Ocena specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój twarzoczaszki za pomocą chimer kaczki przepiórczej

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę generowania embrionów chimerycznych, które są przeznaczone do testowania specyficznego dla gatunku wkładu grzebienia nerwowego i/lub innych tkanek w rozwój twarzoczaszki.

Streszczenie

Generowanie chimerycznych embrionów to szeroko rozpowszechnione i skuteczne podejście do badania losów komórek, interakcji tkankowych i specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój histologiczny i morfologiczny zarodków kręgowców. W szczególności wykorzystanie zarodków chimerycznych ustaliło znaczenie grzebienia nerwowego w kierowaniu specyficzną dla gatunku morfologią kompleksu twarzoczaszki. Opisana tu metoda wykorzystuje dwa gatunki ptaków, kaczkę i przepiórkę, o niezwykle różnej morfologii twarzoczaszki. Metoda ta znacznie ułatwia badanie molekularnej i komórkowej regulacji specyficznego dla gatunku wzorca w kompleksie twarzoczaszki. Eksperymenty na chimerycznych zarodkach przepiórek i kaczek ujawniły już interakcje tkankowe za pośrednictwem grzebienia nerwowego i autonomiczne zachowania komórkowe, które regulują specyficzny dla gatunku wzór w szkielecie twarzoczaszki, mięśniach i powłokach. Ogromna różnorodność pochodnych grzebieni nerwowych sugeruje znaczny potencjał przyszłych zastosowań systemu chimerycznego przepiórka-kaczka do zrozumienia rozwoju, chorób i ewolucji kręgowców.

Wprowadzenie

Szkielet twarzy rozwija się w wyniku wzrostu i fuzji wielu procesów twarzy, które składają się z grzebienia nerwowego i mezenchymii mezenchymów otoczonych warstwami nabłonka ektodermalnym i endodermalnym^1-11. Zdarzenia morfogenetyczne w każdym procesie są regulowane przez odrębne interakcje sygnalizacyjne między mezenchymą a otaczającym nabłonkiem^12-16. Zmiany w tych oddziaływaniach sygnalizacyjnych i/lub ich efektorach przyczyniają się do fenotypów choroby i mogą być również istotne dla ewolucji szkieletu twarzoczaszki ^17,18. W związku z tym wyjaśnienie czasu i charakteru interakcji tkankowych ma ogromny potencjał, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii rozwojowej i ewolucyjnej twarzoczaszki.

Wykorzystanie chimerycznych embrionów do badania interakcji tkankowych ma długą historię w biologii rozwojowej. Podejście to zostało zapoczątkowane przez Hansa Spemanna i jego laboratorium, którzy odkryli embrionalne "organizatory" poprzez przeszczepianie tkanek między zarodkami różnych gatunków. Spemann był mistrzem technik mikrochirurgicznych, którego umiejętności manualne zostały uzupełnione przez opracowanie specjalistycznych narzędzi, w szczególności pipety Spemann. Viktor Hamburger był doktorantem w laboratorium Hansa Spemanna we Freiburgu w latach dwudziestych XX wieku, kiedy to przeprowadzono pierwsze eksperymenty transplantacyjne, które doprowadziły do Nagrody Nobla dla Spemanna. Kiedy Hamburger przeniósł się na Uniwersytet Waszyngtoński w St. Louis w 1935 roku, szczegółowo opisał proces tworzenia mikropipety Spemann w swoim Podręczniku embriologii eksperymentalnej¹⁹. Drew Noden był doktorantem w laboratorium Hamburgera na Uniwersytecie Waszyngtońskim do 1972 roku. Po przeniesieniu się na University of Massachusetts w Amherst, a następnie na Cornell University, Noden kontynuował produkcję i używanie mikropipet Spemann do swoich przeszczepów chirurgicznych z udziałem chimerów przepiórek i piskląt. Podczas studiów magisterskich jeden z autorów (Rich Schneider) szkolił się z Drew Nodenem na Uniwersytecie Cornella w latach 1995-1998. Poniższy protokół tworzenia mikropipety Spemann opiera się na opisach napisanych przez Hamburgera i Nodena i zawiera późniejsze modyfikacje dokonane przez Schneidera.

