Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów

16.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51560

⸱

16 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj zademonstrowany jest nowatorski protokół analizy interesujących regionów, oparty na sortowaniu najlepiej dopasowanych elips przypisanych do regionów pozytywnego sygnału w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. Algorytm ten może umożliwić badaczom kompleksową analizę fizjologicznych sygnałów Ca2 + przy minimalnym wkładzie użytkownika i stronniczości.

Streszczenie

Wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2+ są powszechnie badane za pomocą fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych Ca2+ i technik mikroskopowych. Jednak analiza ilościowa danych obrazowania Ca2+ jest czasochłonna i podatna na błędy. Zautomatyzowane algorytmy analizy sygnału oparte na wykrywaniu obszaru zainteresowania (ROI) zostały zaimplementowane do jednowymiarowych pomiarów skanowania linii, ale obecnie nie ma algorytmu, który integrowałby zoptymalizowaną identyfikację i analizę ROI w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów. W tym miejscu opisano algorytm szybkiego pozyskiwania i analizy ROI w sekwencjach obrazów. Wykorzystuje elipsy dopasowane do sygnałów filtrowanych szumami w celu określenia optymalnego rozmieszczenia ROI i oblicza parametry sygnału Ca2+ dotyczące amplitudy, czasu trwania i rozpiętości przestrzennej. Algorytm ten został zaimplementowany jako ogólnodostępna wtyczka do oprogramowania ImageJ (NIH). Wraz ze skryptami analitycznymi napisanymi dla oprogramowania do przetwarzania statystycznego typu open source R, podejście to zapewnia potok o dużej pojemności do wykonywania szybkiej analizy statystycznej wyników eksperymentu. Autorzy sugerują, że zastosowanie tego protokołu analizy doprowadzi do bardziej kompletnej i bezstronnej charakterystyki fizjologicznej sygnalizacji Ca2 +.

Wprowadzenie

Ca2+ jest wszechobecną cząsteczką sygnalizacyjną drugiego posłańca, a poziomy cytozolowego Ca2+ są wysoce regulowane. Wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2 + są złożone i obejmują izolowane stany nieustalone, oscylacje i rozchodzące się fale1-4. Uważa się, że przestrzenna i czasowa kontrola Ca2 + leży u podstaw fizjologicznej specyficzności sygnału, a zatem analiza wzorców sygnałów Ca2 + jest bardzo interesująca dla badaczy w wielu dziedzinach5.

Ca2+ barwniki wskaźnikowe, takie jak Fluo-4 i Fura-2, są powszechnie stosowane do pomiaru wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej5-12. Zazwyczaj czasowe sygnały Ca2 + są oceniane jako zależne od czasu zmiany średniej fluorescencji w zdefiniowanym przez użytkownika obszarze lub regionie zainteresowania (ROI)5,6,13-16. Obecnie ręczna analiza ROI jest zarówno czasochłonna, jak i pracochłonna, ponieważ wymaga od użytkowników identyfikowania wielu ROI i wykonywania powtarzalnych obliczeń17-19. Techniki te mogą być również obarczone znacznym błędem użytkownika, w tym wprowadzeniem sztucznych modów sygnału i wykluczeniem sygnałów o niskiej amplitudzie lub sygnałów rozproszonych18,20.

Algorytmy automatycznego wykrywania ROI były wcześniej implementowane przy użyciu różnych podejść statystycznych do określania optymalnego rozmieszczenia ROI, ale generalnie ograniczały się do analizy obrazów skanowania linii lub pseudolinii, co ogranicza analizę do jednego wymiaru przestrzennego w czasie17,19-22. Ponadto wiele istniejących algorytmów nie jest wystarczających do uwzględnienia różnorodności zdarzeń uwalniania Ca2+, które wahają się od okresowych, zlokalizowanych stanów nieustalonych do rozchodzących się fal23,24. Kompleksowa ocena fizjologicznych sygnałów Ca2+ jest często dodatkowo skomplikowana ze względu na obecność znaczącego artefaktu obrazu, który zakłóca dyskryminację sygnału z szumem w wielu systemach eksperymentalnych.

