Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Podsumowanie

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi jest szeroko stosowany do wizualizacji i definiowania sygnalizacji w pojedynczych mikronaczyniach. Dzięki połączeniu tego preparatu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym, możliwe staje się określenie zmian przepuszczalności w poszczególnych mikronaczyniach płucnych. W tym artykule opisujemy kroki izolowania płuc szczura i perfuzji ich krwią autologiczną. Następnie przedstawiamy kroki, które należy wykonać, aby wprowadzić fluorofory lub środki za pomocą mikrocewnika do małego obszaru płuc. Korzystając z opisanych procedur, określiliśmy wzrost przepuszczalności mikronaczyń płuc szczura w odpowiedzi na wlewy lipopolisacharydu bakteryjnego. Dane ujawniły, że lipopolisacharyd zwiększył wyciek płynu zarówno w odcinkach mikronaczyń komorowych, jak i włosowatych. W związku z tym metoda ta umożliwia porównanie odpowiedzi przepuszczalności między segmentami naczyniowymi, a tym samym zdefiniowanie dowolnej niejednorodności odpowiedzi. Podczas gdy powszechnie stosowane metody określania przepuszczalności płuc wymagają przetwarzania końcowego próbek tkanki płucnej, zastosowanie obrazowania w czasie rzeczywistym eliminuje ten wymóg, co wynika z obecnej metody. W związku z tym izolowane przygotowanie płuc w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami określania przepuszczalności mikronaczyniowej płuc, a jednocześnie jest metodą prostą do opracowania i wdrożenia.

Wprowadzenie

Zwiększona przepuszczalność mikronaczyniowa w płucach prowadzi do rozwoju obrzęku pęcherzyków płucnych i upośledzenia wymiany gazowej i jest główną cechą ostrego uszkodzenia płuc (ALI)^1-3. W związku z tym szacunki przepuszczalności naczyń krwionośnych są ważne w określaniu zakresu uszkodzenia płuc i skuteczności proponowanych interwencji terapeutycznych. Analiza grawimetryczna, taka jak stosunek mokrej do suchej płuc bez krwi i współczynnik filtracji mikronaczyniowej, są szeroko stosowanymi metodami do szacowania przepuszczalności^4,5. Inne metody obejmują ilościowe określanie retencji sond radioaktywnych lub fluorescencyjnych w tkance płucnej^6-8. Jednak powyższe metody wymagają poeksperymentalnego przetwarzania próbek tkanki płucnej w celu wyjaśnienia danych dotyczących przepuszczalności. Ponadto, ponieważ jedno zwierzę może być wykorzystane tylko do jednego protokołu leczenia, do przeprowadzenia pełnego badania może być potrzebna duża liczba zwierząt. Wspólną cechą powyższych metod jest to, że określają one średnią przepuszczalność naczyń krwionośnych dla wszystkich naczyń krwionośnych w próbce tkanki. Wiadomo jednak, że mikro- i makronaczynia płucne różnią się fenotypowo⁹. W związku z tym reakcje przepuszczalności mogą być również niejednorodne między różnymi segmentami naczyń^9,10. W związku z tym ilościowe określenie średniej przepuszczalności wszystkich naczyń płucnych w próbce tkanki może nie odzwierciedlać odpowiednio tej niejednorodności.

W izolowanym preparacie płuc z perfuzją krwi, naczynia krwionośne na powierzchni płuc mogą być widoczne za pomocą mikroskopu pionowego^4,11,12. Umożliwia to scharakteryzowanie odpowiedzi w pojedynczych naczyniach, a tym samym zajęcie się dowolną niejednorodnością w odpowiedziach¹³. Ponadto, wykorzystując obrazowanie fluorescencyjne mikronaczyń, można włączyć testy oparte na fluorescencji. Ponadto mikrocewnik lewego przedsionka może być używany do dostarczania środków i sond fluorescencyjnych do naczyń krwionośnych^11,14. Mikrocewnik ogranicza dostarczanie do małego obszaru płuc, narażając w ten sposób tylko naczynia krwionośne w tym regionie na działanie podawanych w infuzji środków i fluoroforów. Pozwala to na wykorzystanie wielu małych obszarów w tym samym płucu do oddzielnych eksperymentów, co prowadzi do ogólnego zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych do badania.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym umożliwia uchwycenie dynamicznych zmian we fluorescencji naczyniowej i zewnątrznaczyniowej pojedynczych mikronaczyń izolowanego preparatu płucnego. W ten sposób dla każdego mikronaczynia w polu obrazu można zarejestrować zmiany fluorescencji podczas infuzji fluoroforów i zmywania oraz określić ilościowo offline¹⁴. Korzystając z wartości maksymalnej i resztkowej fluorescencji naczyniowej, można określić wskaźnik przepuszczalności dla każdego mikronaczynia w polu obrazowania. Aby określić zmiany przepuszczalności w odpowiedzi na czynniki zapalne lub uszkadzające, można najpierw podać pożądany środek, a następnie określić wskaźnik przepuszczalności. Ponadto pole obrazu można ustawić w dowolnym miejscu w obszarze płuc podawanym przez mikrocewnik, co zapewnia wysoki stopień elastyczności w doborze pożądanej sieci naczyniowej. W związku z tym izolowany preparat płuc z perfuzją krwi w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym stanowi atrakcyjny model eksperymentalny do ilościowego określania przepuszczalności w pojedynczych mikronaczyniach płucnych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee.

