Odkrywanie interakcji białek i charakteryzowanie funkcji białek za pomocą technologii HaloTag

Summary

Technologia HaloTag to wielofunkcyjna technologia, która odniosła znaczący sukces w izolacji zarówno małych, jak i dużych kompleksów białkowych z komórek ssaków. Tutaj podkreślamy zalety tej technologii w porównaniu z istniejącymi alternatywami i pokazujemy jej użyteczność do badania wielu aspektów funkcji białek wewnątrz komórek eukariotycznych.

Abstract

Badania w proteomice eksplodowały w ostatnich latach dzięki postępom w możliwościach spektrometrii mas, które doprowadziły do scharakteryzowania licznych proteomów, w tym tych pochodzących od wirusów, bakterii i drożdży. Dla porównania, analiza ludzkiego proteomu pozostaje w tyle, częściowo ze względu na samą liczbę białek, które muszą być zbadane, ale także złożoność sieci i interakcji, które występują. Aby sprostać wyzwaniom związanym ze zrozumieniem ludzkiego proteomu, opracowaliśmy technologię HaloTag do izolacji białek, szczególnie skuteczną do izolacji kompleksów wielobiałkowych i umożliwiającą bardziej efektywne wychwytywanie słabych lub przejściowych interakcji i/lub białek w niskiej obfitości. HaloTag to genetycznie kodowany znacznik fuzji białek, przeznaczony do kowalencyjnej, specyficznej i szybkiej immobilizacji lub znakowania białek różnymi ligandami. Wykorzystując te właściwości, opracowano liczne aplikacje dla komórek ssaków w celu scharakteryzowania funkcji białek, a tutaj prezentujemy metodologie, w tym: ściąganie białek używane do odkrywania nowych interakcji lub testów funkcjonalnych oraz lokalizację komórkową. Znajdujemy znaczące korzyści w szybkości, specyficzności i kowalencyjnym wychwytywaniu białek fuzyjnych do powierzchni w celu analizy proteomicznej w porównaniu z innymi tradycyjnymi podejściami niekowalencyjnymi. Pokazujemy te i szeroką użyteczność technologii, używając dwóch ważnych białek epigenetycznych jako przykładów, ludzkiego białka bromodomeny BRD4 i deacetylazy histonowej HDAC1. Przykłady te pokazują moc tej technologii w umożliwianiu odkrywania nowych interakcji i charakteryzowaniu lokalizacji komórkowej u eukariontów, co razem przyczyni się do dalszego zrozumienia ludzkiej proteomiki funkcjonalnej.              

Introduction

Zrozumienie funkcji komórek, reakcji na bodźce oraz zmian w rozwoju i/lub stanach chorobowych jest ściśle związane z dekonwolucją proteomu w tych różnych dynamicznych stanach^1,2. Zrobiono wiele, aby zrozumieć proteom organizmów niższych, jednak biorąc pod uwagę liczbę białek i wszystkie możliwe interakcje, było to bardzo trudne w odniesieniu do ludzkiego proteomu^1,3-7. Postępy w spektrometrii mas znacznie umożliwiły podjęcie tych badań, a tutaj przedstawiamy dodatkowy i znaczący postęp wraz z rozwojem technologii HaloTag zarówno do wydajnego wychwytywania kompleksów białkowych, jak i funkcjonalnego Charakterystyka białek ludzkich z komórek ssaków^8-10. Ostatnio w kilku badaniach wykazano, że technologia ta jest kluczowym czynnikiem w odkrywaniu ważnych interakcji, umożliwiając wgląd w nową funkcję białek i zrozumienie choroby^11-13.

Fuzja białek HaloTag została początkowo opracowana w celu rozwiązania kilku problemów związanych z tradycyjnymi znacznikami powinowactwa i przeciwciałami związanymi z wychwytywaniem, oczyszczaniem i znakowaniem białek^8-10. W prawie wszystkich metodach wychwytywania i oczyszczania białek występuje etap interakcji niekowalencyjnej, który jest używany do wzbogacania określonego białka¹⁴. Na tym etapie białko i/lub kompleks mogą się oddzielić z powodu dyfuzji, zwłaszcza jeśli proces ten trwa godziny, a nie minuty. Aby rozwiązać ten problem, białko fuzyjne zostało specjalnie zaprojektowane tak, aby szybko i nieodwracalnie oddziaływać ze swoimi ligandami, które mogą być cząsteczkami, powierzchniami lub fluoroforami^.. Dlatego, gdy jest związany ze swoim ligandem, pozostaje związany, co jest jednym z najbardziej różnicujących czynników w porównaniu z innymi znacznikami powinowactwa. Wykazano tu również zdolność do rozwiązywania różnych problemów biologicznych za pomocą jednego konstruktu, co jest możliwe dzięki naprzemiennym ligandom⁹ (ryc. 1). Na przykład, aby badać interakcje lub funkcje białek, Ligandy powierzchniowe są używane do wychwytywania białka lub kompleksów (ryc. 1). W oddzielnym eksperymencie to samo białko fuzyjne może być znakowane fluorescencyjnie w celu zbadania lokalizacji komórkowej, transportu lub obrotu białek (ryc. 1). Ważne jest jednak, aby pamiętać, że po związaniu liganda, niezależnie od tego, czy jest to powierzchnia, czy fluorofor, Jest to nieodwracalne i dlatego inne ligandy nie mogą być następnie związane w tym samym doświadczeniu.

