Artykuł metodologiczny

Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51535

⸱

10 lipca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geotechnical and Structures Laboratory, U.S. Army Engineer Research and Development Center, 2Department of Mechanical Engineering, University of Alabama, 3Environmental Laboratory, U.S. Army Engineer Research and Development Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metody używane do badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali szpatułki Atractosteus (A. szpatułka) za pomocą nanowgłębienia, spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (X-ray CT). Wyniki eksperymentów wykorzystano do zbadania zasad projektowania ochronnych materiałów biologicznych.

Streszczenie

Hierarchiczna architektura ochronnych materiałów biologicznych, takich jak zmineralizowane łuski ryb, muszle ślimaków, rogi barana, poroże i skorupy żółwi, dostarcza unikalnych zasad projektowania z potencjałem do kierowania projektowaniem materiałów i systemów ochronnych w przyszłości. Niezbędne jest zrozumienie zależności między strukturą a właściwościami tych systemów materiałowych w mikroskali i nanoskali, w których rozpoczyna się awaria. Obecnie techniki eksperymentalne, takie jak nanoindentacja, tomografia rentgenowska i SEM, zapewniają naukowcom sposób na skorelowanie zachowania mechanicznego z hierarchicznymi mikrostrukturami tych układów materialnych1-6. Jednak obecnie nie jest dostępna dobrze zdefiniowana standardowa procedura przygotowania próbek zmineralizowanych biomateriałów. W pracy przedstawiono metody badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali A. spatula z wykorzystaniem nanowgłębienia, FTIR, SEM, z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii (EDX) oraz rentgenowską tomografią komputerową.

Wprowadzenie

Badacze badają biomateriały strukturalne i starają się wyjaśnić zasady projektowania, które zapewniają biomateriałom strukturalnym lepsze właściwości mechaniczne, takie jak znacznie wyższa wytrzymałość i wytrzymałość w porównaniu do ich indywidualnych składników. Badania nad zasadami projektowania opancerzonych rybich łusek dla Pagrus major7, Polypterus senagalus2,6, Arapaima gigas3, Cyprinus carpio4 i Atractosteus spatula1 wykazały potrzebę rozszerzenia zastosowania istniejących metod eksperymentalnych do badania reakcji strukturalnych i cech mikrostrukturalnych, ponieważ szczegółowe standardowe procedury nie są dostępne dla tych typów materiały i eksperymenty.

Wśród różnych omawianych opancerzonych rybich łusek, A. patula, jest historycznie szczytowym drapieżnikiem centralnego US8 i jest gatunkiem o wysoce zmineralizowanych łuskach. Gatunek ten wymienia masę mięśniową na masę skóry, aby uzyskać lepszy system obrony przed drapieżnikami w porównaniu z rybami o porównywalnej wielkości, o których wspomniano wcześniej9. Według Page'a i Burra10, A. spatula jest trzecią co do wielkości rybą słodkowodną w Ameryce Północnej, przy czym jesiotr biały (Acipenser transmontanus) i jesiotr atlantycki (Acipenser oxyrhynchus) są większymi gatunkami. Wysoko zmineralizowane rybie łuski A. spatula są badane dopiero od niedawna. Thompson i McCunezasugerowali, że morfologia łusek gar ma trójwarstwowy skład składający się z zewnętrznej warstwy ganoiny, rozproszonej warstwy kostnej i warstwy kości blaszkowatej. Obecne badania nad łuskami A. spatula nie rozróżniły warstwy kostnej na rozproszone lub blaszkowate obszary kostne, ale po prostu zbadały obszar kości jako pojedynczą warstwę wewnętrzną1,12.

W tym badaniu przedstawiono procedury badania mikrostruktury, nanostruktury, składu chemicznego i rozkładów przestrzennych właściwości mechanicznych łusek A. pattula na podstawie wyników spektroskopii FTIR, SEM, rentgenowskiego tomografii komputerowej i technik nanoindentacji.

Protokół

1. Przygotowanie próbek łusek ryb

Na potrzeby niniejszego badania łuski pobrano z laboratorium środowiskowego US Army Engineer Research and Development Center (ERDC) z części środkowej (29th kolumna ogonowa) ryby z gatunku A. spatula o długości około 600 mm. Łuski ryb pozyskano zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami ERDC oraz National Institute of Health (NIH).

  1. Materiały
    Zapisz lokalizację przestrzenną na ciele ryby, z której pobrano łuski do badania. Należy przestrzegać odpowiednich wytycznych organizacyjnych lub rządowych dotyczących pozyskiwania okazów biologicznych, takich jak wytyczne NIH w zakresie opieki nad zwierzętami. Po usunięciu łusek z ryby przechowuj je w odpowiednim medium, np. w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby zachować nawodnienie i zawartość minerałów. Unikaj długotrwałego przechowywania, które może prowadzić do utraty minerałów, co może wpłynąć na dane z nanoindentacji. Użyj szczoteczki z włosiem średniej twardości oraz pęsety, aby usunąć wszelkie tkanki miękkie z twardych łusek.
  2. Montaż i sekcjonowanie okazów
    Badanie przekroju poprzecznego krótkiej osi łuski ryby (Rysunek 1) przy użyciu FTIR i nanoindentacji wymaga uprzedniego zamocowania łuski w sztywnym medium, takim jak dwuskładnikowa żywica epoksydowa składająca się z żywicy i utwardzacza. Należy stosować ogólnego przeznaczenia żywice epoksydowe utwardzane w temperaturze pokojowej (RT) o niskich temperaturach szczytowych, takich jak komercyjna żywica epoksydowa użyta w niniejszym badaniu, której temperatura szczytowa wynosiła poniżej 55 °C.

