Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metody używane do badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali szpatułki Atractosteus (A. szpatułka) za pomocą nanowgłębienia, spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (X-ray CT). Wyniki eksperymentów wykorzystano do zbadania zasad projektowania ochronnych materiałów biologicznych.

Streszczenie

Hierarchiczna architektura ochronnych materiałów biologicznych, takich jak zmineralizowane łuski ryb, muszle ślimaków, rogi barana, poroże i skorupy żółwi, dostarcza unikalnych zasad projektowania z potencjałem do kierowania projektowaniem materiałów i systemów ochronnych w przyszłości. Niezbędne jest zrozumienie zależności między strukturą a właściwościami tych systemów materiałowych w mikroskali i nanoskali, w których rozpoczyna się awaria. Obecnie techniki eksperymentalne, takie jak nanoindentacja, tomografia rentgenowska i SEM, zapewniają naukowcom sposób na skorelowanie zachowania mechanicznego z hierarchicznymi mikrostrukturami tych układów materialnych^1-6. Jednak obecnie nie jest dostępna dobrze zdefiniowana standardowa procedura przygotowania próbek zmineralizowanych biomateriałów. W pracy przedstawiono metody badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali A. spatula z wykorzystaniem nanowgłębienia, FTIR, SEM, z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii (EDX) oraz rentgenowską tomografią komputerową.

Wprowadzenie

Badacze badają biomateriały strukturalne i starają się wyjaśnić zasady projektowania, które zapewniają biomateriałom strukturalnym lepsze właściwości mechaniczne, takie jak znacznie wyższa wytrzymałość i wytrzymałość w porównaniu do ich indywidualnych składników. Badania nad zasadami projektowania opancerzonych rybich łusek dla Pagrus major⁷, Polypterus senagalus^2,6, Arapaima gigas³, Cyprinus carpio⁴ i Atractosteus spatula¹ wykazały potrzebę rozszerzenia zastosowania istniejących metod eksperymentalnych do badania reakcji strukturalnych i cech mikrostrukturalnych, ponieważ szczegółowe standardowe procedury nie są dostępne dla tych typów materiały i eksperymenty.

Wśród różnych omawianych opancerzonych rybich łusek, A. patula, jest historycznie szczytowym drapieżnikiem centralnego US⁸ i jest gatunkiem o wysoce zmineralizowanych łuskach. Gatunek ten wymienia masę mięśniową na masę skóry, aby uzyskać lepszy system obrony przed drapieżnikami w porównaniu z rybami o porównywalnej wielkości, o których wspomniano wcześniej⁹. Według Page'a i Burra¹⁰, A. spatula jest trzecią co do wielkości rybą słodkowodną w Ameryce Północnej, przy czym jesiotr biały (Acipenser transmontanus) i jesiotr atlantycki (Acipenser oxyrhynchus) są większymi gatunkami. Wysoko zmineralizowane rybie łuski A. spatula są badane dopiero od niedawna. Thompson i McCune^zasugerowali, że morfologia łusek gar ma trójwarstwowy skład składający się z zewnętrznej warstwy ganoiny, rozproszonej warstwy kostnej i warstwy kości blaszkowatej. Obecne badania nad łuskami A. spatula nie rozróżniły warstwy kostnej na rozproszone lub blaszkowate obszary kostne, ale po prostu zbadały obszar kości jako pojedynczą warstwę wewnętrzną^1,12.

W tym badaniu przedstawiono procedury badania mikrostruktury, nanostruktury, składu chemicznego i rozkładów przestrzennych właściwości mechanicznych łusek A. pattula na podstawie wyników spektroskopii FTIR, SEM, rentgenowskiego tomografii komputerowej i technik nanoindentacji.

