Artykuł metodologiczny

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

18.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51536

⸱

20 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Food and Environmental Sciences, University of Helsinki, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Streszczenie

Oczyszczanie powinowactwa białek fuzyjnych oznaczonych Strep-Strep na żywicach zawierających zmodyfikowaną streptawidynę (Strep-Tactin) stało się powszechnie stosowaną metodą izolacji kompleksów białkowych w warunkach fizjologicznych. Białka fuzyjne zawierające dwie kopie Strep-tag II, oznaczone jako twin-Strep-tag lub SIII-tag, mają tę zaletę, że mają wyższe powinowactwo do Strep-Tactin w porównaniu z tymi, które zawierają tylko jeden Strep-tag, umożliwiając w ten sposób bardziej efektywne oczyszczanie białek. Jednak ta zaleta jest równoważona przez fakt, że elucja białek znakowanych podwójnie paciorkowcami za pomocą biotyny może być niekompletna, co prowadzi do niskiego odzysku białka. Odzysk można znacznie poprawić, stosując denaturację elucji za pomocą dodecylosiarczanu sodu (SDS), ale prowadzi to do zanieczyszczenia próbki Strep-Tactin uwalnianym z żywicy, co sprawia, że test jest niezgodny z dalszą analizą proteomiczną. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy metodę, w której sprzężony z żywicą tetramer Strep-Tactin jest najpierw stabilizowany przez kowalencyjne sieciowanie z suberatianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3), a powstała żywica usieciowana jest następnie wykorzystywana do oczyszczania docelowych kompleksów białkowych w jednym etapie oczyszczania partii. Wydajna elucja za pomocą SDS zapewnia dobry odzysk białka, podczas gdy brak zanieczyszczającej Strep-Tactin umożliwia dalszą analizę białek za pomocą spektrometrii mas. Jako dowód słuszności koncepcji opisujemy tutaj protokół oczyszczania białka wirusowego VPg-Pro znakowanego SIII z jąder zakażonych wirusem roślin N. benthamiana przy użyciu żywicy polimetakrylanowej Strep-Tactin usieciowanej BS3. Ten sam protokół może być stosowany do oczyszczania dowolnego białka znakowanego bliźniaczymi paciorkowcami i charakteryzowania jego fizjologicznych partnerów wiążących.

Wprowadzenie

W ostatnich latach technologia Strep-tag stała się szeroko stosowana w wielu dziedzinach badań biomedycznych, w tym w proteomice i biologii strukturalnej. Ta technologia oczyszczania białek, która opiera się na fuzji rekombinowanych białek z krótkim peptydem Strep-Tag, dojrzała wraz z pojawieniem się matryc powinowactwa zawierających Strep-Tactin, genetycznie zmodyfikowany wariant streptawidyny o ulepszonej zdolności wiązania peptydów. 1,2 Białka fuzyjne zawierające dwie kopie Strep-tag II, oznaczone jako twin-Strep-tag lub SIII-tag, wykazują większe powinowactwo do matryc Strep-Tactin niż te zawierające tylko jeden Strep-tag, zapewniając bardziej efektywne oczyszczanie rekombinowanych białek i związanych z nimi partnerów wiążących. Jednak wyższe powinowactwo białek znakowanych bliźniaczymi paciorkowcami do Strep-Tactin ma również swoje wady. Kompetycyjna elucja takich białek z nadmiarem biotyny może być niekompletna, co prowadzi do zmniejszenia docelowej wydajności białka. Bardziej wydajną alternatywą jest elucja za pomocą SDS, ale prowadzi ona do niepożądanego zanieczyszczenia próbki Strep-Tactin uwalnianą z żywicy, co sprawia, że test jest niezgodny z analizą proteomiczną. W artykule przedstawiono technikę przezwyciężenia tego ograniczenia poprzez najpierw stabilizację tetrameru sprzężonego z żywicą Strep-Tactin poprzez chemiczne sieciowanie, a następnie użycie SDS do elucji białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i powiązanych z nimi kompleksów z powstałej żywicy usieciowanej. W ten sposób można osiągnąć wystarczającą wydajność białka bez zanieczyszczenia próbki Strep-Tactin, co umożliwia dalszą analizę za pomocą spektrometrii mas.