Wykorzystanie chimer piskląt przepiórczych do badania rozwoju twarzoczaszki, a zwłaszcza do zrozumienia wkładu komórek grzebienia nerwowego, zostało zapoczątkowane przez Nodena i Le Douarina na początku lat siedemdziesiątych, recenzowane w Le Douarin et al²⁰. Podejście to zostało szeroko przyjęte w wielu badaniach i przez wielu innych badaczy 1,4,5,21-38. Równoważne tempo wzrostu i morfologii przepiórek i piskląt sprawia, że przeszczepy w ich obrębie są idealne do badania losu komórek i śledzenia linii. Jednak ze względu na podobieństwa między przepiórką a pisklęciem, zmiany morfologiczne wywołane przez komórki dawcy są trudne do rozszyfrowania. W przeciwieństwie do tego, inne systemy chimeryczne ptaków obejmowały kaczkę domową jako sposób badania mechanizmów, które sprawiają, że zarodki różnią się anatomicznie^39-50. Mówiąc dokładniej, system chimeryczny przepiórka-kaczka oferuje wiele korzyści w rozpoznawaniu wpływu dawcy na gospodarza i odwrotnie. Po pierwsze, zarodki przepiórek i kaczek różnią się wielkością i kształtem ciała, co zapewnia bezpośredni sposób na zbadanie specyficznych dla dawcy lub gospodarza mechanizmów tworzenia wzorców poprzez oznaczanie różnych domen ekspresji genów (ryc. 1 A i B). Po drugie, zarodki przepiórek i kaczek mają znacznie różne tempo dojrzewania, przy czym przepiórki wykluwają się w ciągu 17 dni, a kaczki w ciągu 28 dni. Przeszczepiony grzebień nerwowy zachowuje swoje wewnętrzne tempo dojrzewania w środowisku gospodarza, a zatem możliwa jest identyfikacja czasowych zmian w ekspresji genów, interakcjach tkankowych, histogenezie i morfogenezie^51-57. Wreszcie, przeciwciało jądrowe przeciw przepiórkom (Q¢PN) pozwala na trwałe odróżnienie od siebie wkładów komórkowych dawcy i gospodarza poprzez rozpoznanie białka, które jest wszechobecne w komórkach przepiórczych, ale nieobecne w komórkach kaczki.

Protokół

1. Przygotuj igły wolframowe

1. Przetnij pręt wolframowy na pół za pomocą nożyc do drutu, aby pręt się nie zginał.
2. Przeciągnij pręt przez stożkowy koniec pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego o grubości 5 3/4 cala.
3. Pozostawiając około 3/4 cala pręta wystającego ze szkła, przyklej pręt do końcówki pipety za pomocą małej kulki "kleju topliwego" (HMA), który jest klejem w sztyfcie używanym w pistolecie do klejenia. HMA należy szybko stopić w płomieniu alkoholowym, uważając, aby nie spalić kleju i nie wytworzyć czarnego dymu.
4. Za pomocą kleszczy zegnij końcówkę pręta wolframowego (około 1/4 cala od górnego końca), aż do osiągnięcia kąta 45°.
5. Trzymając pipetę Pasteura, umieść około 1/8 cala końcówki pręta wolframowego w płomieniu palnika propanowego. Trzymaj końcówkę stabilnie i dokładnie prostopadle do płomienia.
6. Wyciągnij igłę z płomienia w momencie, gdy z igły odleci maleńka pomarańczowa plamka wolframu.