Analiza istniejących technologii mapowania interakcji białek ujawnia trudności w efektywnym izolowaniu specyficznych interakcji, w tym tych, które są bardziej przejściowe lub występują w mniejszej obfitości^1,6,7,14,15. Również ostatnie prace wielu grup pokazują obawę, że w ramach tradycyjnych metod izolacji, szczególnie w obszarze proteomiki człowieka, istnieje znaczna liczba zanieczyszczeń białkowych, które mogą maskować sygnały od prawdziwych interaktorów w Analiza spektrometrii mas¹⁶. Właściwości opracowane dla białka HaloTag i wspólnie opracowanej żywicy dobrze rozwiązują te problemy. W protokole dla złożonych pulldownów (ryc. 1) wiązanie kompleksów można osiągnąć w ciągu 15 minut, zarówno promując wychwytywanie kompleksów, jak i zmniejszając poziomy niespecyficznego wiązania⁸. Ponadto, nieodwracalne wiązanie pozwala na efektywne wychwytywanie białek o niskiej liczebności i pozwala na użycie znacznie mniejszej liczby komórek, Ponowne zmniejszenie tła⁸. Po ustaleniu wychwytywania kompleksów, protokół obejmuje łagodne warunki mycia w celu utrzymania integralności kompleksu. Elucja wychwyconych kompleksów może być przeprowadzona dwiema metodami, a wybór której metody jest podyktowany celem dalszej analizy. Jeśli pragnieniem jest analiza lub odkrycie oddziałujących białek za pomocą Western blot lub spektrometrii mas, następnie zaleca się elucję kompleksów z denaturantami, takimi jak SDS lub mocznik (ryc. 1). Jest to szczególnie korzystne dla spektrometrii mas, ponieważ białko pierwotnie sprzężone z HaloTag, zwane białkiem przynęty, pozostanie związane z żywicą, a zatem nie zdominuje populacji peptydów wykrytych w spektrometrii mas. Oznacza to jednak również, że białko przynęty prawdopodobnie nie będzie widoczne w analizie za pomocą western blot, Znacząca różnica w porównaniu z innymi niekowalencyjnymi oczyszczaniami powinowactwa lub koimmunoprecypitacjami. Jeśli celem jest oczyszczenie kompleksu w stanie nienaruszonym, który ma być wykorzystany do badań funkcjonalnych, elucję można przeprowadzić przy użyciu proteazy TEV (Tobacco Etch Virus), która rozpoznaje pokrewną sekwencję rozszczepienia zakodowaną między białkiem fuzyjnym a białkiem przynęty (ryc. 1). Próbki te mogą być również analizowane za pomocą spektrometrii mas, ale jak wykazano później, Będą one zawierały znaczną ilość białka przynęty, które może uniemożliwić wykrycie mniejszej liczebności, specyficznych interaktorów.

Tutaj prezentujemy protokoły pulldown i obrazowania zastosowane do dwóch ważnych białek terapeutycznych, białka bromodomeny BRD4 i deacetylazy histonowej, HDAC1¹⁷. Pokazaliśmy na tych przykładach, interakcję z oczekiwanymi partnerami określoną przez spektrometrię mas, aktywność enzymatyczną po złożonej izolacji dla HDAC1 oraz właściwą lokalizację komórkową dla obu. Razem te wyniki pokazują wielofunkcyjną naturę i siłę Technologia charakteryzowania oddziaływań i funkcji białek eukariotycznych.

Protocol

Uwaga: Następujący protokół może być używany z dowolną fuzją HaloTag i w dowolnej wybranej linii komórkowej stabilnie lub przejściowo transfekowanej. W tych przykładach podamy protokoły transfekcji przejściowej fuzji HaloTag w komórkach HEK293T lub HeLa. We wszystkich eksperymentach zalecamy stosowanie tylko białka kontrolnego.