Schemat anatomii mikroskopowej przedstawiający przekrój poprzeczny w osi krótkiej z zaznaczonymi osiami kierunkowymi.
Rycina 1. Obrazy mikro-CT łuski A. spatula przedstawiające przekrój poprzeczny w osi krótkiej badany w niniejszej pracy nad A. spatula z wykorzystaniem nanoindentacji i FTIR [A (przedni), P (tylny), D (grzbietowy), V (brzuszny)].

    1. Umieść łuskę ryby w formie do próbek o średnicy 32 mm, używając dostępnego w handlu plastikowego uchwytu do próbek. Pozwala to na zachowanie prawidłowej orientacji próbki podczas zatapiania w żywicy epoksydowej.
    2. Po umieszczeniu próbki w formie, wlej nieutwardzoną żywicę epoksydową na próbkę, a następnie pozostaw ją do utwardzenia zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Po utwardzeniu żywicy, przetnij zatopioną próbkę wzdłuż jej linii środkowej, używając precyzyjnej przecinarki z tarczą diamentową.
    4. Poddaj próbkę sonikacji w wodzie destylowanej przez 15 min, aby usunąć z niej wszelkie zanieczyszczenia.
  2. Polerowanie do nanoindentacji i FTIR
    Aby uzyskać gładką, płaską powierzchnię do nanoindentacji, jak pokazano na Rysunku 2, sugeruje się zastosowanie następującej procedury i parametrów polerowania, opracowanych na podstawie konsultacji z producentem polerarki oraz testów na próbkach. Parametry te mogą jednak wymagać dostosowania do różnych biomateriałów w zależności od takich czynników, jak szybkość usuwania materiału. Ultrasonikacja próbek w kąpieli z wody destylowanej pomiędzy poszczególnymi etapami polerowania jest niezbędna, aby zapewnić, że cząstki z grubszego etapu polerowania nie zostaną przeniesione do kolejnego, drobniejszego etapu.

Łuska ryby zatopiona w żywicy epoksydowej na plastikowym uchwycie; preparat mikroskopowy, zaznaczony pasek skali 250 μm.
Rysunek 2. Obraz polerowanego przekroju poprzecznego wzdłuż krótkiej osi łuski A. spatula osadzonej w żywicy epoksydowej.

    1. Wykonać szlifowanie wstępne przy użyciu papieru SiC o ziarnistości 15 µm i wody jako środka smarującego do momentu uzyskania płaskiej powierzchni próbki, stosując siłę nacisku automatycznej głowicy polerskiej 7 lbf i prędkość 200 obrotów na minutę (rpm).
    2. Próbkę poddać sonikacji w kąpieli z wody destylowanej przez 15 min.
    3. Wykonać polerowanie pośrednie przy użyciu papieru SiC o ziarnistości 6 µm i wody jako środka smarującego, przy prędkości tarczy 130 rpm i sile nacisku 7 lbf przez 5 min.
    4. Próbkę poddać sonikacji w kąpieli z wody destylowanej przez 15 min.
    5. Polerować przy użyciu papieru SiC o ziarnistości 1 µm i wody jako środka smarującego, przy prędkości tarczy 130 rpm i sile nacisku 7 lbf przez 5 min.
    6. Próbkę poddać sonikacji w kąpieli z wody destylowanej przez 15 min.
    7. Wykonać polerowanie końcowe przy użyciu koloidalnej zawiesiny krzemionki 50 nm i odpowiedniego materiału polerskiego, np. gęstego, niewiązanego, niskowłóknistego porowatego poliuretanu zalecanego przez producenta dla zawiesin 50 nm. Polerować przy prędkości 130 rpm i sile nacisku 7 lbf przez 5 min.
    8. Próbkę poddać sonikacji w kąpieli z wody destylowanej przez 15 min.