2. Przygotuj pipety Spemann

1. Za pomocą palnika Bunsena podgrzej wąską końcówkę pipety Pasteura, aż szklanka znajdująca się tuż za stożkiem zacznie się topić. Zdejmij z ognia i pociągnij końcówkę, aż pipeta się uszczelni. Upewnij się, że pozostała część stożkowej części, która ma średnicę zewnętrzną około 0.7-1.0 mm. Oderwij uszczelniony koniec około 4 cm od stożka.
2. Przymocuj około 2 stopy (60 cm) gumowej rurki do szerokiego (otwartego) końca pipety. Przedmuchaj drugi koniec gumowej rurki, aby upewnić się, że powietrze nie może przejść przez stożkową część pipety Pasteura.
3. Używając butli z propanem z dołączoną palnikiem ołówkowym, podgrzej owalny obszar po jednej stronie pipety, tuż poniżej początku stożka. Wdmuchuj powietrze bardzo delikatnie i stale przez gumową rurkę z niewielkim naciskiem (w przybliżeniu ciśnienie potrzebne do wypowiedzenia początku litery "P" na poziomie rozmowy). Gdy szkło stanie się miękkie z jednej strony i zacznie wyginać się na zewnątrz, szybko zdejmij pipetę z płomienia i mocno i równomiernie przedmuchaj gumową rurkę. Spowoduje to, że rozgrzana część szklanki utworzy bąbelek w kształcie kiełbasy, który może pęknąć, co jest w porządku. Jeśli bańka jest za mała, spróbuj ponownie stopić i wydmuchać szklankę. Ostatnie otwarte okienko w szybie powinno mieć około 0,25 cala (6,35 mm) szerokości i 0,5 cala (12,7 mm) długości.
4. Kierując zwężającą się końcówkę do góry, zeskrob bańkę do szklanego pojemnika na odpady, delikatnie przedmuchując rurkę, aby zapobiec przedostawaniu się odłamków szkła do pipety.
5. Za pomocą płomienia propanu wypal pozostałe krawędzie bańki i wypoleruj ogniem boki otwartego okna. Uważaj, aby nie stopić trzonu pipety.
6. Za pomocą ołówka diamentowego naciąć stożkowy koniec pipety w odległości około 1,25 cala (30 mm) od okienka i odłamać końcówkę kleszczami, tak aby otwór pipety został czysto przycięty (wyrzuć pipety z połamanymi lub nierównymi końcówkami).
7. Za pomocą kleszczy i krawędzi płomienia z palnika alkoholowego zegnij wąską część pipety o 0,375 cala (9,5 mm) od końcówki pod kątem około 60°, tak aby wygięta część znajdowała się w płaszczyźnie pionowej, gdy otwór okienka znajduje się w pozycji 1:00 dla osób praworęcznych i 11:00 dla osób leworęcznych. Ten krok najlepiej wykonać w obudowie bez przeciągów.
8. Wypoleruj końcówkę ogniowo za pomocą płomienia alkoholowego pod mikroskopem preparacyjnym. Pamiętaj, aby nie zamykać końcówki, ale raczej utrzymuj otwór okrągły i gładki bez żadnych zwężeń.
9. Wytnij kawałek gumowej rurki o średnicy 1 cala (25 mm), spryskaj kawałek rurki 70% etanolem i nasuń rurkę na trzon pipety, aż otwór okienka zostanie całkowicie zakryty. Pełni ona funkcję "membrany" pipety Spemann.
10. Umieść gruszkę o pojemności 2 ml z gumy lateksowej na otwartym dnie pipety. Bańka utrzymuje podciśnienie w pipecie Spemanna.
11. Aby ćwiczyć korzystanie z pipety Spemanna, przenieś pod mikroskopem kulki chromatograficzne o średnicy około 100-200 μm z zaznaczonego miejsca na jednej szalce Petriego do zaznaczonego miejsca w innym.
12. Aby wyczyścić pipetę Spemann, wyjmij gumową gruszkę i umieść pipetę przechyloną w dół w wysokiej zlewce wyłożonej bawełną lub gazą na dnie i wypełnionej wodą destylowaną i detergentem do szkła.