Protokół

1. Przygotowanie próbki rybiej łuski

Na potrzeby tego badania, skale zostały uzyskane z Laboratorium Środowiskowego Centrum Badań i Rozwoju Inżynierów Armii Stanów Zjednoczonych (ERDC) w połowie długości (29^kolumna ogonowa) z około 600 mm długości gar (A. szpatułka). Rybie łuski uzyskano zgodnie z wytycznymi ERDC i Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Materiały
   Zapisz położenie przestrzenne łusek uzyskanych do badania na rybach. Upewnij się, że przestrzegasz odpowiednich wytycznych organizacji lub rządu dotyczących pozyskiwania próbek biologicznych, takich jak wytyczne NIH dotyczące opieki nad zwierzętami. Przechowuj łuski w odpowiednim podłożu, takim jak buforowany fosforanem roztwór soli, aby zachować nawodnienie i utrzymać zawartość minerałów po ich usunięciu z ryby. Unikaj długotrwałego przechowywania, które może spowodować utratę minerałów, co może mieć wpływ na dane dotyczące nanotwardości. Użyj szczotki o średnim włosiu i pęsety, aby usunąć miękką tkankę z twardych łusek.
2. Montaż i cięcie próbek
   Badanie poprzecznego przekroju krótkiej osi rybiej łuski (rysunek 1) za pomocą FTIR i nanowgłębienia wymaga najpierw zamontowania skali w sztywnym podłożu, takim jak dwuskładnikowa żywica epoksydowa składająca się z żywicy i utwardzacza. Należy używać epoksydów utwardzanych RT ogólnego przeznaczenia o niskich temperaturach szczytowych, takich jak komercyjna żywica epoksydowa ogólnego przeznaczenia zastosowana w tym badaniu, w której temperatura szczytowa była niższa niż 55 °C.

Rysunek 1. Rentgenowskie obrazy CT skali A. spatula przedstawiające przekrój poprzeczny o krótkiej osi badany w tym badaniu A. spatula przy użyciu nanowgłębienia i FTIR [A (przedni), P (tylny), D (grzbietowy), V (brzuszny)].

2. 1. Trzymaj rybią łuskę w formie na próbki o średnicy 32 mm za pomocą dostępnego w handlu plastikowego uchwytu na próbki. Dzięki temu próbka jest prawidłowo zorientowana podczas montażu w żywicy epoksydowej.
   2. Po umieszczeniu próbki w formie wlej nieutwardzoną żywicę epoksydową na próbkę, a następnie pozwól żywicy epoksydowej utwardzić się zgodnie ze wskazówkami producenta.
   3. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej należy przeciąć zamontowaną próbkę za pomocą precyzyjnej piły do cięcia z diamentowym ostrzem na linii środkowej próbki.
   4. Sonikować w wodzie destylowanej przez 15 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z próbki.
3. Polerowanie do nanotwardości i FTIR
   Aby uzyskać gładką, płaską powierzchnię do nanowgłębienia, jak pokazano na rysunku 2, na podstawie rozmów z producentem polerki i próbek testowych sugerowano następującą procedurę i parametry polerowania. Jednak parametry mogą wymagać dostosowania do różnych biomateriałów w oparciu o reakcje, takie jak szybkość usuwania materiału. Ultradźwięki próbek w kąpieli z wodą destylowaną pomiędzy etapami polerowania są niezbędne, aby zapewnić, że cząstki z grubszego etapu polerowania nie zostaną wprowadzone do kolejnego, drobniejszego etapu polerowania.

Rysunek 2. Obraz polerowanego przekroju poprzecznego o krótkiej osi A. skali szpatułkowej zamontowanej w żywicy epoksydowej.

4. 1. Gruboziarnisty połysk za pomocą pada SiC 15 μm i wody jako smaru, aż próbka zostanie wyrównana, przy użyciu automatycznej siły głowicy polerskiej 7 lbf i prędkości 200 obrotów na minutę (rpm).
   2. Sonikować próbkę w kąpieli z wodą destylowaną przez 15 minut.
   3. Polerowanie pośrednie za pomocą pada SiC 6 μm przy użyciu smaru wodnego o prędkości obrotowej płyty 130 obr./min i sile 7 lbf przez 5 min.
   4. Sonizować próbkę w kąpieli z wodą destylowaną przez 15 minut.
   5. Polerowanie padem SiC o grubości 1 μm przy użyciu smaru wodnego o prędkości obrotowej 130 obr./min i sile 7 lbf przez 5 min.
   6. Sonikować próbkę w kąpieli z wodą destylowaną przez 15 minut.
   7. Końcowe polerowanie za pomocą koloidalnej zawiesiny krzemionkowej 50 nm przy użyciu odpowiedniej pady polerskiej, takiej jak włóknina o wysokiej gęstości, porowatym poliuretanie o niskiej drzemce, którą producent sugeruje dla zawiesin 50 nm. Polerowanie z prędkością 130 obr./min z siłą 7 lbf przez 5 min.
   8. Sonikować próbkę w kąpieli z wodą destylowaną przez 15 minut.

