Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi jest szeroko stosowany do wizualizacji i definiowania sygnalizacji w pojedynczych mikronaczyniach. Dzięki połączeniu tego preparatu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym, możliwe staje się określenie zmian przepuszczalności w poszczególnych mikronaczyniach płucnych. W tym artykule opisujemy kroki izolowania płuc szczura i perfuzji ich krwią autologiczną. Następnie przedstawiamy kroki, które należy wykonać, aby wprowadzić fluorofory lub środki za pomocą mikrocewnika do małego obszaru płuc. Korzystając z opisanych procedur, określiliśmy wzrost przepuszczalności mikronaczyń płuc szczura w odpowiedzi na wlewy lipopolisacharydu bakteryjnego. Dane ujawniły, że lipopolisacharyd zwiększył wyciek płynu zarówno w odcinkach mikronaczyń komorowych, jak i włosowatych. W związku z tym metoda ta umożliwia porównanie odpowiedzi przepuszczalności między segmentami naczyniowymi, a tym samym zdefiniowanie dowolnej niejednorodności odpowiedzi. Podczas gdy powszechnie stosowane metody określania przepuszczalności płuc wymagają przetwarzania końcowego próbek tkanki płucnej, zastosowanie obrazowania w czasie rzeczywistym eliminuje ten wymóg, co wynika z obecnej metody. W związku z tym izolowane przygotowanie płuc w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami określania przepuszczalności mikronaczyniowej płuc, a jednocześnie jest metodą prostą do opracowania i wdrożenia.
Wprowadzenie
Zwiększona przepuszczalność mikronaczyniowa w płucach prowadzi do rozwoju obrzęku pęcherzyków płucnych i upośledzenia wymiany gazowej i jest główną cechą ostrego uszkodzenia płuc (ALI)1-3. W związku z tym szacunki przepuszczalności naczyń krwionośnych są ważne w określaniu zakresu uszkodzenia płuc i skuteczności proponowanych interwencji terapeutycznych. Analiza grawimetryczna, taka jak stosunek mokrej do suchej płuc bez krwi i współczynnik filtracji mikronaczyniowej, są szeroko stosowanymi metodami do szacowania przepuszczalności4,5. Inne metody obejmują ilościowe określanie retencji sond radioaktywnych lub fluorescencyjnych w tkance płucnej6-8. Jednak powyższe metody wymagają poeksperymentalnego przetwarzania próbek tkanki płucnej w celu wyjaśnienia danych dotyczących przepuszczalności. Ponadto, ponieważ jedno zwierzę może być wykorzystane tylko do jednego protokołu leczenia, do przeprowadzenia pełnego badania może być potrzebna duża liczba zwierząt. Wspólną cechą powyższych metod jest to, że określają one średnią przepuszczalność naczyń krwionośnych dla wszystkich naczyń krwionośnych w próbce tkanki. Wiadomo jednak, że mikro- i makronaczynia płucne różnią się fenotypowo9. W związku z tym reakcje przepuszczalności mogą być również niejednorodne między różnymi segmentami naczyń9,10. W związku z tym ilościowe określenie średniej przepuszczalności wszystkich naczyń płucnych w próbce tkanki może nie odzwierciedlać odpowiednio tej niejednorodności.
W izolowanym preparacie płuc z perfuzją krwi, naczynia krwionośne na powierzchni płuc mogą być widoczne za pomocą mikroskopu pionowego4,11,12. Umożliwia to scharakteryzowanie odpowiedzi w pojedynczych naczyniach, a tym samym zajęcie się dowolną niejednorodnością w odpowiedziach13. Ponadto, wykorzystując obrazowanie fluorescencyjne mikronaczyń, można włączyć testy oparte na fluorescencji. Ponadto mikrocewnik lewego przedsionka może być używany do dostarczania środków i sond fluorescencyjnych do naczyń krwionośnych11,14. Mikrocewnik ogranicza dostarczanie do małego obszaru płuc, narażając w ten sposób tylko naczynia krwionośne w tym regionie na działanie podawanych w infuzji środków i fluoroforów. Pozwala to na wykorzystanie wielu małych obszarów w tym samym płucu do oddzielnych eksperymentów, co prowadzi do ogólnego zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych do badania.
Obrazowanie w czasie rzeczywistym umożliwia uchwycenie dynamicznych zmian we fluorescencji naczyniowej i zewnątrznaczyniowej pojedynczych mikronaczyń izolowanego preparatu płucnego. W ten sposób dla każdego mikronaczynia w polu obrazu można zarejestrować zmiany fluorescencji podczas infuzji fluoroforów i zmywania oraz określić ilościowo offline14. Korzystając z wartości maksymalnej i resztkowej fluorescencji naczyniowej, można określić wskaźnik przepuszczalności dla każdego mikronaczynia w polu obrazowania. Aby określić zmiany przepuszczalności w odpowiedzi na czynniki zapalne lub uszkadzające, można najpierw podać pożądany środek, a następnie określić wskaźnik przepuszczalności. Ponadto pole obrazu można ustawić w dowolnym miejscu w obszarze płuc podawanym przez mikrocewnik, co zapewnia wysoki stopień elastyczności w doborze pożądanej sieci naczyniowej. W związku z tym izolowany preparat płuc z perfuzją krwi w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym stanowi atrakcyjny model eksperymentalny do ilościowego określania przepuszczalności w pojedynczych mikronaczyniach płucnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee University of Tennessee Health Science Center.