3. Sterylizuj i inkubuj jaja

1. Przetrzyj jajka 70% etanolem i umieść jajka na plastikowych tackach na jajka.
2. Jaja należy umieścić w podgrzewanym inkubatorze w temperaturze 37,5 °C i 85-87%.
3. Wysiaduj jaja, aż osiągną HH9,5, około 26 godzin dla przepiórek i 48 godzin dla kaczki.

4. Jaja okienne

1. Usuń mały kawałek zewnętrznej skorupy z wierzchu jajka za pomocą kleszczy, uważając, aby nie przebić wewnętrznej błony skorupy.
2. Za pomocą strzykawki z igłą o wymiarach 18 G na 1 cal należy zrobić otwór w najwęższym końcu jajka i pobrać około 1-2 ml białka.
3. Umieść przezroczystą taśmę na otworze i ślad nakłucia w skorupie.
4. Wytnij "okno" wzdłuż górnej powierzchni jajka (przez przezroczystą taśmę) za pomocą zakrzywionych nożyczek.

5. Wizualizacja zarodków i przygotowanie do operacji

1. Za pomocą szklanej pałeczki delikatnie przetrzyj zarodek niewielką ilością Neutral Red (0,02 g/ml w BSS Hanka).
2. Przetnij błonę witeliny i przeciągnij ją po zarodku za pomocą zaostrzonej płomieniem igły wolframowej.
3. Ponownie zamknij jajko, umieszczając przezroczystą taśmę na oknie.

6. Oddziel tkankę dawcy od zarodka dawcy

1. Usuń taśmę z okienka na komórce jajowej zarodka dawcy.
2. Aby przeciąć fałd nerwowy z sąsiedniej ektodermy zarodka dawcy, wykonaj szczeliny po obu stronach cewy nerwowej za pomocą naostrzonej płomieniem igły wolframowej (wyprodukowanej zgodnie z powyższym opisem).
3. Następnie przeciąć cewę nerwową na pożądanym przednim i tylnym poziomie przeszczepu i oddzielić przeszczep od reszty cewy nerwowej.
4. Usunąć fałd nerwowy z zarodka dawcy za pomocą pipety Spemann lub innej mikropipety.
5. Następnie usuń taśmę z okienka na komórce jajowej gospodarza i za pomocą pipety Spemann umieść fałd nerwowy dawcy obok zarodka gospodarza w sąsiedztwie obszaru cewy nerwowej, która zostanie przeszczepiona.

7. Oddziel tkankę gospodarza i przeszczep tkankę dawcy

1. Oddziel fałd nerwowy od cewy nerwowej zarodka gospodarza, tak jak w przypadku dawcy. Należy pamiętać o usunięciu przeszczepu o takiej samej wielkości jak tkanka dawcy.
2. Delikatnie odepchnij tę tkankę gospodarza daleko od zarodka.
3. Następnie igłą wolframową lub zaokrągloną końcówką mikropipety delikatnie przesuń fałd nerwowy dawcy do cewy nerwowej gospodarza, utrzymując prawidłową orientację przednio-tylną i grzbietowo-brzuszną. Upewnij się, że przeszczep jest schowany po bokach, ale pamiętaj, aby nie szturchnąć ani nie uszkodzić leżących pod spodem tkanek. Aby pomóc w śledzeniu pierwotnej orientacji, zwróć uwagę na asymetrię w tkance dawcy lub barwienie różnicowe od neutralnej czerwieni. Dokumentujemy również fotograficznie zarodek dawcy wraz z towarzyszącą mu wyciętą tkanką, a także chimerę bezpośrednio po operacji.
4. Do komórki jajowej należy dodać sterylną sól fizjologiczną, jeśli zarodek gospodarza wykazuje oznaki wysuszenia.
5. Teraz ostrożnie ponownie zamknij i oznacz jajo, a następnie delikatnie umieść je w inkubatorze o wysokiej wilgotności (70-80%), gdzie chimeryczny zarodek może rozwinąć się do pożądanego etapu analizy.