2. Badanie nanoindentacyjne

  1. Przed każdą serią pomiarów skalibruj system nanoindentacji zgodnie z wytycznymi producenta. Kalibracja powinna obejmować wyznaczenie funkcji powierzchni dla wkładki Berkovicha oraz sztywności ramy. Dodatkowo na tym etapie przeprowadź kalibrację mikroskopu względem indentora, aby upewnić się, że wgłębienia odpowiadają wybranym lokalizacjom w mikroskopie.
  2. Wprowadź próbkę do nanoindentora i użyj sterowania mikroskopem optycznym urządzenia, aby ustawić ostrość obrazu próbki.
  3. Użyj sterowania programowego, aby przesunąć preparat w miejsce pierwszego wgłębienia. Optymalnie powinno to być miejsce oddalone o około 10 µm w żywicy epoksydowej od krawędzi warstwy ganoiny wzdłuż linii środkowej przekroju poprzecznego łuski.
  4. Wykonaj 4 równoległe rzędy wgłębień w odstępach 15 µm, zaczynając od tego miejsca, aby uzyskać statystycznie istotny zestaw danych. Ustaw nanoindentor na maksymalne obciążenie 5 mN, prędkość obciążania i odciążania 0,1 mN/sec, czas podtrzymania 30 sec oraz minimalny odstęp między wgłębieniami 5 µm dla każdego rzędu. Rzędy wgłębień powinny być ustawione prostopadle do powierzchni ganoiny, a liczba wgłębień powinna być wystarczająca, aby przejść przez cały przekrój poprzeczny łuski, kończąc około 10 µm w żywicy epoksydowej za warstwą kostną.
  5. Po zakończeniu serii pomiarów wykonaj za pomocą nanoindentora wgłębienia referencyjne z maksymalnym obciążeniem 100 mN w miejscu pierwszego i ostatniego wgłębienia, które powinny znajdować się odpowiednio w żywicy epoksydowej przed warstwą ganoiny i po warstwie kostnej. Odpowiadają one punktom początkowym i końcowym każdego rzędu wgłębień.
  6. Po nanoindentacji umieść próbkę z powrotem w roztworze PBS, aby uniknąć dalszego odwodnienia.
  7. Użyj oprogramowania do nanoindentacji, aby wyznaczyć moduł i twardość w oparciu o metodę Olivera-Pharra13, jeśli zaobserwowano niezależną od czasu odpowiedź materiału. W przeciwnym razie konieczne może być wydłużenie czasu podtrzymania, aby wyeliminować pełzanie wynikające ze zbyt szybkiego odciążania.

3. Spektroskopia ATR-FTIR z rozdzielczością przestrzenną

Zastosowanie akcesorium ATR wsuwanego, przymocowanego do mikroskopu FTIR, jest jedną z sugerowanych metod pozyskiwania spektra w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) z rozdzielczością przestrzenną dla poszczególnych warstw w próbce łuski rybiej. Akcesorium ATR umożliwia gromadzenie wysokiej jakości widm z bardzo małą rozdzielczością przestrzenną (~10 μm2), co jest nieosiągalne przy użyciu jakiejkolwiek innej techniki FTIR. W tych eksperymentach wykorzystano tę samą polerowaną próbkę (Rycina 2), która została przygotowana do badań nanoindentacyjnych.

  1. Wybierz próbkę o powierzchni i wymiarach odpowiednich dla mikroskopu FTIR używanego do analizy, aby zapewnić uzyskanie wysokiej jakości widm w spektromikroskopii ATR-FTIR.
  2. Przygotuj mikroskop FTIR do zbierania danych. Mikrospektroskopia FTIR wymaga kalibracji sygnału FTIR w tych samych warunkach próbkowania, które zostaną zastosowane podczas pomiaru próbki. Zazwyczaj obejmuje to chłodzenie detektora i odczekanie czasu niezbędnego do jego stabilizacji, a także zbieranie wszystkich widm tła i widm próbki w tych samych warunkach środowiskowych. Może to być szczególnie istotne, ponieważ CO2 i para wodna w powietrzu mogą drastycznie wpływać na widma FTIR. Ważne jest również upewnienie się, że optyka instrumentu jest odpowiednio ustawiona.
  3. Zbierz odpowiednie widmo tła, które zostanie odjęte od widma próbki. W tych eksperymentach jako tło do spektromikroskopii FTIR wykorzystano wypolerowany szkiełko mikroskopowe pokryte złotem.
  4. Używając odpowiedniego obiektywu, ustaw ostrość na próbce i wybierz obszar zainteresowania do analizy.
  5. Po znalezieniu obszaru zainteresowania przymocuj akcesorium ATR do obiektywu mikroskopu FTIR, podnieś próbkę, aż wejdzie ona w bezpośredni kontakt z elementem wewnętrznego odbicia ATR, i zbierz widmo próbki.
  6. Po zebraniu widm FTIR przeprowadź niezbędne standardowe przetwarzanie danych.

4. Tomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi

  1. Pozyskać i przygotować łuskę zgodnie z opisem w sekcji 1.1
  2. Konfiguracja skanera
    1. Rozgrzać źródło promieni rentgenowskich zgodnie ze specyfikacją producenta.
    2. Ustawić napięcie i natężenie promieniowania rentgenowskiego odpowiednio na 50 kV i 160 µA.
    3. Ustawić czas ekspozycji na 1 450 msec.
    4. Wybrać filtr aluminiowy o grubości 1,0 mm.
    5. Przed załadowaniem próbki przeprowadzić korekcję pola płaskiego przy wyłączonym (ciemne pole) i włączonym (jasne pole) źródle promieniowania rentgenowskiego.
  3. Montaż i ładowanie preparatu
    Łuski muszą być zamontowane w taki sposób, aby nie przesuwały się ani nie poruszały w trakcie całego skanowania. Próbki te muszą być również montowane przy użyciu materiałów prawie przezroczystych dla promieni rentgenowskich. Do przymocowania łuski do stolika CT można użyć kombinacji styropianu i Parafilmu.
    1. Sztywno zamontować próbkę tak, aby jej najdłuższy wymiar był równoległy do detektora.
    2. Przymocować zamontowaną próbkę do stolika skanera.
    3. Ustawić próbkę tak, aby znajdowała się w centrum rotacji przez cały czas trwania skanowania.
    4. Wybrać najwyższą rozdzielczość, która pozwala na zmieszczenie całej łuski w polu widzenia (FOV), w tym przypadku 7,5 µm.
  4. Ustawienia akwizycji
    Skanowanie w niniejszym badaniu należy przeprowadzić z krokiem obrotu 0,25° i wartością uśredniania klatek wynoszącą 15. Jeśli dopuszczalne są niższe rozdzielczości, należy zwiększyć wielkość kroku i/lub zmniejszyć uśrednianie klatek, aby skrócić całkowity czas skanowania.
  5. Parametry rekonstrukcji
    Po uzyskaniu zbioru danych zrekonstruować obrazy projekcyjne RTG w celu stworzenia zbioru danych zawierającego obrazy przekrojowe. Wybrać domyślne ustawienia oprogramowania NRecon firmy Skyscan, z wyjątkiem następujących pozycji.
    1. Zmienić korekcję artefaktów pierścieniowych (Ring Artifact Correction) na 20.
    2. Zmienić korekcję utwardzania wiązki (Beam Hardening Correction) na 25%.
    3. Dostosować statyczną rotację CS (CS Static Rotation), aby wyrównać obraz przekroju poprzecznego.
  6. Przetwarzanie obrazu
    Użyć oprogramowania CTAn firmy Skyscan, aby uzyskać końcowy trójwymiarowy obraz w skali szarości. Dostosować zakres skali szarości do odpowiedniego poziomu, aby usunąć artefakty pochodzące ze styropianu i Parafilmu.

5. Obrazowanie SEM i analiza EDX

Próbki przygotowane poprzez polerowanie do nanoindentacji oraz charakterystyki mikro- i nanostruktury zostały zbadane przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wykorzystano tryb niskiej próżni, aby zminimalizować odwodnienie próbek oraz potrzebę nakładania powłok przewodzących. Lokalna analiza chemiczna polerowanych próbek została przeprowadzona równolegle z obrazowaniem SEM przy użyciu spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX). Analizy EDX wykonano wzdłuż tej samej linii/siatki, która była analizowana podczas nanoindentacji, w celu uzyskania korelacji między właściwościami chemicznymi a mechanicznymi. S помощью SEM zbadano również świeżo przełamane powierzchnie, aby uzyskać dokładniejsze informacje o morfologii i orientacji struktur biomineralizowanych występujących w łuskach ryb. W celu zwiększenia rozdzielczości podczas obserwacji nanostruktury na przełamanych powierzchniach, próbki napylono złotem (Au) i obrazowano w trybie wysokiej próżni. Poniżej przedstawiono szczegółowe informacje na temat zastosowanych procedur.