2. Badanie nanotwardości

1. Kalibruj system nanotwardości przed każdą partią testów zgodnie z wytycznymi producenta. Kalibracja powinna obejmować określenie funkcji obszaru systemu dla sztywności dziobu Berkovicha i ramy. Dodatkowo na tym etapie należy przeprowadzić kalibrację mikroskopu do wgłębnika, aby upewnić się, że wgłębienia są skorelowane z wybranymi lokalizacjami mikroskopu.
2. Załaduj próbkę do nanoinddenta i użyj elementów sterujących mikroskopu optycznego na nanoindenterze, aby ustawić ostrość próbki.
3. Użyj elementów sterujących oprogramowania, aby przesunąć próbkę do miejsca, w którym znajduje się pierwsze wcięcie. Idealnie jest to około 10 μm w żywicy epoksydowej od krawędzi warstwy ganoiny wzdłuż linii środkowej przekroju poprzecznego skali.
4. Wykonaj 4 równoległe rzędy wcięć oddalonych od siebie o 15 μm, aby uzyskać statystycznie istotny zestaw danych, zaczynając od tego miejsca. Ustaw nanowgłębnik na maksymalne obciążenie 5 mN, szybkość ładowania i rozładowywania 0,1 mN/s, czas podtrzymania 30 sekund i minimalny odstęp między wcięciami 5 μm dla każdego rzędu. Rząd wgłębień powinien być ustawiony tak, aby przebiegał prostopadle do powierzchni ganoiny, a liczba wgłębień powinna być określona w poprzek przekroju poprzecznego skali, przechodząc około 10 μm w głąb żywicy epoksydowej obok warstwy kostnej.
5. Po zakończeniu partii niech nanoindenter utworzy wgłębienia referencyjne o maksymalnym obciążeniu 100 mN na pierwszym i ostatnim wcięciu, które powinny znajdować się w żywicy epoksydowej odpowiednio przed warstwą ganoiny i za warstwą kości. Są one skorelowane z punktami początkowymi i końcowymi dla każdego wiersza wcięć.
6. Po nanoindentacji umieść próbkę z powrotem w roztworze PBS, aby uniknąć dalszego odwodnienia.
7. Użyj oprogramowania do nanotwardości, aby określić moduł i twardość w oparciu o metodę Olivera-Pharra¹³, jeśli zaobserwowana jest niezależna od czasu reakcja materiału. W przeciwnym razie może być konieczne wydłużenie czasu podtrzymania, aby przezwyciężyć pełzanie obserwowane w wyniku zbyt szybkiego rozładunku.

3. Przestrzennie rozdzielona spektroskopia ATR-FTIR

Użycie wsuwanego akcesorium ATR dołączonego do mikroskopu FTIR jest jedną z sugerowanych metod zbierania przestrzennie rozdzielczych widm podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) warstw w próbce rybiej łuski. Akcesorium ATR pozwala na zbieranie wysokiej jakości widm o bardzo małej (~10^μm2) rozdzielczości przestrzennej, która nie jest osiągalna żadną inną techniką FTIR. W tych eksperymentach wykorzystano tę samą wypolerowaną próbkę (ryc. 2) przygotowaną do eksperymentów z nanotwardością.

1. Należy wybrać próbkę o powierzchni i wymiarach odpowiednich dla mikroskopu FTIR używanego do analizy, aby zapewnić uzyskanie wysokiej jakości widm ze spektromikroskopii ATR-FTIR.
2. Przygotuj mikroskop FTIR do zbierania danych. Mikrospektroskopia FTIR wymaga kalibracji sygnału FTIR w tych samych warunkach próbkowania, jakie będą używane do pomiaru próbki. Zazwyczaj obejmuje to chłodzenie detektora i danie mu czasu na ustabilizowanie się, a także zbieranie wszystkich widm tła i widm próbek w tych samych warunkach środowiskowych. Może to być szczególnie ważne, ponieważ CO₂ i para wodna w powietrzu mogą dramatycznie wpływać na widma FTIR. Ważne jest również, aby upewnić się, że optyka instrumentu jest wyrównana.
3. Zbierz odpowiednie widmo tła, od którego odejmij próbkę. W tych eksperymentach wykorzystano polerowane, pokryte złotem szkiełko mikroskopowe jako tło dla spektromikroskopii FTIR.
4. Korzystając z odpowiedniego celu, skoncentruj się na próbie i wybierz obszar zainteresowania do analizy.
5. Po znalezieniu obszaru zainteresowania przymocuj akcesorium ATR do obiektywu mikroskopu FTIR, podnieś próbkę, aż wejdzie w bliski kontakt z wewnętrznym elementem odbiciowym ATR, i zbierz widmo próbki.
6. Po zebraniu widm FTIR należy przeprowadzić niezbędne standardowe przetwarzanie danych wymagane.