8. Kolekcja Chimer

1. Pamiętaj, aby zebrać chimeryczne zarodki w świeżo przygotowanym zimnym utrwalaczu Serry i natychmiast umieścić je na kołysce w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia O/N. Pozwoli to na bardziej czułe wykrywanie komórek przepiórczych za pomocą przeciwciała anty-przepiórczego.
2. W przypadku analiz ekspresji genów za pomocą RT-qPCR, zarodki należy zamrozić bezpośrednio w ciekłym azocie przed ekstrakcją RNA.

Wyniki

Przed dalszą analizą, skuteczność przeszczepu musi zostać oceniona. W przypadku analiz histologicznych, morfologicznych lub ekspresji genów na próbkach tkanek komórki przepiórcze powinny być wykrywane za pomocą immunohistochemii przy użyciu przeciwciała Q¢PN, jak opisano³⁶. W przypadku analiz RNA specyficzny dla danego gatunku wkład w tkanki będące przedmiotem zainteresowania można obliczyć przy użyciu strategii opartej na PCR⁵⁸. Po potwierdzeniu skuteczności przeszczepu można ocenić dalsze morfologiczne lub molekularne pomiary wyników w chimerach. Interakcje między komórkami grzebienia nerwowego dawcy a otaczającymi tkankami pochodzącymi od gospodarza, które leżą u podstaw prawidłowej histogenezy i morfogenezy kompleksu twarzoczaszki, były wcześniej szeroko badane. W szczególności mezenchyma grzebienia nerwowego kieruje specyficzną dla gatunku morfologią twarzy 7,13,51,59, wzoru piór ⁵², wzoru mięśni⁵⁶ i chrząstki^53,57 poprzez regulację ekspresji genów gospodarza. Na przykład mezenchyma grzebienia nerwowego decyduje, kiedy kość tworzy się w żuchwie, regulując czasowo ekspresję Bmp4 ⁵⁵.

Ostatnio, badania koncentrowały się na interakcjach tkankowych zachodzących bardzo wcześnie w rozwoju twarzoczaszki. W związku z tym eksperymenty z wykorzystaniem chimer kaczek przepiórczych wykazały, że zarodki gospodarza wpływają na migrację grzebieni nerwowych poprzez określanie granic morfologicznych. Oznacza to, że w chimerycznych zarodkach quck komórki grzebienia nerwowego przepiórki dawcy migrują do łuku żuchwowego kaczki gospodarza w sposób podobny do kaczki (ryc. 1D). Pomimo tego wkładu gospodarza w wielkość populacji grzebienia nerwowego, grzebień nerwowy dawcy nadal generuje szkielet żuchwy, który jest podobny do przepiórki pod względem wielkości i kształtu (ryc. 1E).

Rysunek 1. System chimeryczny przepiórka-kaczka. (A) czaszki przepiórek i (B) kaczek wykazują znaczne różnice w wielkości i kształcie, a stąd idealnie nadają się do użycia systemu chimerycznego do badania rozwoju twarzoczaszki (zmodyfikowanego z Tokia et al.^{Rozdział 56}). (C) Eksperymentalny projekt generowania jednostronnych chimerycznych zarodków quck z dopasowanych do stadium zarodków przepiórek i kaczek HH9.5. Fałd nerwowy jest usuwany z jednej strony zarodków przepiórczych i przeszczepiany do zarodków kaczek po usunięciu równoważnego fragmentu fałdu nerwowego. (D) Komórki dawcy przepiórki (zielone) można obserwować w chimerach za pomocą przeciwciała antyprzepiórczego (Q¢PN), jak pokazano w widoku brzusznym chimerycznego zarodka HH12. (F) W żuchwach kuczka w HH38 chrząstka Meckla pochodząca od dawcy przepiórki jest krótsza i prostsza niż obserwowana w przypadku chrząstki Meckla pochodzącej od gospodarza kaczki przeciwległej, która jest większa i zakrzywiona. Przedruk Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) za zgodą Elsevier.

