonu	Sigma	A9164
Siarczyn sodu	Fluka	71988
Anty-trimetylo-histon H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anty-monometylo-histon H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488 ~ koza ~ anti ~ królik (H + L)	Sonda molekularna	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Jodek propidyny	Sigma	P4170	toksyczny
DAPI	Sigma	D9542	toksyczny
RNAzya A	Roche	10109169001
Słoik z kopliny	Huber & CO	10.055
Kleszcze	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Komora			Plastikowe pudełko z wilgotnym ręcznikiem papierowym w środku, do pudełka wkłada się plastikową podpórkę do podparcia zjeżdżalni i utrzymania zjeżdżalni przed wodą.
Prowadnica Superfrost Plus	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä ser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek

Mieszanka wilgotnościowa