1. Test ekspresji białka fuzyjnego

1. Otrzymaj konstrukt białka fuzyjnego:
   1. Uzyskaj gotowy wektor fuzji HaloTag lub skonstruuj go przy użyciu istniejących wektorów. Aby uzyskać więcej informacji na temat dostępnych konstrukcji, zobacz Tabelę Specyficznych Odczynników.
   2. W przypadku tworzenia klonu zaleca się weryfikację sekwencyjną DNA.
2. Badanie ekspresji białka fuzyjnego i kontroli:
   1. Dla każdej próbki przygotuj 250 μl 1X buforu SDS Loading Dye (60 mM Tris HCL pH6,8, 0,75 mM błękitu bromofenolowego, 12,5% glicerolu, 100 mM ditiotreitol, 0,5% SDS).
   2. Dla każdego białka fuzyjnego i kontrolnego płytkę 0,5 ml komórek HEK293T lub HeLa w odpowiednim pożywce o gęstości 2-4 x 10⁵ komórek/ml na standardowej płytce 24-dołkowej.
   3. Inkubować przez 18-24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} a następnie transfekować zgodnie z zaleceniami.
   4. 24 godziny po transfekcji dodać 0,5 μl liganda 5mM tetra-metylo-rodaminy (TMR) do pożywki każdej studzienki i delikatnie wymieszać płytkę.
   5. Inkubować transfekowane komórki zawierające ligand przez 15 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
   6. Odessać pożywkę zawierającą ligand i delikatnie przemyć każdą studzienkę komórek 1 ml RT PBS.
   7. Odessać PBS i przeprowadzić drugie płukanie 1 ml RT PBS.
   8. Usuń PBS i dodaj 200 μl buforu barwnika 1X SDS Loading bezpośrednio do komórek.
   9. Odpipetować lizat z płytki do 1,5 ml probówki eppendorfa.
   10. Gotować lizat przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
   11. Usunąć 5-10 μl reakcji i załadować na żel SDS-PAGE.
   12. Użyj skanera detekcji fluorescencyjnej (wzbudzenie TMR: 555 nm, emisja: 585 nm), aby wykryć pasma. Używaj fluorescencyjnych markerów białkowych jako wzorców.
   13. Jeśli skaner do wykrywania fluorescencyjnego jest niedostępny, wykonaj western blot przy użyciu przeciwciał przeciwko białku przynęty lub znacznikowi fuzji białka, aby wykryć ekspresję białka fuzyjnego.