4. Rentgenowska tomografia komputerowa (CT)

1. Uzyskać i przygotować skalę zgodnie z opisem w sekcji 1.1
2. Konfiguracja skanera
   1. Rozgrzej źródło promieniowania rentgenowskiego zgodnie ze specyfikacją producenta.
   2. Ustaw napięcie i prąd promieniowania rentgenowskiego odpowiednio na 50 kV i 160 μA.
   3. Ustaw czas naświetlania na 1 450 ms.
   4. Wybierz filtr aluminiowy 1,0 mm.
   5. Przed załadowaniem próbki należy dokonać korekty płaskiego pola, gdy źródło promieniowania rentgenowskiego jest wyłączone (ciemne pole) i włączone (jasne pole).
3. Zamontuj i załaduj próbkę
   Wagi muszą być zamontowane w taki sposób, aby nie przesuwały się ani nie przesuwały na całej długości skanowania. Próbki te muszą być również montowane przy użyciu materiałów, które są prawie przezroczyste dla promieni rentgenowskich. Połączenie styropianu i Parafilmu może być użyte do przymocowania wagi do etapu tomografii komputerowej.
   1. Zamontuj próbkę na sztywno tak, aby najdłuższy wymiar był równoległy do detektora.
   2. Przymocuj zamontowaną próbkę do stolika skanera.
   3. Umieść próbkę tak, aby znajdowała się w środku obrotu przez cały czas skanowania.
   4. Wybierz najwyższą rozdzielczość, która pozwala na to, aby cała skala znajdowała się w polu widzenia (FOV), w tym przypadku 7,5 μm.
4. Ustawienia pobierania
   Wykonaj skany w tym badaniu z krokiem obrotu 0,25° i wartością uśrednienia klatek 15. Jeśli dopuszczalne są niższe rozdzielczości, zwiększ rozmiar kroku i/lub zmniejsz uśrednianie klatek, aby skrócić całkowity czas skanowania.
5. Parametry rekonstrukcji
   Po uzyskaniu zestawu danych zrekonstruuj obrazy projekcji rentgenowskiej, aby utworzyć zestaw danych zawierający obrazy przekrojowe. Wybierz domyślne ustawienia oprogramowania Skyscan NRecon, z wyjątkiem poniższych.
   1. Zmieniono korekcję artefaktu pierścienia na 20.
   2. Zmienić korekcję utwardzenia belki na 25%.
   3. Dostosuj obrót statyczny CS, aby uzyskać poziom obrazu w przekroju poprzecznym.
6. Przetwarzanie obrazu
   Użyj oprogramowania CTAn firmy Skyscan, aby uzyskać ostateczny obraz 3D w skali szarości. Dostosuj zakres skali szarości do odpowiedniego poziomu, aby usunąć artefakty ze styropianu i parafilmu.

5. Obrazowanie SEM i analiza EDX

Próbki przygotowane przez polerowanie do nanoindentacji i charakterystyki mikro/nano-struktury zostały zbadane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Zastosowano tryb niskiej próżni, aby zminimalizować odwodnienie próbek i potrzebę nakładania powłok przewodzących. Przeprowadzono lokalną analizę chemiczną na wypolerowanych próbkach w połączeniu z obrazowaniem SEM przy użyciu spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX). Analizy EDX przeprowadzono na tej samej linii/siatce, która była analizowana za pomocą nanowgłębienia w celu zapewnienia korelacji między właściwościami chemicznymi i mechanicznymi. Świeżo popękane powierzchnie zostały również zbadane przez SEM, aby uzyskać lepsze informacje na temat morfologii i orientacji biomineralizowanych struktur obecnych w rybich łuskach. Aby poprawić rozdzielczość obserwacji struktury w skali nano na spękanych powierzchniach, próbki zostały pokryte złotem (Au) i zobrazowane w trybie wysokiej próżni. Poniżej znajdują się dodatkowe informacje na temat stosowanych procedur.