Dyskusja

Grzebień nerwowy to przejściowa populacja komórek embrionalnych, która intensywnie migruje w całym zarodku i różnicuje się w różne typy komórek, w tym chondrocyty i osteoblasty, które przyczyniają się do szkieletu twarzoczaszki. Przeszczepienie grzebienia nerwowego w układzie chimerycznym przepiórki i kaczki w znacznym stopniu przyczyniło się do naszego zrozumienia interakcji tkankowych i szlaków sygnałowych, które regulują rozwój szkieletu twarzoczaszki. Jednak biorąc pod uwagę ogromny potencjał grzebienia nerwowego do generowania komórek mięśni gładkich, adipocytów, melanocytów, komórek Schwanna i neuronów, system chimery przepiórki i kaczki ma ogromny potencjał dla przyszłych zastosowań, szczególnie w połączeniu z szybkim postępem biologii komórek macierzystych i medycyny regeneracyjnej. Ponieważ zarówno przepiórka, jak i kaczka są gatunkami hodowanymi komercyjnie, w różnych gospodarstwach dostępna jest łatwa dostawa stosunkowo niedrogich zapłodnionych jaj. W związku z tym technika ta powinna być dostępna dla badaczy działających w szerokim zakresie budżetów i przestrzeni obiektu.

Chociaż ta technika jest bardzo potężna, pozostaje kilka ograniczeń. Podobnie jak w przypadku innych technik chirurgicznych, jakość i żywotność chimer przepiórek zależy od umiejętności chirurgicznych badacza, a zatem będzie więcej różnic między- i wewnątrzosobniczych między eksperymentami w porównaniu z innymi modelami, takimi jak te wykorzystujące genetykę myszy. Co więcej, istnieją również różnice w tempie rozwoju i etapach rozwoju poszczególnych zarodków, co przyczynia się do odtwarzalności i powodzenia każdego przeszczepu. Ptasie zarodki są również bardzo podatne na odwodnienie, dlatego kluczowe kroki podczas operacji obejmują utrzymywanie niskiego poziomu światła, czas spędzony pod mikroskopem do minimum, zamykanie jaj taśmą w jak największym stopniu oraz wysoką wilgotność w inkubatorze pooperacyjnym, aby uniknąć wysuszenia.

Jeśli chodzi o żywotność chimer, zwykle przeżywa od 50 do 75%, chociaż odsetek ten może się zmniejszać wraz z wiekiem etapu pobierania. Podczas typowej 4-6 godzinnej sesji chirurgicznej doświadczony chirurg może wygenerować 10-15 chimer. Sukces przeszczepów zależy również w dużej mierze od jakości narzędzi. Dobre narzędzia prowadzą do bardziej spójnych, powtarzalnych wyników. Użycie palnika propanowego do produkcji igieł wolframowych pozwala na wykonanie niezwykle ostrych igieł. Rodzaj użytej pochodni ma duże znaczenie, ponieważ kontroluje wielkość płomienia. Można również zastosować ostrzenie elektrolityczne, ale takie podejście nawet nie zbliża się do produkcji igieł tak ostrych. Użyj prętów wolframowych zamiast nawiniętego drutu, aby igły można było wyprostować.