  1. Obrazowanie SEM powierzchni polerowanych
    1. Umieścić wypolerowaną próbkę w komorze SEM i wypompować powietrze do trybu niskiej próżni, aby uzyskać ciśnienie w komorze od 0,1 do 0,5 mbar.
    2. Ustawić odległość roboczą na około 5,0 mm.
    3. Aktywować wysokie napięcie (HV) i przejść do obszaru zainteresowania na próbce, obejmującego strefę przejściową między ganoiną a podwarstwami kostnymi lub inne interesujące obszary.
    4. Wykonać obrazy przy HV 15 kV i prądzie wiązki około 3,9 nA.
    5. Ustawić ostrość obrazu oraz przeprowadzić wszystkie niezbędne wyrównania i korekty stygmatyzacji.
    6. Przechwycić obrazy z co najmniej trzech obszarów zainteresowania przy odpowiednich powiększeniach (zazwyczaj od 250X do 10 000X), korzystając z detektora elektronów wstecznie rozproszonych (BSE) w trybie niskiej próżni, aby ułatwić identyfikację zmian w zawartości i gęstości biominerałów (t.j. kość gęsta w stosunku do kości porowatej).
  2. Obrazowanie SEM powierzchni przełomów
    1. Przymocować świeżo przełamaną próbkę do stolika SEM pod kątem 90° za pomocą dwustronnej taśmy węglowej, powierzchnią przełomu skierowaną do góry.
    2. Napać Au metodą napylania, aby stworzyć przewodzącą warstwę o grubości poniżej 1 nm na powierzchni przełomu.
    3. Umieścić próbkę w komorze SEM i wypompować powietrze do trybu wysokiej próżni.
    4. Ustawić odległość roboczą w przedziale od 3,0 do 5,0 mm.
    5. Aktywować HV i przejść do obszarów zainteresowania na próbce. Głównymi obszarami zainteresowania w tym przypadku była struktura występująca w warstwach ganoiny i kostnych.
    6. Wykonać obrazy przy HV od 5 kV do 15 kV i niższym prądzie wiązki 0,24 nA w celu poprawy rozdzielczości.
    7. Wstępnie ustawić ostrość próbki i przeprowadzić wstępne wyrównania.
    8. Zwiększyć powiększenie powyżej 5 000X i przełączyć soczewkę z normalnej emisji polowej na soczewkę immersyjną/ultra-wysokiej rozdzielczości (UHR).
    9. Przeprowadzić wyrównania UHR i korekty stygmatyzacji.
    10. Przechwycić obrazy z co najmniej trzech obszarów zainteresowania przy odpowiednich powiększeniach (zazwyczaj od 5 000X do 250 000X), korzystając z detektora wewnątrzsoczewkowego (TLD) pracującego w trybie elektronów wtórnych (SE).
  3. Analiza EDX powierzchni polerowanych (wykonywana równolegle z obrazowaniem SEM). Parametry te są zależne od materiału i będą wymagały dostosowania tak, aby objętość oddziaływania EDX była zbliżona rozmiarem do objętości oddziaływania nanoindentacji, zgodnie z omówieniem Mosera14.
    1. Przejść do obszaru zainteresowania na wypolerowanej próbce, który obejmuje siatkę nanoindentacji wskazaną przez znaczniki referencyjne na końcu każdej linii wcięć.
    2. Upewnić się, że HV wynosi co najmniej 15 kV, prąd wiązki co najmniej 3,9 nA, a odległość robocza jest większa niż 5,0 mm.
    3. Przechwycić obraz BSE obszaru, który ma zostać poddany analizie EDX.
    4. Używając oprogramowania do analizy EDX, przechwycić ten sam obraz, aby ułatwić lokalizację obszarów do przeprowadzenia analizy chemicznej wzdłuż linii wcięć.
    5. Stosując technikę „Line Analysis” (analiza liniowa), wyznaczyć linię do przeprowadzenia analizy chemicznej wzdłuż interesującej linii wcięć, zaczynając od pierwszego wcięcia i kończąc na ostatnim.
    6. Określić liczbę punktów analizy, które mają zostać rozmieszczone wzdłuż linii. Najlepiej zastosować taką samą liczbę punktów analizy i wcięć, aby zapewnić bezpośrednią korelację przestrzenną między składem chemicznym a właściwościami mechanicznymi.
    7. Po prawidłowym ustawieniu linii i określeniu punktów, zainicjować analizę liniową za pomocą oprogramowania EDX.
    8. Po zakończeniu analizy liniowej zidentyfikować pierwiastki do kwantyfikacji na podstawie widm punktowych uzyskanych wzdłuż wyznaczonej linii na wypolerowanej powierzchni próbki.
    9. Po zidentyfikowaniu interesujących pierwiastków przeprowadzić kalibrację tła, aby uwzględnić promieniowanie hamowania i inne efekty.
    10. Wybrać w oprogramowaniu opcję analizy dekonwolucyjnej, aby uzyskać analizę ilościową w każdym punkcie wzdłuż wyznaczonej linii w celu określenia składu chemicznego w każdym punkcie.
    11. Zapisać wyniki ilościowej analizy chemicznej wraz z obrazem analizowanej linii, aby ułatwić korelację przestrzenną z właściwościami mechanicznymi zmierzonymi za pomocą nanoindentacji.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia średnie wyniki przestrzennie skorelowanych analiz nanoindentacji/SEM/EDX przeprowadzonych w poprzecznym przekroju wzdłuż krótkiej osi o długości około 800 μm. W warstwie ganoiny o grubości około 60 μm nanoindentator wyznaczył średni moduł wynoszący 69.0 GPa oraz twardość wynoszącą 3.3 GPa. Dla warstwy kostnej o grubości około 740 μm nanoindentator wyznaczył średni moduł wynoszący 14.3 GPa oraz twardość wynoszącą 0.5 GPa.

Metodą EDX oznaczono zawartość węgla, tlenu, wapnia i fosforu, które są typowo występujące w zmineralizowanych łuskach. Jednakże warstwy ganoiny i kości wykazywały mierzalne różnice w składzie chemicznym. Zaobserwowany wzrost zawartości węgla w warstwie kostnej można przypisać mniejszemu stopniu mineralizacji tego obszaru, co skutkuje niewielkim wzrostem zawartości węgla, powodując jednocześnie zauważony spadek ogólnej jasności obrazu BSE. W szczególności średni stosunek stężeń atomowych Ca:P w warstwie ganoiny wyniósł 1,71, co jest zbliżone do hydroksyapatytu o teoretycznym stosunku 1,67. Średni stosunek Ca:P w warstwie kostnej spadł do 1,51, co wskazuje na zmniejszenie stopnia mineralizacji w porównaniu z warstwą ganoiny.