1. Obrazowanie SEM polerowanych powierzchni
   1. Umieść wypolerowaną próbkę w komorze SEM, a komorę pompy w trybie niskiej próżni przy ciśnieniu w komorze od 0,1 do 0,5 mbar.
   2. Ustaw odległość roboczą na około 5.0 mm.
   3. Aktywuj wysokie napięcie (HV) i przejdź do obszaru zainteresowania na próbce, który obejmuje strefę przejściową między podwarstwami ganoiny i kostnej lub innymi obszarami zainteresowania.
   4. Uzyskuj obrazy przy napięciu WN 15 kV i prądzie wiązki około 3,9 nA.
   5. Ustaw ostrość obrazu i wykonaj wszystkie niezbędne wyrównania i korekty stygmatyzacji.
   6. Uchwyć obrazy z co najmniej trzech obszarów zainteresowania przy odpowiednich powiększeniach (zwykle od 250x do 10 000x) za pomocą detektora elektronów wstecznie rozproszonych (BSE) w niskiej próżni, aby pomóc w identyfikacji zmian zawartości i gęstości biominerałów (tj. gęsta kość vs. porowata kość).
2. Obrazowanie SEM pękniętych powierzchni
   1. Przymocuj świeżo złamaną próbkę do króćca SEM pod kątem 90° za pomocą dwustronnej taśmy węglowej z powierzchnią pęknięcia skierowaną do góry.
   2. Napyl warstwę Au, aby zapewnić warstwę przewodzącą o grubości poniżej nm na powierzchni pęknięcia.
   3. Umieść próbkę w komorze SEM, a komorę pompy w trybie wysokiej próżni.
   4. Dostosuj odległość roboczą w zakresie od 3,0 do 5,0 mm.
   5. Aktywuj HV i przejdź do interesujących obszarów na próbce. Głównymi obszarami zainteresowania w tym przypadku była struktura obecna w warstwie ganoinowej i kostnej.
   6. Uzyskuj obrazy przy napięciu wysokiego napięcia od 5 kV do 15 kV i prądzie wiązki dolnej 0,24 nA w celu poprawy rozdzielczości.
   7. Najpierw skoncentruj próbkę i wykonaj wstępne wyrównanie.
   8. Zwiększ powiększenie do ponad 5,000X i przełącz się z obiektywu z normalną emisją pola na obiektyw immersyjny/o ultrawysokiej rozdzielczości (UHR).
   9. Wykonaj wyrównanie UHR i korekty stygmatyzacji.
   10. Rejestruj obrazy z co najmniej trzech obszarów zainteresowania przy odpowiednich powiększeniach (zwykle od 5 000 do 250 000 razy) za pomocą detektora soczewek przelotowych (TLD) działającego w trybie elektronów wtórnych (SE).
3. Analiza EDX polerowanych powierzchni (wykonywana w połączeniu z obrazowaniem SEM). Parametry te są zależne od materiału i będą musiały zostać dostosowane, aby objętość interakcji EDX była podobna pod względem wielkości do objętości interakcji nanotwardości, jak omówiono przez Mosera¹⁴.
   1. Przejdź do obszaru zainteresowania na wypolerowanej próbce, który zawiera siatkę nanowcięć oznaczoną znakami odniesienia na końcu każdego wiersza wcięć.
   2. Upewnij się, że WN wynosi co najmniej 15 kV, prąd wiązki wynosi co najmniej 3.9 nA, a odległość robocza jest większa niż 5.0 mm.
   3. Przechwytywanie obrazu BSE regionu, który ma być analizowany za pomocą EDX.
   4. Korzystając z oprogramowania do analizy EDX, uchwyć ten sam obraz, aby pomóc w zlokalizowaniu obszarów do przeprowadzenia analizy chemicznej wzdłuż linii wcięć.
   5. Korzystając z techniki "Analizy liniowej", ustaw linię do przeprowadzenia analizy chemicznej wzdłuż linii zainteresowania wcięć, zaczynając od pierwszego wcięcia i kończąc na ostatnim wcięciu.
   6. Określ liczbę punktów analizy, które mają zostać umieszczone wzdłuż linii. Najlepiej jest użyć tej samej liczby punktów analizy i wcięć, które są obecne, aby zapewnić bezpośrednią korelację przestrzenną między składem chemicznym a właściwościami mechanicznymi.
   7. Gdy linia jest prawidłowo ustawiona, a punkty określone, rozpocznij analizę linii za pomocą oprogramowania EDX.
   8. Po zakończeniu analizy liniowej zidentyfikuj interesujące elementy, które należy określić ilościowo, na podstawie widm punktowych uzyskanych wzdłuż określonej linii na wypolerowanej powierzchni próbki.
   9. Po zidentyfikowaniu interesujących elementów należy przeprowadzić kalibrację tła, aby uwzględnić promieniowanie Bremsstrahlung i inne skutki.
   10. Wybierz opcję analizy dekonwolucyjnej oprogramowania, aby uzyskać analizę ilościową dla każdego punktu wzdłuż określonej linii w celu ilościowego określenia składu chemicznego w każdym punkcie.
   11. Zapisz wyniki ilościowej analizy chemicznej wraz z obrazem określonej linii, która została przeanalizowana, aby pomóc w korelacji przestrzennej z właściwościami mechanicznymi zmierzonymi za pomocą nanotwardości.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia średnie wyniki przestrzennie skorelowanych analiz nanoidentyfikacji/SEM/EDX przeprowadzonych na przekroju poprzecznym o długości około 800 μm. W warstwie ganoiny o grubości około 60 μm nanoindenter obliczył średni moduł 69,0 GPa i twardość 3,3 GPa. Nanoindenter określił średni moduł 14,3 GPa i twardość 0,5 GPa dla warstwy kostnej o grubości około 740 μm.