2. Ściąganie białek

1. Przygotowanie komórek przetaczanych przejściowo:
   1. Dla każdej fuzji lub kontroli przygotuj jedno 15-centymetrowe naczynie z 30 ml komórek o łącznej objętości 3-4 x 10 5 komórek/ml lub 1-1,2 x 10⁷ komórek na konstrukt.
   2. Inkubować przez 18-24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} a następnie transfekować zgodnie z zaleceniami.
   3. Po 24-48 godzinach od transfekcji usuń pożywkę i delikatnie umyj warstwę komórek 20-25 ml lodowatego PBS.
   4. Usunąć PBS z tworzywa sztucznego, a następnie dodać 25-30 ml schłodzonego PBS o temperaturze 4 °C i delikatnie zeskrobać komórki z płytki.
   5. Zebrać komórki do stożkowych probówek i wirować przez 5-10 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.
   6. Odrzucić supernatant i umieścić osad komórkowy w temperaturze -80 °C na minimum 30 minut lub maksymalnie 6 miesięcy.
2. Równoważność żywicy HaloLink:
   1. Dla każdej próbki fuzyjnej lub kontrolnej należy przygotować 12 ml buforu do równoważenia żywicy/płukania (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl i 0,005% IGEPAL CA-630). Uwaga: Bardzo ważne jest, aby przygotować i użyć bufora równoważącego żywicę w ciągu 12 godzin, ponieważ rozcieńczony IGEPAL CA-630 nie jest stabilny ani skuteczny po upływie tego czasu.
   2. Delikatnie wstrząśnij lub wymieszaj żywicę, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.
   3. Do każdego eksperymentu z opuszczaniem należy dozować 200 μl żywicy do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   4. Wirować przez 1 minutę przy 800 x g (np. 3 000 obr./min w mikrowirówce), a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant (etanol) bez naruszania żywicy na dnie probówki.
   5. Dodać 800 μl buforu do równoważenia żywicy/płukania i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.
   6. Wirować przez 2 minuty przy 800 x g, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
   7. Powtórz kroki 2.2.5 i 2.2.6 jeszcze dwa razy, co daje w sumie 3 prania.
   8. Nie usuwaj końcowego płukania ani supernatantu, dopóki nie będziesz gotowy do dodania lizatów komórkowych opisanych poniżej (krok 2.3.8), aby zapobiec wysychaniu żywicy.
3. Wiązanie i mycie kompleksów fuzyjnych:
   1. Dla każdej próbki przygotuj 500 μl buforu do lizy ssaków (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Deoksycholanu Na) i 1 ml buforu 1X TBS (100 mM Tris-HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl).
   2. Rozmrozić granulki komórkowe i ponownie zawiesić w 300 μl buforu do lizy ssaków, pipetując w górę iw dół lub krótko wirując.
   3. Dodaj 6 μl koktajlu inhibitorów proteazy 50X (800 μg/ml chlorowodorku benzamidyny, 500 μg/ml fenantroliny, 500 μg/ml aprotyniny, 500 μg/ml leupeptyny, 500 μg/ml pepstatyny A, 50 mM PMSF). Uwaga: Koktajle proteaz, które zawierają AEBSF, nie mogą być używane, ponieważ zakłócają one wiązanie znaczników fuzji białek.
   4. Dodać 3 μl DNazy RQ1 i odwrócić przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Odbić szklanym homogenizatorem o pojemności 2,0 ml; 25-30 uderzeń na lodzie lub przepuścić komórki przez igłę 25 lub 27 G 5-10 razy, aby zakończyć lizę. Uwaga: Sonikacja nie jest zalecana, ponieważ kompleksy mogą się rozpaść, a przegrzanie może wpłynąć na aktywność znacznika fuzji białek.
   6. Wirować przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia lizatu.
   7. Przenieść klarowny lizat o całkowitej objętości około 300 μl do nowej probówki i umieścić na lodzie.
   8. Dodaj do klarownego lizatu dodatkowe 700 μl buforu 1X TBS i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół.
   9. Wziąć zrównoważone probówki z żywicą przygotowane w kroku 2.2.8 i usunąć końcowe płukanie/supernatant z żywicy, nie naruszając żywicy na dnie probówki.
   10. Do każdej probówki z żywicą dodać 1 ml rozcieńczonego lizatu.
   11. Inkubować z mieszaniem na rotatorze rurowym (lub delikatnym mieszadle) przez 15 minut w temperaturze 22 °C. Uwaga: Osiadanie żywicy w tym czasie zmniejsza skuteczność wiązania. Jeśli pożądane jest wiązanie w temperaturze 4 °C, należy to zrobić mieszając przez 1 godzinę.
   12. Odwirować probówki z żywicą przez 2 minuty przy 800 x g i odrzucić supernatant.
   13. Dodać 1 ml buforu do równoważenia/płukania żywicy wykonanego w kroku 2.2.1 i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie ręcznie odwracając rurkę z żywicą.
   14. Odwirować probówki z żywicą przez 2 minuty przy 800 x g i wyrzucić płukanie.
   15. Powtórz kroki 2.3.12, a następnie 2.3.14 jeszcze trzy razy.
   16. Dodać 1 ml buforu do równoważenia żywicy/przemywania i inkubować w temperaturze 22 °C przez 5 minut ze stałą rotacją.
   17. Odwirować probówki z żywicą przez 2 minuty przy 800 x g i wyrzucić płukanie.
   18. W zależności od końcowego zastosowania (dalsze wyjaśnienia znajdują się we Wprowadzeniu) przejdź do sekcji 2.4 lub 2.5.
4. Elucja SDS do denaturacji żeli, plam zachodnich lub spektrometrii mas:
   1. Zawiesić żywicę z każdej próbki w 50 μl buforu elucyjnego SDS (1% SDS i 50 mM Tris-HCl pH7,5)
   2. Wstrząsaj probówkami w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   3. Wirować przez 2 minuty przy 800 x g i przenieść eluaty do świeżych probówek w celu analizy.
   4. W przypadku żelu Western blot lub silver stain, załaduj 5-10 μl na żel denaturujący SDS.
   5. W przypadku spektrometrii mas należy zachować 40 μl każdej próbki w temperaturze -20 °C.
5. Elucja proteazy TEV do testów funkcjonalnych, Western Blots lub spektrometrii mas:
   1. Po usunięciu ostatniego płukania ponownie zanurz żywicę w 50 μl buforu łupliwego ProTEV i 30 jednostkach enzymu TEV.
   2. Inkubować w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem przez 1 godzinę.
   3. Wirować przez 2 minuty przy 800 x g.
   4. Przenieść eluat do świeżych probówek.
   5. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia w testach funkcjonalnych.

3. Obrazowanie komórkowe znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych przy użyciu cytoplazmatycznego i przepuszczalnego dla jądra liganda

1. Komórki transfekcyjne, etykiety i obrazu:
   1. W 8-dołkowym szkle nakrywkowym dla każdego białka fuzyjnego lub kontrolnego umieść 400 μl komórek HeLa w odpowiednim pożywce w każdym dołku o gęstości 1-2 x 10⁵ komórek/ml.
   2. Inkubować przez 18-24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} a następnie transfekować zgodnie z zaleceniami.
   3. 18-24 godziny po transfekcji rozcieńczyć ligand TMR w stosunku 1:200 w odpowiednim pożywce komórkowej, następnie dodać 100 μl tego roztworu do każdej studzienki i delikatnie wymieszać.
   4. Inkubować transfekowane komórki zawierające ligand przez 15 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
   5. Odessać pożywkę zawierającą ligand i zastąpić 500 μl odpowiedniej pożywki pozbawionej liganda ze znacznikiem do fuzji białek, która została wstępnie podgrzana do temperatury 37 °C.
   6. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.
   7. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (37 °C i 5% CO_{2 )} na 30 minut.
   8. Odessać pożywkę i zastąpić ją 500 μl odpowiedniej pożywki, która została wstępnie podgrzana do temperatury 37 °C.
   9. Obraz na mikroskopie z wykorzystaniem odpowiednich parametrów akwizycji (wzbudzenie TMR: 555 nm, emisja: 585 nm).