Mikropipeta firmy Spemannow, choć czasochłonna i trudna do wykonania, jest idealnym narzędziem do transferu tkanek. Pipetę można dostosować do różnych rozmiarów otworów i można jej używać wielokrotnie. Kluczowym czynnikiem przy użyciu mikropipety Spemann jest posiadanie pewnej ilości płynu w pipecie przed dotknięciem końcówki do powierzchni zarodka. Część płynu zawsze wypływa na zewnątrz, gdy dojdzie do kontaktu z łąkotką nad zarodkiem. Naciśnięcie na membranę pozwala na bardzo precyzyjne wyrzucenie płynu i tkanki przeszczepu, podczas gdy lekkie puszczenie na membranie delikatnie zasysa tkankę przeszczepu dawcy do pipety. Utrzymanie niewielkiego dodatniego ciśnienia na membranie utrzymuje tkankę przeszczepu dawcy na końcówce pipety podczas transferu, A niewielki dodatkowy nacisk na przeponę pozwala na celowe umieszczenie tkanki przeszczepu dawcy w gospodarzu.

W celu ochrony pipety Spemann podczas przechowywania i sterylizacji, wyjmij gruszkę z szerokiego końca i ostrożnie włóż stożkową końcówkę do bańki. Umieść pipetę Spemann w szklanej probówce, przykryj górną część folią aluminiową i autoklaw przed zabiegiem. Po tym, jak wiele pipet jest gotowych do ponownej sterylizacji do zabiegu chirurgicznego, odwróć pipety, podgrzej je prawie do wrzenia w tym samym roztworze wody destylowanej i detergentu do szkła, a następnie kilkakrotnie spłucz wodą destylowaną. Pipety do autoklawowania w ich indywidualnych probówkach. Gumowa rurka tworząca membranę i gumowa bańka powinny być wymieniane po kilku sterylizacjach lub gdy staną się ciemne i sztywne.

Wiele elementów tego protokołu wiąże się z niebezpiecznym sprzętem. Na przykład procedura wytwarzania mikropipet Spemann obejmuje trzy rodzaje płomieni, a także podgrzewanie, ciągnięcie, przedmuchiwanie, gięcie, cięcie i polerowanie szkła. Dlatego noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), które zwiększają bezpieczeństwo, takich jak gogle i fartuch laboratoryjny, ma kluczowe znaczenie. Ponadto, ponieważ wiele osób cierpi na alergie na jajka lub może się z nimi rozwinąć, zawsze używaj rękawiczek podczas obchodzenia się z jajkami. Mając na uwadze te środki ostrożności, system chimeryczny kaczki przepiórczej jest bezpieczną, wydajną i stosunkowo dostępną metodą, która ma wiele przyszłych zastosowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x PBS	TEK	TEKZR114
Hank' s BSS bez czerwieni fenolowej	Invitrogen	14025-092
Neutral Red	Sigma Aldrich	N4638-5G	0,22 µ m Igły
18 G		BD
5 ml	Kleszcze
nr 5	Narzędzia do nauki	11252-20
Nożyczki proste	Narzędzia do nauki	14028-10
Nożyczki zakrzywione	Narzędzia do nauki o naprawach	14029-10
Pipeta		Spemann	Ręcznie robiony w laboratorium
Uchwyt			Szklana popielniczka i modelina
Palnik alkoholowy	Fisher	04-245-1
Przezroczysta taśma	3M Scotch	600
Szklany pręt do mieszania	Fisher	11-380C	Końcówka jest zwężona i zaokrąglona za pomocą płomienia
Drut wolframowy (0,004 x 3 cale)	A-M Systems	7190	Końcówka jest naostrzona płomieniem w palniku propanowym
Palnik	Bunsun Fisher Scientific	S49117
Pipeta Pasteura	Fisherbrand	22-183-632	9-calowa (229 mm)
rurka gumowa	Fisher Scientific	14-178C	bursztynowa, cienkościenna kauczuk naturalny; grubość ścianki: 0,0625 cala / 1,6 mm; OD OD: 0,375 cala / 9,5 mm; ID: Butla z propanem 0,25 cala / 6,4 mm
	BernzOmatic	UL2317	TX-9 z latarką typu "A" z przykręcaną mosiężną latarką "płomienia ołówka"
Ołówek diamentowy Fisher	Scientific	22-268912
Żarówki gumowe	Fisherbrand	S32325