EDX określił węgiel, tlen, wapń i fosfor, które zazwyczaj występują w zmineralizowanych łuskach. Jednak warstwy ganoiny i kości zawierały wymierne różnice w składzie chemicznym. Zaobserwowany skok węgla w warstwie kostnej można przypisać temu, że region ten nie jest tak wysoce zmineralizowany, co powoduje niewielki wzrost węgla, który spowodował również obserwowany spadek ogólnej jasności obrazu BSE. W szczególności średni stosunek stężenia atomowego Ca:P warstwy ganoiny wynoszący 1,71 wydawał się podobny do hydroksyapatytu z teoretycznym stosunkiem 1,67. Średni stosunek Ca:P warstwy kostnej zmniejszył się do 1,51, co oznacza spadek ilości mineralizacji z warstwy ganoiny.

Widma FTIR na rysunku 4 dla warstwy kostnej i warstwy ganoiny zidentyfikowały główne grupy funkcyjne jako amid, karboksylowy, fosforanowy i karbonylowy. W szczególności FTIR potwierdził wizualną obserwację sygnatur hydroksyapatytu w warstwie zewnętrznej (ganoiny) i sygnatur kolagenu w warstwie wewnętrznej (kostnej). Szczyty na wysokości 3,500-3,000 cm⁻¹ spowodowane rozciąganiem NH i zginaniem NH między 1,550 a 1,500 cm⁻¹ reprezentują grupy amidowe w warstwie kostnej. Piki w rejonie fali numer 1,470-1,365 cm⁻¹ reprezentują grupy alkilowe podstawione amidami. Dodatkowo zaobserwowano charakterystyczne rozciągnięcie C=O na poziomie 1,641 cm⁻¹ na warstwie kostnej. Piki od 3 000-2 500 cm⁻¹ reprezentują grupy karboksylowe. Zarówno widma warstwy kości, jak i ganoiny wytworzyły charakterystyczny pik w pobliżu 1079,33 ^cm-1, co wskazuje na rozciąganie się fosforanu.

Zdjęcia rentgenowskie CT na rysunku 5 pokazują, że warstwa ganoiny nie pokrywa warstwy kostnej, gdzie łuski nakładają się na siebie. Jaśniejsze szare warstwy ganoiny wskazują na gęstsze, twardsze i sztywniejsze fazy, podczas gdy ciemniejsze szare warstwy kości wskazują na mniej gęste i mniej sztywne fazy. Ponadto obrazowanie rentgenowskie tomografii komputerowej pomogło w zidentyfikowaniu niejednorodności grubości warstwy ganoiny. W rzeczywistości w pobliżu środka warstwy ganoiny obserwuje się przezroczyste doły, które w ogóle nie pokrywają warstwy kostnej.

Obraz SEM na rysunku 6A powierzchni pęknięcia wytrawiony H₃PO₄ ujawnił nanostruktury zorganizowane w warstwowy wzór warstwy ganoiny. Ta struktura zorganizowana przez nanopręty koreluje z sygnaturami hydroksyapatytu uzyskanymi z FTIR dla obszaru ganoiny.