Results

Podczas pracy z jakimkolwiek nowym białkiem fuzyjnym, ważne jest, aby najpierw przetestować ekspresję tego białka po transfekcji, a także sprawdzić, czy produkowane jest białko o odpowiedniej masie cząsteczkowej. Ponieważ białka fuzyjne HaloTag mogą być znakowane fluorescencyjnie i kowalencyjnie przepuszczalnymi lub, w zależności od lokalizacji, nieprzepuszczalnymi ligandami, możliwe jest szybkie określenie ekspresji poprzez zastosowanie lizatów komórkowych do elektroforezy żelowej denaturacji, a następnie skanowanie za pomocą fluorimagera. Korzystając z protokołu opisanego w sekcji 1.2, obserwuje się ekspresję Halo-BRD4 (189 kD) i samą kontrolkę HaloTag (Ctrl) (34 kD, rysunek 2A). Jak wspomniano w protokole, ekspresję białek fuzyjnych można również wykryć za pomocą tradycyjnych Western blot z przeciwciałami anty-HaloTag lub, jeśli są dostępne, przeciwciałami przeciwko białku przynęty. Jeśli to możliwe, zaleca się użycie liganda fluorescencyjnego, ponieważ jest on bardziej specyficzny, szybszy i łatwiejszy niż wykrywanie przeciwciał, a także ilościowy¹⁰.

Po zweryfikowaniu ekspresji prawidłowego białka fuzyjnego o pełnej długości, można przeprowadzić ściąganie białek. Na rysunku 2B pokazano zabarwione srebrem żele biologicznych replik Halo-BRD4 i Ctrl pulldownów wymytych przez SDS (Protokół Sekcja 2.4), które wykazują wysoką odtwarzalność. Żele do barwienia srebrem pokazują, że stwierdzono znaczną liczbę białek oddziałujących z białkiem BRD4 i bardzo niskie tło w grupie kontrolnej (Figura 2B). Jak wspomniano we wprowadzeniu, w tym procesie elucji Halo-BRD4 nie zostanie wymyty z żywicy, ponieważ pozostaje związany kowalencyjnie. W związku z tym nie wykrywa się znaczącego pasma o tej masie cząsteczkowej w barwie srebra (ryc. 2B) lub western blot (dane nie pokazane). Aby ustalić, czy białka te są specyficzne dla BRD4, przeprowadzono chromatografię cieczową spektrometrii mas (LC-MS/MS) na złożonej mieszaninie otrzymanej po elucji SDS. Na rysunku 2C pokazano liczby spektralne i znormalizowane wartości współczynnika obfitości widma (NSAF) dla znanych interaktorów BRD4^18-20 znalezionych w analizie spektrometrii mas Halo-BRD4. Wysoka zawartość składników pTEFb^18,20, a także białka BRD9¹⁹ potwierdza specyficzne wychwytywanie kompleksów BRD4. Zgodnie z przewidywaniami w postaci żeli do barwienia srebra (Figura 2B), wiele innych białek zostało również zidentyfikowanych jako potencjalne interakcje BRD4, których nie zaobserwowano w grupie kontrolnej (dane nie pokazane). Ponieważ są one wcześniej nieznane, muszą zostać niezależnie zweryfikowane za pomocą innych metodologii, aby potwierdzić, czy białko jest prawdziwym interaktorem, a jeśli tak, to czy jest bezpośrednio lub pośrednio związane z BRD4.

Izolowane kompleksy mogą być również badane pod kątem aktywności; zaleca się elucję kompleksów za pomocą proteazy TEV (Sekcja 2.5 protokołu), aby zachowały funkcjonalność. Na rysunku 3A pokazano żel do barwienia srebrem kompleksów ściągających Halo-HDAC1 uwalnianych z żywicy za pomocą proteazy TEV. Ponieważ proteaza TEV będzie się rozszczepiać w regionie łącznikowym między znacznikiem fuzji białka a jego partnerem fuzyjnym, obserwuje się znaczne ilości białka przynęty, w tym przypadku HDAC1 (Figura 3A). Aby ustalić, czy ta frakcja zawiera aktywność HDAC1, eluowane próbki TEV przetestowano w luminescencyjnym teście HDAC, HDAC-Glo²¹. Jak pokazano na rysunku 3B, próbki ściągające HDAC1 wykazały wysoki poziom aktywności HDAC1 (kolumna 1), która była specyficznie hamowana przez znany inhibitor HDAC, SAHA²² (kolumna 2). Jako kontrole w celu dalszego wykazania swoistości, nie zaobserwowano hamowania HDAC z pokrewnym inhibitorem rodziny sirtuin, EX-527²² (kolumna 3) i nie wykryto żadnego sygnału przy użyciu samego buforu bez dodanej próbki pulldown HDAC1 (kolumna 4).