Widma FTIR przedstawione na Rysunku 4 dla warstwy kostnej i warstwy ganoiny pozwoliły zidentyfikować główne grupy funkcyjne jako amidowe, karboksylowe, fosforanowe i karbonylowe. W szczególności FTIR potwierdził wizualną obserwację sygnatur hydroksyapatytu w warstwie zewnętrznej (ganoina) oraz sygnatur kolagenu w warstwie wewnętrznej (kość). Piki w zakresie 3,500-3,000 cm−1 wynikające z rozciągania wiązań NH oraz zgięcia NH w zakresie od 1,550 do 1,500 cm−1 reprezentują grupy amidowe w warstwie kostnej. Piki w regionie liczby falowej 1,470-1,365 cm−1 reprezentują podstawione grupy alkilowe amidu. Dodatkowo, w warstwie kostnej zaobserwowano charakterystyczne rozciąganie C=O przy 1,641 cm−1 . Piki w zakresie 3,000-2,500 cm−1 reprezentują grupy karboksylowe. Widma obu warstw, kostnej i ganoiny, wykazały charakterystyczny pik w pobliżu 1,079.33 cm−1, wskazujący na rozciąganie grupy fosforanowej.

Obrazowanie mikro-tomograficzne (X-ray CT) przedstawione na Rysunku 5 pokazuje, że warstwa ganoiny nie pokrywa warstwy kostnej w miejscach, w których łuski nakładają się na siebie. Jaśniejsze szare warstwy ganoiny wskazują fazy gęstsze, twardsze i sztywniejsze, natomiast ciemniejsze szare warstwy kostne wskazują fazy o mniejszej gęstości i sztywności. Dodatkowo obrazowanie X-ray CT pomogło w zidentyfikowaniu niejednorodności grubości warstwy ganoiny. W rzeczywistości w pobliżu centrum warstwy ganoiny obserwuje się wyraźne wgłębienia, które w ogóle nie pokrywają warstwy kostnej.

Obraz SEM przedstawiony na rysunku 6A, ukazujący powierzchnię przełomu trawioną H3PO4 , ujawnił nanostruktury zorganizowane w warstwowy wzór w przypadku warstwy ganoiny. Ta struktura zorganizowana w nanopręty koreluje z sygnaturami hydroksyapatytu uzyskanymi w badaniu FTIR dla obszaru ganoiny.

Rycina 6A przedstawia typową mikrofotografię SEM powierzchni przełomu przy małym powiększeniu, na której linia przerywana wyraźnie wyznacza przejście między warstwą ganoiny a warstwą kostną. Rycina 6B ukazuje obrazy SEM powierzchni przełomu przy większym powiększeniu po trawieniu H3PO4. Po trawieniu w zewnętrznej warstwie ganoiny wyraźnie widoczne są zorientowane nanopręty, natomiast w warstwie kostnej obserwuje się nanostrukturę włóknistą.

Wykres analizy składu mechanicznego i chemicznego z danymi dotyczącymi modułu sprężystości i rozkładu pierwiastków.
Rysunek 3. Dane dotyczące modułu i twardości z nanoindentacji skorelowane przestrzennie ze składem chemicznym SEM/EDX.

Porównanie widm FTIR; warstwy zewnętrzne i wewnętrzne; schemat; analiza materiałowa; odbicie.
Rysunek 4. Widma FTIR zebrane z warstwy zewnętrznej (ganoiny) i wewnętrznej (kostnej).

Schemat budowy łuski ryby; analiza sekcji kostnych i warstwy ganoiny; opisane przekroje poprzeczne.
Rycina 5. Obrazy z mikro-tomografii komputerowej (CT) wykazujące wżery w zewnętrznej warstwie (ganoina) pokrywającej warstwę wewnętrzną (kostną).

Mikroskopia elektronowa ukazująca wielowarstwowe łuski ryb; nanopręty ganoiny, analiza struktury fibrylarnych.
Rycina 6. (A) Obraz SEM typowej powierzchni przełomu przy małym powiększeniu, (B) obrazy nanoprętów w warstwie zewnętrznej (ganoiny) i włókien w warstwach wewnętrznych (kostnych) przy większym powiększeniu.. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Z eksperymentalnego punktu widzenia naukowcy muszą pamiętać, że podczas pracy z naturalnie występującymi materiałami biologicznymi, takimi jak zmineralizowane łuski ryb, raportowanie przestrzennego położenia łuski na rybach ma kluczowe znaczenie, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że właściwości mechaniczne zmineralizowanych łusek ryb są zależne od tego, gdzie łuski znajdowały sięna rybach.

Wykazano również, że właściwości mechaniczne zmineralizowanych materiałów biologicznych są zależne od stanu uwodnienia próbek4. Ogranicza to przydatność tej techniki przy próbie porównania świeżych próbek, które zostały odpowiednio uwodnione, z wynikami opublikowanymi w otwartej literaturze, w których wykorzystuje się suche skamieniałe próbki. W związku z tym należy unikać wydłużania czasu testowania, aby zminimalizować wpływ odwodnienia na właściwości mechaniczne próbki podczas nanotwardości. Zaleca się przeprowadzenie badań pilotażowych dotyczących konkretnego materiału, aby upewnić się, że czas trwania eksperymentu jest wystarczająco minimalny, aby nie zmienić mechanicznego zachowania materiału. Nanoindentacja mokrych komórek byłaby preferowaną metodą utrzymania stałego stanu uwodnienia materiału, jeśli pozwala na to sprzęt testujący.