Rysunek 6A przedstawia typową mikrofotografię SEM o mniejszym powiększeniu powierzchni złamania, wyraźnie identyfikując przejście między warstwami ganoiny i kości za pomocą przerywanej linii. Rysunek 6B przedstawia obrazy SEM powierzchni pęknięcia w większym powiększeniu po wytrawieniu za pomocą H₃PO₄. Po wytrawieniu zorientowane nanopręty w zewnętrznej warstwie ganoiny są wyraźnie identyfikowalne, podczas gdy w warstwie kostnej obserwuje się nanostrukturę przypominającą włókna.

Rysunek 3. Dane dotyczące modułu i twardości z nanowgłębień skorelowane przestrzennie ze składem chemicznym SEM/EDX.

Rysunek 4. Widma FTIR zebrane z warstwy zewnętrznej (ganoina) i wewnętrznej (kostnej).

Rysunek 5. Rentgenowskie obrazy CT pokazujące wżery na zewnętrznej warstwie (ganoiny) pokrywającej warstwę wewnętrzną (kostną).

Rysunek 6. (A) Obraz SEM w małym powiększeniu typowej powierzchni pęknięcia, (B) obrazy w większym powiększeniu nanoprętów w warstwach zewnętrznych (ganoina) i włókien w warstwach wewnętrznych (kostnych). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Z eksperymentalnego punktu widzenia naukowcy muszą pamiętać, że podczas pracy z naturalnie występującymi materiałami biologicznymi, takimi jak zmineralizowane łuski ryb, raportowanie przestrzennego położenia łuski na rybach ma kluczowe znaczenie, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że właściwości mechaniczne zmineralizowanych łusek ryb są zależne od tego, gdzie łuski znajdowały się^{na rybach}.

Wykazano również, że właściwości mechaniczne zmineralizowanych materiałów biologicznych są zależne od stanu uwodnienia próbek⁴. Ogranicza to przydatność tej techniki przy próbie porównania świeżych próbek, które zostały odpowiednio uwodnione, z wynikami opublikowanymi w otwartej literaturze, w których wykorzystuje się suche skamieniałe próbki. W związku z tym należy unikać wydłużania czasu testowania, aby zminimalizować wpływ odwodnienia na właściwości mechaniczne próbki podczas nanotwardości. Zaleca się przeprowadzenie badań pilotażowych dotyczących konkretnego materiału, aby upewnić się, że czas trwania eksperymentu jest wystarczająco minimalny, aby nie zmienić mechanicznego zachowania materiału. Nanoindentacja mokrych komórek byłaby preferowaną metodą utrzymania stałego stanu uwodnienia materiału, jeśli pozwala na to sprzęt testujący.

Metoda nanowgłębienia zastosowana w tym badaniu, w której obliczono moduł sprężystości na podstawie krzywej odciążania, zakłada, że materiał zachowuje się jak liniowy elastyczny materiał izotropowy. Technika ta może być stosowana z różnymi końcówkami wgłębnika. Jednak w tym badaniu zastosowano trójstronną końcówkę Berkovicha o połowie kąta 65,35°. Alternatywne końcówki, takie jak narożnik sześcianu (kąt połówkowy = 35,36°) są odpowiednie dla procedury przedstawionej w tym manusjuście, ale ponieważ końcówka narożnika sześcianu jest ostrzejsza niż końcówka Berkovicha, w próbce mogą powstawać pęknięcia przy znacznie niższych obciążeniach niż w przypadku końcówki Berkovicha.

Polerowanie jest niezbędnym krokiem do uzyskania gładkiej i płaskiej powierzchni o zminimalizowanej chropowatości powierzchni, aby nie wpływać na wyniki nanotwardości. Etapy polerowania przedstawione w tym manuskrypcie są sugerowaną procedurą, która może wymagać modyfikacji w zależności od rodzaju używanej polerki. Jednak krytycznym krokiem w celu zapewnienia dokładnych danych dotyczących nanotwardości jest zminimalizowanie chropowatości powierzchni, a w przypadku tego konkretnego materiału wymagane było końcowe polerowanie 50 nm, aby uzyskać gładką płaską powierzchnię na głębokości wgłębienia, które są sondowane.