Istotnym elementem proteomiki funkcjonalnej i zrozumienia kompleksów jest również zrozumienie lokalizacji białek i/lub transportu. Ponieważ te same konstrukty fuzyjne mogą być znakowane fluorescencyjnie wewnątrz komórek, monitorowaliśmy ich lokalizację za pomocą obrazowania konfokalnego. Zgodnie z protokołem w sekcji 3, komórki HeLa przejściowo transfekowane Halo-BRD4 (Figura 4A) i Halo-HDAC1 (Figura 4B) zostały fluorescencyjnie znakowane ligandem TMR i zobrazowane. Jak pokazano na rysunkach 4A i 4B, oba zlokalizowane w jądrze zgodnie z oczekiwaniami¹⁷. Dane te pokazują, że obecność znacznika nie zmieniła fizjologicznej lokalizacji komórkowej jego partnerów fuzyjnych.

Rysunek 1. Schemat zastosowań obrazowania białkowego pulldown i konfokalnego. Korzystając z jednego konstruktu, możliwe jest kilka zastosowań do zrozumienia funkcji białek w komórkach ssaków. Dla wszystkich, konstrukt fuzji Halo ulega stabilnej lub przejściowej ekspresji w przylegających lub zawieszonych komórkach ssaków. W przypadku ściągania kompleksów białkowych komórki są następnie poddawane lizie, kompleksy są kowalencyjnie wychwytywane na żywicy i eluowane przez elucję SDS (lewa ścieżka) lub rozszczepienie TEV (prawa ścieżka). Elucja SDS jest zalecana do przejścia do analizy spektrometrii mas, natomiast rozszczepienie TEV jest optymalne do przeprowadzenia analizy funkcjonalnej. Aby scharakteryzować ekspresję, lokalizację komórkową, zdarzenia transportu lub obrót białek, żywe komórki wyrażające białka fuzyjne są znakowane fluorescencyjnie i dalej analizowane na żelach SDS PAGE lub za pomocą obrazowania konfokalnego. Dostępne są zarówno przepuszczalne dla komórek, jak i nieprzepuszczalne ligandy fluorescencyjne w zależności od lokalizacji lub prezentacji białka fuzyjnego w komórce.

Rysunek 2. Ekspresja białka Halo-BRD4, pulldown i analiza spektrometrii mas. (a) Żele SDS Page pokazujące ekspresję białka fuzyjnego Halo-BRD4, 189 kD, i samego znacznika fuzji białka Halo, 34 kD, kontrolne (Ctrl) w lizacie komórkowym HEK293T znakowanym ligandem TMR (sekcja protokołu 2.1). Żele skanowano za pomocą fluorimagera w celu wykrycia i użyto fluorescencyjnego markera masy cząsteczkowej. (B) Srebrne żele barwiące kontrpróby biologiczne do ściągania próbek Halo-BRD4 i Ctrl wymytych SDS. Rozmiary masy cząsteczkowej są wskazane dla żelu. (C) Liczby spektralne (lewy panel) i znormalizowane wartości współczynników obfitości widmowej (NSAF) (prawy panel), które uwzględniają masę cząsteczkową białek zidentyfikowanych w analizie spektrometrii mas replik biologicznych Halo-BRD4 i Ctrl. Pokazano białka, o których wiadomo, że oddziałują z BRD4, w tym składniki pTEFb (CDK9 i Cyclina T)^18,20, a także BRD9¹⁹. W Ctrl nie zidentyfikowano żadnych peptydów z tych białek.

Rysunek 3. Izolacja kompleksu Halo-HDAC1 i analiza aktywności. (A) Żele barwiące srebrem pokazujące izolację kompleksów Halo-HDAC1 i tła od Ctrl po rozszczepieniu TEV (Sekcja 2.5 Protokołu). Wyraźne pasmo HDAC1 (55 kDa) i pasmo proteazy TEV są oznaczone. Wolny HDAC1 jest generowany przez rozszczepienie TEV w zoptymalizowanym łączniku między HaloTag i sekwencją fuzji HDAC1 po wychwyceniu na żywicy (ilustracja 1). (B) Wykres przedstawiający aktywność próbek izolacji kompleksu HDAC1 w luminescencyjnym teście deacetylazy histonowej, HDAC-Glo²¹. Kolumna 1 wykresu pokazuje wysoki poziom aktywności HDAC zawartej w próbkach pulldown Halo-HDAC1 (HDAC1). Kolumna 2 ujawnia, że aktywność ta może być specyficznie zmniejszona przez dodanie inhibitora HDAC, SAHA²², do próbek ściągających HDAC1. Jako kontrole, kolumna 3 wykazuje inhibitor deacetylazy specyficzny dla rodziny sirtuin, ale nie HDAC, EX-527²² nie hamuje aktywności HDAC1, a kolumna 4 pokazuje, że nie obserwuje się żadnej aktywności przy użyciu samego buforu.