Metoda nanowgłębienia zastosowana w tym badaniu, w której obliczono moduł sprężystości na podstawie krzywej odciążania, zakłada, że materiał zachowuje się jak liniowy elastyczny materiał izotropowy. Technika ta może być stosowana z różnymi końcówkami wgłębnika. Jednak w tym badaniu zastosowano trójstronną końcówkę Berkovicha o połowie kąta 65,35°. Alternatywne końcówki, takie jak narożnik sześcianu (kąt połówkowy = 35,36°) są odpowiednie dla procedury przedstawionej w tym manusjuście, ale ponieważ końcówka narożnika sześcianu jest ostrzejsza niż końcówka Berkovicha, w próbce mogą powstawać pęknięcia przy znacznie niższych obciążeniach niż w przypadku końcówki Berkovicha.

Polerowanie jest niezbędnym krokiem do uzyskania gładkiej i płaskiej powierzchni o zminimalizowanej chropowatości powierzchni, aby nie wpływać na wyniki nanotwardości. Etapy polerowania przedstawione w tym manuskrypcie są sugerowaną procedurą, która może wymagać modyfikacji w zależności od rodzaju używanej polerki. Jednak krytycznym krokiem w celu zapewnienia dokładnych danych dotyczących nanotwardości jest zminimalizowanie chropowatości powierzchni, a w przypadku tego konkretnego materiału wymagane było końcowe polerowanie 50 nm, aby uzyskać gładką płaską powierzchnię na głębokości wgłębienia, które są sondowane.

Odstępy między wgłębieniami zapewniają również dokładne dane dotyczące nanowgłębień, na które nie mają wpływu deformacje materiału występujące w stosunku do poprzednich wgłębień. Instrukcja obsługi nanoindentera dla sprzętu w tym badaniu sugerowała, że odstępy między wcięciami powinny wynosić co najmniej 20-30x maksymalną głębokość penetracji dla wgłębników Berkovicha15. W przypadku materiałów alternatywnych wymagane odstępy między wcięciami będą musiały zostać określone na podstawie przyłożonego obciążenia i maksymalnej głębokości wcięcia, jak omówiono wcześniej w dostępnej literaturze16,17. Dodatkowo, czas utrzymywania tego materiału został wybrany tak, aby przezwyciężyć wszelkie pełzanie obserwowane dla różnych badanych faz materiału, co pozwoliło na zastosowanie metody analizy Olivera-Pharra w oprogramowaniu nanoindenter. Jednak, jak omówiono w Oyen18 , dostępne są alternatywne metody analizy dla materiałów biologicznych, w przypadku których zależne od czasu reakcje materiału mogą nie zostać przezwyciężone przy odpowiednich czasach podtrzymania.

Aby uzyskać wyniki w wysokiej rozdzielczości z tomografii rentgenowskiej, należy zoptymalizować kilka ustawień. W tym artykule przedstawiono bardzo specyficzny zestaw parametrów do stosowania na rybiej łusce o unikalnym rozmiarze i grubości warstwowej. Przy różnych rozmiarach próby te ustawienia będą musiały zostać dostosowane, aby uzyskać zestaw danych o najwyższej jakości. Proces wyboru każdego parametru powinien być jasno określony w instrukcji obsługi dołączonej do używanej maszyny. Ustawienia skanowania (napięcie, prąd, ekspozycja, wybór filtra) i ustawienia rekonstrukcji (artefakty pierścieniowe, hartowanie wiązki) mogą wymagać modyfikacji w celu uwzględnienia wielu innych rozmiarów próbek i geometrii.

Rentgenowska tomografia komputerowa dostarczyła obrazu morfologii całej skali, identyfikując warstwę ganoiny pokrywającą kostną warstwę materiału tylko tam, gdzie łuski nie zachodziły na siebie. Rentgenowskie obrazy CT wykazały również, że warstwa ganoiny składała się z niejednolitej grubości w całej skali, a nawet wykazywała wgłębienia, które całkowicie nie miały warstwy ganoiny.

Co ciekawe, dane dotyczące nanowgłębień przestrzennie skorelowane z analizą chemiczną SEM/EDX zidentyfikowały ostre dyskretne przejście między 2 warstwami zamiast bardziej stopniowego przejścia obserwowanego dla zmineralizowanych łusek ryb P. senagalus (w Bruet et al. 2).

Połączenie nanotwardości, FTIR, EDX i SEM dostarczyło informacji o właściwościach mechanicznych, analizie chemicznej i strukturze, aby potwierdzić, że warstwa zewnętrzna jest ganoiną o morfologii i chemii podobnej do szkliwa. Dodatkowo techniki te potwierdziły, że warstwa wewnętrzna jest warstwą kostną materiału.