Metoda jest odpowiednia do oczyszczania dowolnego rekombinowanego białka fuzyjnego z powierzchniowo eksponowanym znacznikiem SIII-tag3 lub podwójnym znacznikiem Strep-tag (sekwencja aminokwasów WSHPQFEK(GGGS)3 WSHPQFEK i SAWSHPQFEK(GGGS)2 GGSAWSHPQFEK, odpowiednio). Białko może być pochodzenia zwierzęcego, roślinnego lub bakteryjnego i może być wyizolowane z całkowitego lizatu komórkowego lub wzbogaconej frakcji organelli. Jako przykład opisujemy tutaj oczyszczanie znakowanego SIII białka VPg-Pro wirusa ziemniaka A (PVA)4 z frakcji jądrowej roślin Nicotiana benthamiana zakażonych PVA. Frakcję jądrową wyizolowano zgodnie z wcześniejszym opisem5, z następującymi modyfikacjami: komórki nie traktowano formaldehydem, maślan sodu podstawiono we wszystkich 5 mM fluorkiem sodu, kompletny inhibitor proteazy zastąpiono PMSF, stężenie Triton X-100 w buforze ekstrakcyjnym #2 obniżono do 0,3% (v/v), a osad jądrowy otrzymany przez odwirowanie przez poduszkę sacharozową (bufor ekstrakcyjny #3) zawieszono ponownie w 1,45 ml wstępnie schłodzonego wiązania bufor i obracany przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C. Otrzymany ekstrakt jądrowy zawierający białko przynęty znakowane SIII i związane z nim kompleksy (próbka białka przynęty) został przetworzony zgodnie z protokołem opisanym poniżej (patrz sekcja 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sieciowanie żywicy polimetakrylanowej Strep-Tactin z podergatem bis(sulfosuccinimidylu) (BS3)

  1. Zrównoważyć jedną szczelną mikroprobówkę zawierającą 2 mg środka sieciującego BS3 do temperatury pokojowej. UWAGA: BS3 jest substancją niebezpieczną. Nosić rękawice i okulary ochronne.
  2. Ponownie zawiesić żywicę polimetakrylanową Strep-Tactin (50% zawiesiny w 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) przez krótkie, energiczne wstrząsanie i natychmiast przenieść 600 μl zawiesiny do kolumny wirowej za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem.
  3. Wirować przy 1 500 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić przepływowy płyn i dodać 450 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do kolumny.
  4. Powtórz poprzedni krok jeszcze 2 razy, aby całkowicie zastąpić bufor Tris PBS i pozostawić żywicę w 430 μl PBS dostosowanym do pH 8,0 po ostatnim odwirowaniu.
  5. Nakłuć folię mikroprobówki za pomocą BS3 za pomocą końcówki pipety zawierającej 100 μl ultraczystej wody. Rozpuść proszek BS3 w wodzie, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie natychmiast dodaj 20 μl roztworu do kolumny wirowej. Końcowe stężenie BS3 w reakcji sieciowania wynosi ~1,2 mM.
  6. Obracaj kolumnę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Sprawdź, czy żywica jest prawidłowo wymieszana z roztworem BS3.
  7. Aby wygasić reakcję, dodaj 6 μl 3M Tris-HCl o pH 7,5 i obracaj kolumnę przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Wirować przy 1 500 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić przepływowy roztwór i ponownie zawiesić usieciowaną żywicę w 450 μl soli fizjologicznej buforowanej Tris za pomocą Tween 20 (TBST). Powtórz etapy wirowania i mycia jeszcze dwa razy. Na ostatnim etapie należy ponownie zawiesić żywicę w 450 μl TBS.
  9. Przenieść zawiesinę żywicy do świeżej probówki za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem. Ponownie zawiesić żywicę pozostałą w kolumnie z kolejnymi 450 μl TBS i przenieść do tej samej probówki. Powtórz ostatni krok jeszcze raz, aby zapewnić maksymalny transfer żywicy z kolumny do probówki.
  10. Pozostaw probówkę na 10 minut w temperaturze pokojowej i dostosuj objętość do 600 μl, usuwając nadmiar TBS. Żywica jest gotowa do natychmiastowego użycia (zalecane) lub może być przechowywana w temperaturze 4 °C, bez zamrażania.

2. Wiązanie białka przynęty znakowanego podwójnie paciorkowcami i powiązanych kompleksów z usieciowaną żywicą polimetakrylanową Strep-Tactin

  1. Odwirować 1 ml próbki białka przynęty w buforze wiążącym o sile 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do świeżej probówki.
  2. Aby zminimalizować wiązanie endogennych biotynylowanych białek z żywicą Strep-Tactin, należy dodać awidynę do końcowego stężenia 100 μg/ml i obracać przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Jeżeli żywica usieciowana z kroku 1.10 była przechowywana przez dłuższy czas w temperaturze 4 °C, zebrać żywicę przez odwirowanie w temperaturze 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i przemyć żywicę 1 ml TBST. Powtórzyć etapy wirowania i płukania jeszcze dwa razy, najpierw z TBST, a następnie z TBS. Odwirować probówkę o stężeniu 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i dostosować do pierwotnej objętości, usuwając nadmiar TBS.
  3. Ponownie zawiesić usieciowaną żywicę Strep-Tactin przez wirowanie. Natychmiast dodać 50 μl zawiesiny żywicy do probówki zawierającej próbkę białka przynęty za pomocą przeciętej końcówki pipety i obracać przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Czekając, ustaw termomikser na 55 °C i podgrzej 500 μl buforu elucyjnego do użycia w kroku 3.1.
  5. Wirować przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemywać żywicę na rotatorze przez 5 minut w temperaturze 4 °C z 1 ml wstępnie schłodzonego buforu do przemywania #1. Powtórz etapy wirowania i mycia trzy razy. W ostatnim kroku ponownie zawieś żywicę w 250 μl buforu do płukania #2.
  6. Przenieś zawiesinę żywicy do nowej kolumny wirowej. Zawiesić żywicę pozostałą w probówce w kolejnych 250 μl buforu płuczącego #2 i przenieść do tej samej kolumny.
  7. Wirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić przepływ i przenieść kolumnę do świeżej probówki o pojemności 2 ml z nosem delfina. Przejdź natychmiast do poniższego etapu elucji.