Rysunek 4. Obrazowanie konfokalne Halo-BRD4 i Halo-HDAC1. Obrazowanie konfokalne żywych komórek HeLa transfekowanych Halo-BRD4 (A) lub Halo-HDAC1 (B) znakowanych fluorescencyjnie ligandem TMR. (A) ekspresja Halo-BRD4 jest ograniczona do jądra i (B) ekspresja Halo-HDAC1 jest głównie jądrowa. Lewa strona paneli to kanał fluorescencyjny, a prawa strona to nakładka kanału fluorescencyjnego z kanałem DIC dla każdego z nich. Obrazy uzyskano pod mikroskopem konfokalnym wyposażonym w komorę środowiskową o temperaturze 37 °C + CO_{2 przy} użyciu odpowiednich zestawów filtrów. Podziałka = 20 μm.

Discussion

Przedstawiono tutaj dwa białka fuzyjne, Halo-BRD4 i Halo-HDAC1, scharakteryzowane w komórkach ssaków eukariotycznych pod kątem ekspresji, izolacji i aktywności kompleksu białkowego oraz lokalizacji komórkowej. Podczas pracy nad tymi różnymi protokołami istnieje kilka ważnych kroków dla powodzenia każdego eksperymentu. Podobnie jak w przypadku każdego białka fuzyjnego, poziom ekspresji i umiejscowienie samego znacznika mogą mieć kluczowe znaczenie dla utrzymania fizjologii. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że Fuzje N- i/lub C-końcowe będą musiały zostać zaprojektowane, jeśli wcześniejsza wiedza lub praca z innym znacznikiem nie została wykazana dla konkretnego białka z wyboru. Jeśli chodzi o ekspresję, jeśli poziom jest zbyt wysoki, rozcieńczenie DNA można przeprowadzić podczas transfekcji lub możliwe jest użycie wektorów ze słabszymi promotorami w celu osiągnięcia odpowiedniego poziomu. Wcześniejsze prace wykazały skuteczną izolację kompleksów makromolekularnych na endogennych poziomach ekspresji⁸, umożliwiając pracę na bardzo niskich poziomach ekspresji. Jeśli to możliwe, badania lokalizacji komórkowej będą również w stanie dostarczyć informacji na temat optymalnej pozycji umieszczania znaczników, a także względnego poziomu ekspresji potrzebnego do prawidłowej fizjologii.

Gdy białka fuzyjne są gotowe do eksperymentów pulldown, aby uzyskać maksymalny sukces z protokołem, bardzo ważne jest przestrzeganie zalecanych ram czasowych w sekcjach lizy, wiązania i mycia, ponieważ jedną z największych zalet jest szybkość złożonego procesu izolacji. Jeśli którykolwiek z tych etapów zostanie wydłużony w czasie, takie, jakie jest wymagane w przypadku metody wychwytywania opartej na przeciwciałach, istnieje ryzyko złożonej dysocjacji lub zwiększonego nieswoistego wiązania⁸. Podobnie, jeśli czasy są skrócone podczas lizy lub wiązania komórek, komórki mogą nie być odpowiednio całkowicie zlizowane lub skutecznie wychwycone. Jeśli liczba płukań jest zmniejszona lub nie następuje dobre wymieszanie żywicy podczas wiązania lub płukania, Wtedy poziomy tła białek niespecyficznych zostaną zwiększone. Również sposób lizy jest bardzo ważny w odniesieniu do skuteczności wiązania z żywicą. Próby sonikacji próbek, usunięcia zalecanego detergentu, dodania SDS lub innego silnego detergentu i/lub włączenia inhibitora proteazy AEBSF spowodują zmniejszenie lub utratę wiązania białek fuzyjnych i ich kompleksów z żywicą.

Istniejące metody złożonej izolacji z komórek ssaków i ludzkiej analizy proteomicznej zmagają się z wyzwaniem zmniejszenia tła w analizie za pomocą spektrometrii mas¹⁶. Było to tak znaczące, że liczne grupy spektrometrii mas stworzyły repozytorium białek zanieczyszczających¹⁶. Tło w próbkach ściąganych spektrometrii mas można zdefiniować jako wszystko, co uniemożliwia identyfikację prawdziwych interaktorów białka przynęty. W związku z tym, Tło może powstać w wyniku zanieczyszczenia niespecyficznych białek, a także dużych stężeń białka przynęty lub przeciwciał stosowanych do wytrącania białek przynęty. Wykonano znaczną pracę nad optymalizacją zarówno przedstawionego tutaj protokołu pulldown, jak i żywicy, w celu zminimalizowania poziomu niespecyficznych białek zanieczyszczających w procesie pulldown. Jest to widoczne w żelach barwiących srebro i analizie spektrometrii mas w próbie (Rysunek 2). Aby rozwiązać problem wysokiego poziomu białka przynęty lub przeciwciał, które mogą być równie szkodliwe jak zanieczyszczenia i z którymi zmagają się inne metodologie, zaleca się ekstrakcję z elucją, którą należy przeprowadzić (sekcja 2.4 protokołu). Ze względu na kowalencyjne przyłączanie do żywicy, proces ten pozostawi większość początkowego białka fuzyjnego kowalencyjnie przyłączonego do żywicy. W analizie spektrometrii mas obserwuje się niewielki procent przynęty, która, jak się uważa, zachodzi w wyniku hydrolizy, ale nie stanowi problemu w wykrywaniu innych słabszych lub przejściowych oddziaływań⁸.