Podsumowując, metody przedstawione w tym badaniu zidentyfikowały procedurę i odpowiadające jej wyniki w celu zbadania zmineralizowanej rybiej łuski A. spatula od struktury masowej do nanostruktury i składu chemicznego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za wsparcie finansowe dla tej pracy udzielone przez US Army ERDC Military Engineering 6.1 Basic Research Program oraz ERDC Center for Directed Research Program. Autorzy pragną również podziękować personelowi i zapleczu Oddziału Betonu i Materiałów Laboratorium Geotechniczno-Konstrukcyjnego ERDC za wsparcie prac eksperymentalnych. Zgodę na publikację wydał Dyrektor Laboratorium Geotechnicznego i Budowlanego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żywica epoksydowaBuehler701-501512
Utwardzacz epoksydowyBuehler703-501528
SamplkupsBuheler20-8180
SamplKlips IBuehler20-4100-100S
Precyzyjna piła do cięciaBuehlerMyjka
UltraMet 2002BuehlerB2510R-MT
PolerkaBuehler49-1750-160
ziarnistości 1,200 (15 μ m) Papier SiCStruers40400012
ziarnistości 4 000 (6 μ m) Papier SiCStruers40400014
krzemionka koloidalna 50 nmBuehler40-10075
Tarcza polerska Chemomet do zawiesiny 50 nmBuehler40-7918
NanoindenterMTSG200
Mikroskop kontinuum FTIRThermo Nicollet6700
Rentgenowska tomografia komputerowaSkyscanSkyscan 1173
SEMFEINovaNanoSEM 630
EDXDetektor BrukerAXS Xflash 4010
Napylarka natryskowaDentonDesk II
soniczna Isomet o

Bibliografia

  1. Allison, P. G., et al. Mechanical properties and structure of the biological multilayered material system, Atractosteus spatula scales. Acta Biomater. 9, 5289-5296 (2013).
  2. Bruet, B. J. F., Song, J., Boyce, M. C., Ortiz, C. Materials design principles of ancient fish armour. Nat. Mater. 7, 748-756 (2008).
  3. Lin, Y. S., Wei, C. T., Olevsky, E. A., Meyers, M. A. Mechanical properties and the laminate structure of Arapaima gigas scales. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 4, 1145-1156 (2011).
  4. Marino Cugno Garrano, A., et al. On the mechanical behavior of scales from Cyprinus carpio. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 7, 17-29 (2012).
  5. Song, J., et al. Quantitative microstructural studies of the armor of the marine threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). J. Struct. Biol. 171, 318-331 (2010).
  6. Wang, L., Song, J., Ortiz, C., Boyce, M. C. Anisotropic design of a multilayered biological exoskeleton. J. Mater. Res. 24, 3477-3494 (2009).
  7. Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., Mann, S. Microstructure, mechanical, and biomimeetic properties of fish scales from Pagrus major. 142, 327-333 (2003).
  8. O'Connell, M. T., Shepherd, T. D., O'Connell, A. M. U., Myers, R. A. Long-term declines in two apex predators, bull sharks (Carcharhinus leucas) and alligator gar (Atractosteus spatula), in Lake Pontchartrain, an Oligohaline estuary in southeastern Louisiana. Estuar. Coast. 30, 567-574 (2007).
  9. Long Jr, J. H., Hale, M. E., McHenry, M. J., Westneat, M. W. Functions of fish skin: flexural stiffness and steady swimming of longnose gar Lepisosteus osseus. J. Exp. Biol. 199, 2139-2151 (1996).
  10. Page, L. M., Burr, B. M. A field guide to freshwater fishes. The Peterson field guide series. , Houghton Mifflin Company. (1991).
  11. Thompson, K. S., McCune, A. R. Development of the scales in Lepisosteus as a model for scale formation in fossil fishes. J. Linn. Soc. Longdon, Zool. 82, 73-86 (1984).
  12. Yang, W., et al. Structure and fracture resistance of alligator gar (Atractosteus spatula) armored fish scales. Acta. Biomater. 9, 5876-5889 (2013).
  13. Moser, R. D., Allison, P. G., Chandler, M. Q. Characterization of Impact Damage in Ultra-High Performance Concrete Using Spatially Correlated Nanoindentation/SEM/EDX. J. Mater. Eng. Perf. 22, 1-7 (2013).
  14. Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7, 1564-1583 (1992).
  15. Agilent Technologies Nano Indenter G200 User's Guide. , Agilent Technologies Inc. Palo Alto. (2012).
  16. Ulm, F. J., et al. Statistical indentation techniques for hydrated nanocomposites: concrete, bone, and shale. J. Amer. Cer. Soc. 90, 2677-2692 (2007).
  17. Randall, N. X., Vandamme, M., Ulm, F. -J. Nanoindentation analysis as a two-dimensional tool for mapping the mechanical properties of complex surfaces. J. Mater. Res. 24, 679-690 (2009).
  18. Oyen, M. L. Nanoindentation of Biological and Biomimetic Materials. Exper. Tech. 37, 73-87 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza EDXprzygotowanie pr bekw a ciwo ci mechanicznesk ad chemicznykorelacja przestrzenna
Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.