1. Przewody do perfuzji preparatów płuc szczura
- Przygotować układ przewodów z rurek Tygon (#18) do perfuzji krwi, zgodnie z Rysunkiem 1. Podłączyć przetworniki ciśnienia (P23XL) i umieścić przewody na stoliku mikroskopu.
- Ustawić temperaturę kąpieli wodnej na 37 °C.
- Połączyć tymczasowo wlot i wylot płuca za pomocą rurek Tygon.
Rycina 1. Przewody do perfuzji krwi. Schemat przedstawia układ przewodów użytych do krążenia krwi w preparacie izolowanych płuc. Wskazano również powiązane komponenty, przez które prowadzone są przewody. Dołączono schemat serca i płuc, aby pokazać miejsca połączeń między przewodami a kaniulą tętnicy płucnej (PA) oraz kaniulą lewego przedsionka (LA) (niebieskie przerywane linie).
2. Przygotowanie izolowanych płuc szczura
- Zanurzyć szczury (samce szczurów Sprague-Dawley; 250-300 g) w anestezji za pomocą ketaminy (80-100 mg/kg) oraz ksylazyny (5-10 mg/kg). Po upewnieniu się, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, ułożyć je w pozycji na plecach.
- Wykonać tracheotomię, wprowadzić kaniulę tchawiczą (PE-90) i zabezpieczyć ją szwem chirurgicznym.
- Wprowadzić heparynę (100-200 U) do serca poprzez punkcję serca (igła motylkowa 21 G), odczekać 60 sec i przeprowadzić upuszczenie krwi (~12-15 ml krwi).
- Przygotować dwie kaniule (rurki Tygon, średnica 3 mm; długość 4 cm; jeden koniec rozszerzony) i napełnić je solą fizjologiczną.
- Wykonać torakotomię. Wykonać nacięcie (3 mm) w prawej komorze i wsunąć rozszerzony koniec kaniuli przez nacięcie w kierunku tętnicy płucnej. Zabezpieczyć kaniulę w tętnicy płucnej szwami chirurgicznymi.
- Naciąć (3 mm) szczyt lewej komory i wsunąć rozszerzony koniec drugiej kaniuli przez nacięcie. Poprowadzić kaniulę do lewego przedsionka. Zabezpieczyć kaniulę w lewej komorze za pomocą taśmy pępkowej (szerokość 2 mm).
- Przeprowadzić preparację tkanki łącznej, a następnie usunąć płuco i serce wraz z przyłączonymi kaniulami. Umieścić płuco i serce na szalce Petriego. Przemieścić płuco tak, aby powierzchnia przeponowa znajdowała się na górze. Trzy kaniule powinny być skierowane w tym samym kierunku.
- Umieścić preparat płuca na stoliku, który można przesuwać w kierunkach X-Y. Dowolny stolik dołączony do mikroskopu może zostać zmodyfikowany w celu utrzymania rurek lub, w razie potrzeby, można zbudować specjalny stolik.
3. Perfuzja krwi izolowanych płuc szczura
- Wymieszać upuszczoną krew z równą objętością roztworu albuminy (5%) i przelać do zbiornika. Uruchomić pompę perystaltyczną i ustawić szybkość przepływu na 14 ml/min. Pozwolić krwi wypełnić przewody.
- Przy otwartym boczniku usunąć tymczasowy konektor wlotowo-wylotowy płuc. Podłączyć kaniulę tętnicy płucnej do wlotu płuc, a kaniulę lewego przedsionka do wylotu. Upewnić się, że w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza.
- Podłączyć kaniulę tchawiczą do trzeciego przetwornika ciśnienia (P23XL). Napompować płuca tlenem o stężeniu 30% przez kaniulę tchawiczą i utrzymywać ciśnienie na poziomie 5 cm H2O.
- Zamknąć bocznik za pomocą zacisku, aby rozpocząć perfuzję płuc. Utrzymywać ciśnienie w tętnicy płucnej i lewym przedsionku odpowiednio na poziomie ~10 i 3 cm H2O.
4. Przygotowanie płuc do infuzji mikro naczyniowej
- Unieś tylny koniec rurki przedłużającej cewnika powyżej poziomu płuca i zabezpiecz go.
- Przygotuj cewnik infuzyjny, wsuwając około 30 cm rurki PE10 o długości 40 cm do rurki PE90 o długości około 30 cm. Połącz odsłonięty koniec rurki PE10 z igłą (30 G) przymocowaną do strzykawki (1 cc).
- Wsuń zestaw cewników do uniesionego tylnego końca rurki przedłużającej. Przeprowadź zestaw cewników przez lewy przedsionek do płuca, aż napotkasz opór. Następnie wsuń sam cewnik PE10 głębiej do płuca, aż napotkasz opór. Należy pamiętać, że zastosowanie nadmiernej siły podczas wprowadzania cewnika spowoduje uszkodzenie płuca.