1. Rurki do perfuzji preparatów płuc szczurów

1. Przygotuj system rurek z rurką Tygon (#18) do perfuzji krwi, jak pokazano na rysunku 1. Podłącz przetworniki ciśnienia (P23XL) i umieść rurkę na stoliku mikroskopu.
2. Ustawić temperaturę łaźni wodnej na 37 °C.
3. Połącz tymczasowo wlot i wylot płuc za pomocą rurki Tygon.

Rysunek 1. Rurka do perfuzji krwi. Schemat przedstawia konfigurację przewodów używanych do krążenia krwi przez izolowany preparat płucny. Wskazane są również powiązane elementy, przez które prowadzona jest rurka. Dołączono schemat serca i płuc, aby pokazać miejsca połączenia między rurką a tętnicą płucną (PA) i kaniulą lewego przedsionka (LA) (niebieskie linie przerywane).

2. Przygotowanie izolowanych płuc szczura

1. Znieczulenie szczurów (samce szczurów Sprague-Dawley; 250-300 g) ketaminą (80-100 mg/kg) i ksylazyną (5-10 mg/kg). Po zapewnieniu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia ułóż zwierzę w pozycji leżącej.
2. Wykonać tracheostomię, wprowadzić kaniulę tchawicy (PE-90) i zabezpieczyć szwem chirurgicznym.
3. Wlej heparynę (100-200 j.) do serca przez nakłucie serca (igła motylkowa 21 G), odczekaj 60 sekund i wykrwawij krew (~12-15 ml krwi).
4. Przygotuj dwie kaniule (rurka Tygon o średnicy 3 mm; długości 4 cm; rozszerzona na jednym końcu) i napełnij solą fizjologiczną.
5. Wykonaj torakotomię. Wykonaj nacięcie (3 mm) na prawej komorze i wsuń rozszerzony koniec kaniuli do nacięcia w kierunku tętnicy płucnej. Przymocuj kaniulę do tętnicy płucnej za pomocą szwów chirurgicznych.
6. Naciąć (3 mm) wierzchołek lewej komory i wsunąć rozszerzony koniec drugiej kaniuli do nacięcia. Wprowadź kaniulę do lewego przedsionka. Przymocuj kaniulę do lewej komory za pomocą taśmy pępowinowej (szerokość 2 mm).
7. Wypreparuj tkankę łączną i usuń płuco i serce wraz z dołączonymi kaniulami. Umieść płuco i serce na szalce Petriego. Zmień położenie płuca tak, aby powierzchnia przepony znajdowała się na górze. Trzy kaniule powinny być skierowane w tym samym kierunku.
8. Umieść preparat płucny na stoliku, którym można manipulować w kierunkach X-Y. Każdy stolik dostarczony z mikroskopem można zmodyfikować tak, aby utrzymywał rurkę lub w razie potrzeby zbudować stolik na zamówienie.

3. Perfuzja krwi w izolowanych płucach szczura

1. Wykrwawioną krew wymieszać z roztworem albuminy o równej objętości (5%) i dodać do zbiornika. Uruchom pompę perystaltyczną i ustaw natężenie przepływu na 14 ml/min. Pozwól, aby krew wypełniła rurkę.
2. Przy otwartej zastawce wyjmij tymczasowe złącze wlotowo-wylotowe płuc. Podłącz tętnicę płucną i kaniulę lewego przedsionka odpowiednio do wlotu i wylotu płuca. Upewnij się, że w wężyku nie ma pęcherzyków powietrza.
3. Podłącz kaniulę tchawicy do trzeciego przetwornika ciśnienia (P23XL). Napełnij płuca 30% tlenem przez kaniulę tchawicy i utrzymuj ciśnienie na poziomie 5 cm_H2O.
4. Zamknij zastawkę zaciskiem, aby rozpocząć perfuzję płuc. Utrzymuj ciśnienie w tętnicy płucnej i lewym przedsionku odpowiednio na poziomie ~10 i 3 cm_H2O.