Poprzednio, zautomatyzowany algorytm wykrywania ROI do wykrywania stanów przejściowych sygnału Ca2+, zaimplementowany jako wtyczka do oprogramowania NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), został opracowany i zatwierdzony25,26. Algorytm ten, nazwany LC_Pro, został zaprojektowany do identyfikacji i analizy ROI obejmujących stany przejściowe sygnału Ca2+ w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. W tym miejscu przedstawiono praktyczny protokół eksperymentalny i reprezentatywną demonstrację zastosowania algorytmu w śródbłonku tętnic wieńcowych świń, z dodatkowym przetwarzaniem końcowym przy użyciu oprogramowania do przetwarzania statystycznego R o otwartym kodzie źródłowym w celu wygenerowania użytecznych wyników graficznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sekcja naczyń i obrazowanie

  1. Pobieranie tkanek od domowych młodych świń zgodnie z opisem w Martens i wsp. 27. Umieścić prawe komory odłowionej świni w dolnym naczyniu preparacyjnym z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającym buforowany roztwór soli fizjologicznej (PSS) HEPES.
    1. Za pomocą stereomikroskopu wypreparuj i usuń odcinek lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (~8 mm długości, 0,5 mm średnicy) z otaczającej tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek sprężynowych, usuwając segment naczynia z otaczających warstw tkanki serca. UWAGA: Uważaj, aby nie przebić ścianki naczynia.
    2. Umieść blok PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) w naczyniu preparacyjnym i użyj igły, aby przypiąć go do dna. Pokrój drut wolframowy o średnicy około 40 μm na dwanaście segmentów o długości ~0,3 cm, tworząc mikroszpilki i umieść je w naczyniu. Za pomocą kleszczy przymocuj jeden koniec segmentu naczynia do bloku za pomocą mikroszpilki.
    3. Ostrożnie włóż małe nożyczki sprężynowe do światła naczynia i przetnij wzdłużnie po jednej stronie naczynia, aby całkowicie je otworzyć. Zorientuj otwarty segment naczynia śródbłonkiem do góry.
    4. Użyj pozostałych mikroszpilek, aby zabezpieczyć krawędzie otwartego segmentu naczynia, aby zablokować je tak, aby naczynie utworzyło płaski prostokąt. UWAGA: Wierzchołki Micropin należy wygiąć pod kątem 90° i włożyć, aż zrównają się z powierzchnią bloku. Należy zadbać o to, aby rozciągnąć preparat naczyniowy bez nadmiernego rozciągania; Końcowa szerokość powinna wynosić ~1,5x początkowa szerokość nierozciągnięta.
    5. Przygotować małą objętość (~1 ml) roztworu nasycającego Fluo-4 AM, mieszając Fluo-4 AM (10 μM) rozpuszczony w DMSO z pluronem (0,03 %) w buforowanym przez HEPES PSS (zawierającym w mM: 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glukozy) i włożyć cały blok do roztworu ładującego na około 40 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Po załadowaniu myj blok w buforowanym przez HEPES PSS przez 5-10 min.
    7. Zamontuj blok na podkładkach dystansowych o grubości 50-100 μm w dolnej komorze ze szkła nakrywkowego zawierającej buforowany przez HEPES PSS. UWAGA: Metalowe kołki mogą być używane jako przekładki i zapewniają, że segment naczynia jest skierowany w dół i nie dotyka przekładek.
    8. Umieść komorę na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w obrazowanie konfokalne i skup się na warstwie komórek śródbłonka.
    9. Uchwyć sekwencje obrazów poklatkowych o podstawowej fluorescencji względnej przez ~3 minuty przy 20-krotnym powiększeniu i liczbie klatek na sekundę ~8 klatek na sekundę za pomocą oprogramowania do akwizycji sekwencji obrazów konfokalnych.
    10. Po ~ 3 minutach od zarejestrowania fluorescencji podstawowej, zastąpić buforowany roztwór PSS HEPES tą samą objętością (~1 ml) substancji P (100 pM) rozpuszczoną w buforowanym PSS HEPES i rejestrować przez dodatkowe 3 minuty.