- Napełnij strzykawkę 1 cc roztworem Ringera i podłącz ją do pompy infuzyjnej. Ustaw prędkość infuzji na 10 µl/min.
- Miejsce infuzji stanie się blade w porównaniu z resztą płuca.
- Zwilż płuco solą fizjologiczną i przykryj je folią spożywczą z otworem wystarczająco dużym, aby pozostawić miejsce infuzji odsłoniętym.
- Nałóż niewielką ilość smaru do kurków na spód pierścienia O-ring (wykonanego na zamówienie), a następnie umieść szkiełko nakrywkowe (#1.5, średnica 22 mm) na spodzie pierścienia O-ring. Delikatnie ustaw pierścień O-ring z nakrywką na miejscu infuzji. Zabezpiecz pierścień O-ring standardowym uchwytem do probówek. Kombinacja szkiełka nakrywkowego i pierścienia O-ring nie zniekształca struktur pęcherzykowych pod nimi, zgodnie z ostatnimi doniesieniami15.
- Ustaw obiektyw (20X) mikroskopu fluorescencyjnego nad pierścieniem O-ring i ustaw ostrość na powierzchni płuca.
5. Obrazowanie transportu fluorescencyjnego dekstranu przez naczynia włosowate
- Przygotuj mikroskop do obrazowania fluorescencji FITC.
- Wybierz obszar do obrazowania i przejmij obrazy z częstotliwością 1/minutę, korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu.
- Rozpocznij infuzję FITC-dekstranu 20 kD (0.5 mg/ml) za pomocą pompy strzykawkowej. Fluorescencja w naczyniach krwionośnych będzie stopniowo rosnąć, aż osiągnie maksimum. Kontynuuj infuzję przez 60 min.
- Następnie przełącz się na infuzję roztworu Ringera, aby wypłukać fluorescencję z lumenu. Podtrzymuj infuzję przez ponad 10 min. Kontynuuj akwizycję obrazów z częstotliwością 1/min podczas wypłukiwania.
6. Analiza obrazu
- Otwórz plik z akwizycją obrazu.
- Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) na mikronaczyniach w obrębie klatki obrazu.
- Odtwarzaj plik obrazu klatka po klatce i zarejestruj intensywność fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania we wszystkich klatkach.
- Nanieś na wykres zmianę intensywności fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania jako funkcję czasu.
- Ilościowo określ maksymalną intensywność fluorescencji oraz resztkową intensywność fluorescencji po 10 min wypłukiwania.
- Oblicz stosunek maksymalnej do resztkowej intensywności fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania, aby uzyskać wskaźnik przepuszczalności mikronaczyni przed nimi powiązanych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Izolowany preparat płuca z perfuzją krwi, połączony z przewodami perfuzyjnymi i powiązanym sprzętem, przedstawiono na Rysunku 2. W celach demonstracyjnych wykorzystano szczura rasy Sprague Dawley, choć opisane tutaj procedury można zastosować u każdego gatunku szczura. Infuzje poprzez mikrocewnik przedsionka lewego docierają tylko do niewielkiego obszaru płuca. Obszar poddany infuzji można zidentyfikować po wywołanym infuzją odbarwieniu (Rysunek 3). Preparat płuca w pozycji do obrazowani...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Izolowany preparat płuc z perfuzją krwi w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym stanowi proste narzędzie do określania zmian przepuszczalności w pojedynczych mikronaczyniach płucnych. Zastosowaliśmy tę metodę do zdefiniowania zmian przepuszczalności w odpowiedzi na infuzje LPS. Nasze dane jednoznacznie sugerują, że infuzja LPS spowodowała wzrost przepuszczalności mikronaczyniowej. Co więcej, dane wskazują również, że zmiany przepuszczalności wywołane przez LPS były podobne zarówno w żyłkach, jak i naczyniach wł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania były wspierane przez NIH HL75503 do KP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tygon Rurka | Fisher Scientific | #18 | |
| Przetwornik ciśnienia | Data Sciences International | P23XL | Potrzebna ilość 3 |
| Igła motylkowa | Greiner Bio-One | 450081 | 21 G |
| Pompa perystaltyczna | Cole | Parmer Masterflex L/S | |
| PE-90 | rurka Becton Dickinson | 427421 | 30 cm potrzebna |
| Rurka PE-10 | Becton Dickinson | 427401 | potrzebna 40 cm |
| Pompa strzykawkowa | O-ring | ||
| Wykonane na zamówienie z otworem o średnicy 20 mm i uchwytem do mocowania O-ringu do uchwytu | |||
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0,5 mg/ml (można wybrać dekstran o różnej wielkości cząsteczki, jeśli doświadczenia próbne wskazują na jego przydatność na podstawie obliczonych wartości wskaźnika przepuszczalności) | |
| Lipopolisacharyd | Sigma Aldrich | Serotyp 0111:B4 |
Bibliografia
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
- Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
- Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
- Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
- Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
- Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
- Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
- Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
- Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
- Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
- Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
- Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