Odstępy między wgłębieniami zapewniają również dokładne dane dotyczące nanowgłębień, na które nie mają wpływu deformacje materiału występujące w stosunku do poprzednich wgłębień. Instrukcja obsługi nanoindentera dla sprzętu w tym badaniu sugerowała, że odstępy między wcięciami powinny wynosić co najmniej 20-30x maksymalną głębokość penetracji dla wgłębników Berkovicha¹⁵. W przypadku materiałów alternatywnych wymagane odstępy między wcięciami będą musiały zostać określone na podstawie przyłożonego obciążenia i maksymalnej głębokości wcięcia, jak omówiono wcześniej w dostępnej literaturze^16,17. Dodatkowo, czas utrzymywania tego materiału został wybrany tak, aby przezwyciężyć wszelkie pełzanie obserwowane dla różnych badanych faz materiału, co pozwoliło na zastosowanie metody analizy Olivera-Pharra w oprogramowaniu nanoindenter. Jednak, jak omówiono w Oyen¹⁸ , dostępne są alternatywne metody analizy dla materiałów biologicznych, w przypadku których zależne od czasu reakcje materiału mogą nie zostać przezwyciężone przy odpowiednich czasach podtrzymania.

Aby uzyskać wyniki w wysokiej rozdzielczości z tomografii rentgenowskiej, należy zoptymalizować kilka ustawień. W tym artykule przedstawiono bardzo specyficzny zestaw parametrów do stosowania na rybiej łusce o unikalnym rozmiarze i grubości warstwowej. Przy różnych rozmiarach próby te ustawienia będą musiały zostać dostosowane, aby uzyskać zestaw danych o najwyższej jakości. Proces wyboru każdego parametru powinien być jasno określony w instrukcji obsługi dołączonej do używanej maszyny. Ustawienia skanowania (napięcie, prąd, ekspozycja, wybór filtra) i ustawienia rekonstrukcji (artefakty pierścieniowe, hartowanie wiązki) mogą wymagać modyfikacji w celu uwzględnienia wielu innych rozmiarów próbek i geometrii.

Rentgenowska tomografia komputerowa dostarczyła obrazu morfologii całej skali, identyfikując warstwę ganoiny pokrywającą kostną warstwę materiału tylko tam, gdzie łuski nie zachodziły na siebie. Rentgenowskie obrazy CT wykazały również, że warstwa ganoiny składała się z niejednolitej grubości w całej skali, a nawet wykazywała wgłębienia, które całkowicie nie miały warstwy ganoiny.

Co ciekawe, dane dotyczące nanowgłębień przestrzennie skorelowane z analizą chemiczną SEM/EDX zidentyfikowały ostre dyskretne przejście między 2 warstwami zamiast bardziej stopniowego przejścia obserwowanego dla zmineralizowanych łusek ryb P. senagalus (w Bruet et al. ²).

Połączenie nanotwardości, FTIR, EDX i SEM dostarczyło informacji o właściwościach mechanicznych, analizie chemicznej i strukturze, aby potwierdzić, że warstwa zewnętrzna jest ganoiną o morfologii i chemii podobnej do szkliwa. Dodatkowo techniki te potwierdziły, że warstwa wewnętrzna jest warstwą kostną materiału.

Podsumowując, metody przedstawione w tym badaniu zidentyfikowały procedurę i odpowiadające jej wyniki w celu zbadania zmineralizowanej rybiej łuski A. spatula od struktury masowej do nanostruktury i składu chemicznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Żywica epoksydowa	Buehler	701-501512
Utwardzacz epoksydowy	Buehler	703-501528
Samplkups	Buheler	20-8180
SamplKlips I	Buehler	20-4100-100S
Precyzyjna piła do cięcia	Buehler	Myjka
UltraMet 2002	Buehler	B2510R-MT
Polerka	Buehler	49-1750-160
ziarnistości 1,200 (15 μ m) Papier SiC	Struers	40400012
ziarnistości 4 000 (6 μ m) Papier SiC	Struers	40400014
krzemionka koloidalna 50 nm	Buehler	40-10075
Tarcza polerska Chemomet do zawiesiny 50 nm	Buehler	40-7918
Nanoindenter	MTS	G200
Mikroskop kontinuum FTIR	Thermo Nicollet	6700
Rentgenowska tomografia komputerowa	Skyscan	Skyscan 1173
SEM	FEI	NovaNanoSEM 630
EDX	Detektor Bruker	AXS Xflash 4010
Napylarka natryskowa	Denton	Desk II