3. Elucja specyficznych kompleksów białkowych

  1. Dodać 150 μl wstępnie podgrzanego buforu elucyjnego z kroku 2.4 do kolumny wirowej.
  2. Inkubować w termomieszalniku przez 5 minut w temperaturze 55 °C, wstrząsając z prędkością 1 400 obr./min.
  3. Wirować przy 1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  4. Odrzucić kolumnę i przechowywać oczyszczone białka docelowe w temperaturze ≤ -20 °C.
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Na2HPO410 mM
KH2PO42mM
NaCl137 mM
KCl2,7 mM
pH dostosowane do 7,4, chyba że zaznaczono inaczej (pH 8,0 w sekcji 1.4)
Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)
Tris-HCl, pH 7.450 mM
NaCl150 mM
Sól fizjologiczna buforowana Tris z Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7.450 mM
NaCl150 mM
Animacja 200.1% (v/v)
Bufor wiązania
Tris-HCl, pH 8.025 mM
NaCl550 mM
NaF5 mM
EDTA0,5 mM
Glicerol10% (pionowo)
PMSF0.1 mM
Bufor mycia #1
Tris-HCl, pH 8.025 mM
NaCl500 mM
NaF5 mM
EDTA0,4 mM
Igepal CA-6300.2% (v/v)
Glicerol5% (v/v)
PMSF0.1 mM
Bufor mycia #2
Tris-HCl, pH 8.025 mM
NaCl150 mM
Bufor elucji
Tris-HCl, pH 8.025 mM
SDS1% (szer./szer.)

Tabela 1. wykorzystane w niniejszym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Procedura oczyszczania została schematycznie przedstawiona na Rysunku 1, wraz z przedstawieniem problemów związanych z innymi istniejącymi metodami oczyszczania.

Schemat procesu oczyszczania białek z wykorzystaniem Strep-Tactin, SDS PAGE oraz analizy LC-MS/MS.
Rysunek 1. Sche...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powyższy protokół może być stosowany do oczyszczania dowolnego białka przynęty znakowanego podwójnie paciorkowcami i powiązanych z nim kompleksów w dowolnym odpowiednim buforze, który nie zawiera biotyny ani silnych denaturantów. W obecnej wersji protokołu wiązanie i pranie odbywa się w stosunkowo rygorystycznych warunkach w obecności wysokiej zawartości soli i niejonowego detergentu. Chociaż powoduje to mniejsze tło, delikatne kompleksy białkowe mogą dysocjować w tych warunkach. Aby zachować takie kompleksy o niższym po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie techniczne Sini Miettinen, Minna Pöllänen i Taru Rautavesi. Dziękujemy Helce Nurkkala za dostarczenie komórek HEK 293 wykazujących ekspresję GFP znakowanego podwójnie Strep oraz Pekce Evijärvi za dostarczenie sprzętu do nagrywania dźwięku. Praca ta została sfinansowana przez Akademię Fińską, granty o numerach 138329, 134684 i 258978.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Suberat bis(sulfosuccinimidylu) (BS3), format No-Wagh, 8 x 2 mgPierce/Thermo Scientific21585www.fishersci.com UWAGA: Substancja niebezpieczna. Powoduje poważne podrażnienie dróg oddechowych, skóry i oczu. Nosić rękawice ochronne i okulary ochronne.
Żywica Strep-Tactin MacroPrep (50% zawiesina)IBA2-1505www.iba-lifesciences.com
Filtr probówkowy wirówkowy Spin-X, membrana z octanu celulozy, wielkość porów 0,45 i mu; m, niesterylneCostar (Corning)8163www.corning.com/lifesciences/
Rurki z nosem delfinaCostar (Corning)3213www.corning.com/lifesciences/
Avidin IBA2-0204www.iba-lifesciences.com

Bibliografia

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie za pomoc Twin Strep tagsieciowanie BS3elucja SDSizolacja kompleks w bia kowychanaliza spektrometryczna masoczyszczanie VPg Proro liny N benthamianaoczyszczanie powinowactwaywica sieciowana

Powiązane artykuły