2. Zautomatyzowana analiza

  1. Renderuj sekwencje obrazów fluorescencyjnej aktywności wapnia z oprogramowania do akwizycji konfokalnej jako 8-bitowe pliki w formacie ".tif" w skali szarości bez informacji o skali.
  2. Otwórz ImageJ, kliknij "otwórz" w menu plików i wybierz odpowiednią sekwencję obrazów w oknie eksploratora, aby wyświetlić sekwencje obrazów w ImageJ.
  3. Określ odpowiednią średnicę ROI za pomocą prostokątnego narzędzia ROI w celu oszacowania górnej i dolnej granicy przestrzennego rozkładu aktywności w sekwencji obrazów. UWAGA: Średnia średnica prostokątna jest odpowiednim wyborem dla średnicy ROI.
  4. Utwórz nowy folder na dysku twardym komputera i dodaj sekwencje obrazów do katalogu folderów.
  5. W ImageJ kliknij okno "wtyczki", a następnie kliknij "LC_Pro", aby rozpocząć analizę.
  6. Wprowadź wartość średnicy ROI i wybierz wartość progową filtra (0,05 lub 0,01).
  7. Kliknij pole wyboru "leczenie farmakologiczne" i wprowadź wartości punktów czasowych bezpośrednio przed i po dodaniu leku (w sekundach).
  8. Kliknij "ok" i wprowadź katalog sekwencji obrazów do okna eksploratora plików.

3. Wyjście graficzne

  1. Pobierz wersję R 3.0.2 z http://www.r-project.org/.
  2. Otwórz 32-bitową wersję języka R.
  3. Kliknij "plik", a następnie "otwórz skrypt" i wybierz "traceplot". Skrypt R' R do generowania graficznych raportów eksperymentalnych.
  4. Zainstaluj pakiety kalibrowania i gplots, wybierając opcję "pakiety", "pakiety instalacyjne" i wybierając odpowiednie pakiety.
  5. Kliknij "plik", a następnie polecenie "zmień katalog" i użyj okna eksploratora, aby wybrać katalog odpowiadający wynikowi analizy LC_Pro.
  6. Kliknij okno skryptu, a następnie polecenie "uruchom wszystko", aby uruchomić skrypt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu przeprowadzenia zautomatyzowanej analizy dynamiki Ca2+ w sekwencjach obrazów konfokalnych opracowano i wdrożono autorski algorytm LC_Pro. Jak przedstawiono na Rysunku 1, algorytm wykorzystuje sekwencyjne moduły przetwarzania, które A) wykrywają i śledzą miejsca dynamicznych zmian Ca2+ powyżej szumu statystycznego (p < 0,01), B) automatycznie definiują obszary zainteresowania (ROI) w centrach aktywnych miejsc oraz C) obliczają średnią intensywność fluorescencji w obszarach ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dekodowanie złożonych sygnałów Ca2 + na poziomie komórkowym i wielokomórkowym będzie wymagało rygorystycznych podejść eksperymentalnych i analitycznych. W tym miejscu opisano podejście, w którym rozdzielcze w czasie konfokalne sekwencje obrazów fluorescencji zależnej od Ca2 + są poddawane automatycznej analizie, która identyfikuje i określa ilościowo statystycznie istotne sygnały Ca2 + w nienaruszonych polach komórkowych W przedstawionym konkretnym przypadku odcinek tętnicy został wyizolo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 i MOP-93676.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie preparacyjneFisher Sci#08-772-70
Polidimetylosiloksan (PDMS)Zestaw elastomerówFisher Sci#NC9644388
z buforemSigma#H3375-250GHEPES
NikonInst.
KleszczeFine Science Tools#11223-20
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15003-08
Drut wolframowyScientific Inst Svcs#406
Fluo-4 AMLife Tech.#F-14201
Pluroniczny F-127Life Tech.
Metalowe kołkiFine Science Tools#26002-10
Dolna komoraSpecjalnie zaprojektowany
mikroskop konfokalny z wirującym dyskiemPerkin ElmerRS-3
ImageJ oprogramowaniedo pobrania pod adresem: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro wtyczka do imageJdo pobrania na: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R softwaredo pobrania na: http://www.r-project.org/
skrypt traceplotdo pobrania na: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing
należy formować w naczynia Mikroskop stereoskopowy HEPES PSS #MNA42000#P3000MP ze szkła nakrywkowego R

Bibliografia

  1. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
  2. Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  3. Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
  4. Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
  5. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
  6. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
  7. Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
  8. Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
  9. Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
  10. Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  11. Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
  12. Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
  13. Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
  14. Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
  15. Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
  16. Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
  17. Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
  18. Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  19. Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
  20. Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
  21. Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
  22. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
  23. Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
  24. Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
  25. Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie wapniazautomatyzowana analiza ROIwtyczka ImageJanaliza statystyczna w programie Raktywno wapniowa r db onkamikroskopia konfokalnastymulacja substancj Pfluorescencyjne sygna y wapnioweobrazowanie poklatkoweanaliza parametr w sygna u
Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.