Jak wspomniano we wprowadzeniu, znaczący postęp w proteomice był możliwy dzięki znaczącym postępom w spektrometrii mas^1,7. Dlatego ważne jest, aby podkreślić ważne parametry wyboru analizy spektrometrii mas w celu dekonwolucji mieszaniny białek otrzymanych w pulldownach. Oprzyrządowanie musi być wytrzymałe i zdolne do rutynowej i skutecznej analizy próbek zawierających niewielką ilość białka, często mniejszą niż <1 μg. Chromatografia w nanoskali z udziałem kolumn HPLC o średnicy wewnętrznej 50-75 μm i natężeniu przepływu w zakresie 100-300 nl/min jest zwykle stosowana w celu zapewnienia zgodności z małymi rozmiarami próbek i maksymalizacji czułości spektrometru masowego. Aby zmaksymalizować informacje uzyskane w jednej analizie, zwykle stosuje się najnowocześniejsze spektrometry mas zdolne do pozyskiwania widm masowych o wysokiej rozdzielczości w skali czasowej zgodnej z wyżej wymienionymi separacjami w nanoskali, ≥10 Hz. Przyrządy te mają attomolowe poziomy czułości i mogą rutynowo pozyskiwać dane z tolerancjami błędu prekursora sub ppm i masy jonów produktu. Te cechy wydajności służą zwiększeniu wydajności liczby zidentyfikowanych białek i pewności związanej z tymi identyfikacjami.

Dzięki tym danym pokazujemy fizjologiczną lokalizację komórkową, prawidłowe interakcje białko-białko wraz z potencjałem do odkrywania nowych interakcji oraz izolację aktywnych kompleksów przy użyciu jednego konstruktu. Rzeczywiście, alternatywne technologie mogą być stosowane dla każdego z tych różnych aspektów, ale prawdopodobnie nie dla wszystkich^23,24. Dzięki technologii HaloTag można zastosować podejście wielofunkcyjne, Postęp w badaniach proteomicznych i uzyskanie pełniejszego zrozumienia funkcji białek w komórkach ssaków.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa Cells	ATCC	CCL-2	Adherent
HEK293T Cells	ATCC	CRL-11268	Adherent
Cellular growth media	Invitrogen/Gibco
PBS - certyfikowana hodowla tkankowa	Invitrogen/Gibco
FuGENE HD	Wektor	E2311
	Promega	G6591
HaloTag-BRD4	Instytut Badawczy DNA Kazusa	FHC11882	N-końcowa fuzja
HaloTag HaloTag-HDAC1	Instytut Badawczy DNA Kazusa	FHC02563	N-terminalowa fuzja HaloTag
Klony HaloTag zawierające zawartość	Promega	Różne
wektory http://www.promega.com/FindMyGene/ HaloTag Flexi do klonowania (N- lub C-terminal)	Promega	Various	Wybierz na podstawie poziomu ekspresji i orientacji HaloTag HaloTag
TMR Ligand	Promega	G8251
IGEPAL CA-630	Sigma	18896
HaloTag System do wyciągania i etykietowania ssaków	Promega	G6500	Zawiera ligand HaloTag
TMR System opuszczania dla ssaków	Promega	G6504
Koktajl inhibitorów proteazy, 50X	Promega	G6521
Bufor do lizy ssaków	Promega	G9381
Przeciwciało monoklonalne HaloTag	Promega	G9211
ProTEV Plus	Promega	V6101
RQ1 Dnase	Promega	M6101
Żywica HaloLink	Promega	G1912
HDAC-Glo	Promega	G6420
PBS + 0,1% Triton X-100			Do opcjonalnego obrazowania
4% paraformaldehydu/0,2 M sacharozy/PBS			Do opcjonalnego obrazowania
Etanol
Naczynia i naczynia
tkankowych Inkubator
do hodowli komórkowychJednorazowy podnośnik komórek	Thermo Fisher Scientific	08-773-1
Homogenizator szklany, taki jak młynek do tkanek Kontes Dounce	Thermo Fisher Scientific	K885300-0002	Igła 25-27 G może być również używana
Mikrowirówka
Rotator probówkowy, taki jak Labquake	Thermo Fisher Scientific	4002110Q	Idealny do etapów
wiązania i myciaPlatforma wibrująca, taka jak Eppendorf Thermomixer	Thermo Fisher Scientific	05-400-200	Idealna do etapów elucji SDS i rozszczepienia TEV
Komorowe szkło osłonowe	Thermo Fisher Scientific	155409	Do opcjonalnego obrazowania
Mikroskop fluorescencyjny (555 nm Ex/585 nm Em)			Do opcjonalnego obrazowania