4. Przygotowanie płuc do infuzji mikronaczyniowej

1. Podnieś tylny koniec rurki przedłużającej cewnik powyżej poziomu płuc i zabezpiecz.
2. Przygotuj cewnik infuzyjny, wkładając około 30 cm rurki PE10 o długości 40 cm do rurki PE90 o długości ~30 cm. Podłączyć odsłonięty koniec rurki PE10 do igły (30 G) przymocowanej do strzykawki (1 cm³).
3. Włóż kombinację cewnika do podniesionego tylnego końca rurki przedłużającej. Przeprowadzić kombinację cewnika przez lewy przedsionek i do płuca, aż napotka opór. Następnie wepchnij sam cewnik PE10 głębiej do płuc, aż napotka opór. Należy pamiętać, że przyłożenie nadmiernej siły podczas wkładania cewnika spowoduje uszkodzenie płuca.
4. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem Ringera i podłączyć do pompy strzykawkowej. Ustawić szybkość infuzji na 10 μl/min.
5. Miejsce infuzji stanie się blade w porównaniu z resztą płuc.
6. Zwilżyć płuco solą fizjologiczną i przykryć płuco folią z otworem wystarczająco dużym, aby miejsce infuzji pozostało odkryte.
7. Przetrzyj trochę smaru z kurka na dnie O-ringu (wykonanego na zamówienie) i umieść szklane szkiełko nakrywkowe (#1.5, średnica 22 mm) na spodzie O-ringu. Delikatnie umieść O-ring ze szkiełkiem nakrywkowym w miejscu infuzji. Zabezpiecz O-ring za pomocą standardowego uchwytu na probówki. Kombinacja szkiełka nakrywkowego i pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym nie zniekształca struktur pęcherzykowych znajdujących się pod nim, jak niedawno doniesiono¹⁵.
8. Umieść obiektyw (20X) mikroskopu fluorescencyjnego nad pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym i skup się na powierzchni płuc.

5. Obrazowanie fluorescencyjnego tranzytu dekstranu przez mikronaczynia

1. Przygotuj mikroskop do obrazowania kwiatostanu FITC.
2. Wybierz obszar do zobrazowania i uzyskuj obrazy z szybkością 1/minutę za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów.
3. Rozpocząć infuzję FITC-dekstranu 20 kD (0,5 mg/ml) za pomocą pompy strzykawkowej. Fluorescencja w naczyniach krwionośnych będzie się stopniowo zwiększać i osiągnie maksimum. Kontynuować infuzję przez 60 minut.
4. Następnie przełącz się na napar Ringera, aby zmyć fluorescencję światła. Utrzymuj infuzję przez ponad 10 minut. Kontynuuj akwizycję obrazu z prędkością 1/min podczas zmywania.

6. Analiza obrazu

1. Otwórz plik pobierania obrazu.
2. Umieść interesujące obszary nad mikronaczyniami w ramce obrazu.
3. Odtwórz plik obrazu klatka po klatce i zapisz intensywność fluorescencji w każdym obszarze zainteresowania dla wszystkich klatek.
4. Wykreśl zmianę intensywności fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania w funkcji czasu.
5. Określić ilościowo maksymalną intensywność fluorescencji i resztkową intensywność fluorescencji po 10 minutach zmywania.
6. Oblicz stosunek maksymalnej do resztkowej intensywności fluorescencji w każdym obszarze zainteresowania, aby uzyskać wskaźnik przepuszczalności dla mikronaczyń związanych z tym obszarem zainteresowania.

Wyniki

Na rysunku 2 pokazano izolowany preparat płucny z perfuzją krwi podłączony do rurki perfuzyjnej i związanego z nią sprzętu. Do celów demonstracyjnych użyliśmy szczura Sprague Dawley, chociaż opisane tutaj procedury można stosować z każdym gatunkiem szczurów. Wlewy przez mikrocewnik lewego przedsionka docierają tylko do niewielkiego obszaru płuca. Obszar infuzji można zidentyfikować po przebarwieniach wywołanych infuzją (ryc. 3). Przygotowanie płuc do obrazowania w czasie rzeczywistym pok...

Dyskusja

Izolowany preparat płuc z perfuzją krwi w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym stanowi proste narzędzie do określania zmian przepuszczalności w pojedynczych mikronaczyniach płucnych. Zastosowaliśmy tę metodę do zdefiniowania zmian przepuszczalności w odpowiedzi na infuzje LPS. Nasze dane jednoznacznie sugerują, że infuzja LPS spowodowała wzrost przepuszczalności mikronaczyniowej. Co więcej, dane wskazują również, że zmiany przepuszczalności wywołane przez LPS były podobne zarówno w żyłkach, jak i naczyniach wł...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tygon Rurka	Fisher Scientific		#18
Przetwornik ciśnienia	Data Sciences International	P23XL	Potrzebna ilość 3
Igła motylkowa	Greiner Bio-One	450081	21 G
Pompa perystaltyczna	Cole	Parmer Masterflex L/S
PE-90	rurka Becton Dickinson	427421	30 cm potrzebna
Rurka PE-10	Becton Dickinson	427401	potrzebna 40 cm
Pompa strzykawkowa	O-ring
	Wykonane na zamówienie z otworem o średnicy 20 mm i uchwytem do mocowania O-ringu do uchwytu
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0,5 mg/ml (można wybrać dekstran o różnej wielkości cząsteczki, jeśli doświadczenia próbne wskazują na jego przydatność na podstawie obliczonych wartości wskaźnika przepuszczalności)
Lipopolisacharyd	Sigma Aldrich		Serotyp 0111:B4