Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Podsumowanie

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Streszczenie

Dla zastosowań inżynierii tkankowej, przygotowanie biodegradowalnych i biokompatybilnych rusztowań jest najbardziej pożądanym, ale wymagającym zadaniem. Spośród różnych metod wytwarzania, elektroprzędzenie jest najbardziej atrakcyjne ze względu na swoją prostotę i wszechstronność. Dodatkowo elektroprzędzone nanowłókna naśladują rozmiar naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej, zapewniając dodatkowe wsparcie dla przetrwania i wzrostu komórek. Badanie to wykazało opłacalność wytwarzania długich włókien obejmujących większy obszar złoża dla nowego biodegradowalnego i biokompatybilnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD)¹ przy użyciu nowo zaprojektowanego kolektora do elektroprzędzenia. PGD wykazuje unikalne właściwości elastyczne przy podobnych właściwościach mechanicznych do tkanek nerwowych, dzięki czemu nadaje się do zastosowań w inżynierii tkanek nerwowych. Konfiguracja syntezy i produkcji do wytwarzania włóknistych materiałów rusztowaniowych była prosta, wysoce powtarzalna i niedroga. W testach biokompatybilności komórki pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych myszy mogą przylegać i rosnąć na elektroprzędzonych włóknach PGD. Podsumowując, protokół ten zapewnił wszechstronną metodę wytwarzania włókien elektroprzędzonych PGD w celu wspierania wzrostu komórek linii nerwowej pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Wprowadzenie

Elektroprzędzenie jest jedną z efektywnych metod przetwarzania do produkcji rusztowań z włókien o rozmiarach od mikro do nanometrów. Podstawowa zasada elektroprzędzenia polega na stożku roztworu Taylora, który jest utrzymywany w otworze igły poprzez przyłożenie wysokiego napięcia między końcówką igły a uziemionym kolektorem. Gdy odpychanie elektrostatyczne w roztworze pokonuje napięcie powierzchniowe, naładowany strumień płynu jest wyrzucany z końcówki igły, przemieszcza się w powietrzu z odparowaniem rozpuszczalnika i ostatecznie osadza się na uziemionym kolektorze. Pompa strzykawkowa zapewnia ciągły przepływ roztworu wyłaniającego się z dyszy przędzalniczej, dzięki czemu w krótkim czasie można wytworzyć wiele kopii włókien przędzonych elektrycznie. W trakcie opuszczania dyszy przędzalniczej w celu dotarcia do kolektora, naładowany strumień będzie poddawany rozciąganiu i ubijaniu zgodnie z szeregiem parametrów, w tym lepkością i napięciem powierzchniowym roztworu polimerowego, siłą elektrostatyczną w roztworze oraz oddziaływaniem zewnętrznego pola elektrycznego itp.

W procesie elektroprzędzenia, kolektor służy jako przewodzący substrat, na którym mogą być osadzane włókna mikro- i nanometrowe. W tym badaniu zaprojektowano nowy typ kolektora światłowodowego w celu uzyskania mat włóknistych o pożądanym rozmiarze (długość x szerokość). Tradycyjnie jako kolektor stosuje się folię aluminiową, ale trudno jest przenieść włókna z płaskiej powierzchni na inne podłoże. Trudność w zebraniu nienaruszonej maty włóknistej z tradycyjnego kolektora wynikała głównie z faktu, że włókna elektroprzędzone silnie przylegają do powierzchni kolektora. Dlatego zmodyfikowaliśmy kolektor, składając kawałek folii aluminiowej w prostokątny pasek i mocując go prostopadle do płaskiej metalowej płytki. Elektroprzędzone włókna są rozciągane w poprzek obszaru między końcówką paska a metalową płytką, którą można łatwo przenieść na inne podłoże.

Zainteresowanie termicznie usieciowanymi polimerami elastomerowymi szybko rośnie dzięki pionierskiej pracy grupy Roberta Langera, która w 2002 roku wprowadziła poli(sebakanian glicerolu) (PGS), poliester analogiczny do wulkanizowanego kauczuku ³. Podobnie jak PGS, z powodzeniem opracowaliśmy poli(dodekanian glicerolu) (PGD) poprzez termiczną kondensację glicerolu i kwasu dodekanodiowego i wykazaliśmy jego unikalną właściwość pamięci kształtu¹. W przeciwieństwie do sztywniejszych materiałów syntetycznych, poli(maślanu hydroksylu) lub poli(L-laktydu) (moduły Younga odpowiednio 250 MPa i 660 MPa), PGD wykazuje właściwości elastomerowe, takie jak guma, z modułem Younga wynoszącym 1,08 MPa, gdy temperatura przekracza 37 °C, co jest bliskie nerwowi obwodowemu in situ (0,45 MPa). Ponadto PGD ulega biodegradacji, a czas degradacji można precyzyjnie dostosować, zmieniając stosunek glicerolu i kwasu dodekanodiowego. Kwas dodekanodiowy jest dwunastowęglową substancją z dwiema końcowymi grupami karboksylowymi, HOOC(CH₂)₁₀COOH. Parzyste kwasy dikarboksylowe, takie jak kwas sebacynowy i kwas dodekanodiowy, mogą być metabolizowane do acetylo-CoA i wchodzić w cykl kwasu trikarboksylowego (TCA)/(kwas cytrynowy). Produkt przemiany materii kwasów dikarboksylowych, sukcynylo-CoA, jest prekursorem glukoneogenetycznym i produktem pośrednim⁴. cyklu TCA. W związku z tym niektóre badania sugerowały, że mogą być one wykorzystywane jako alternatywny substrat paliwowy do żywienia dojelitowego i pozajelitowego, zwłaszcza w stanach patologicznych. Ponadto PGD wykazuje unikalną pamięć kształtu, ponieważ jego temperatura zeszklenia wynosi 31 °C, dzięki czemu wykazuje wyraźne właściwości mechaniczne w temperaturze pokojowej i w temperaturze ciała. Podsumowując, PGD jest biodegradowalny, biokompatybilny, wykazujący unikalne właściwości elastyczne o właściwościach mechanicznych zbliżonych do tkanek nerwowych; Dlatego jest to odpowiedni materiał do zastosowań w inżynierii tkanki nerwowej. W tym protokole elektroprzędzone długie włókna obejmujące dużą powierzchnię złoża zostały wytworzone za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora firmy PGD. Rusztowania włókniste mogą wspierać wzrost i różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Protokół

1. Konfiguracja kolektora elektroprzędzalniczego

1. Pokrój folię aluminiową na prostokątny kawałek.
2. Złóż prostokątny element w prostokątny pasek i przymocuj go prostopadle do płaskiej metalowej płytki za pomocą taśmy (Rysunek 1). Uwaga: Rozmiar maty z włókna zależy od długości i szerokości paska. W ten sposób wymiary taśmy można dostosować w zależności od potrzeb.

2. Przygotowanie roztworu polimerowego

1. Mieszać glicerol i kwas dodekanodionowy (DDA) w stosunku molowym 1:1 w zlewce w temperaturze 120 °C przez 100 godzin, aby otrzymać polimer PGD.
2. W probówce o pojemności 15 ml rozpuścić poli(tlenek etylenu) (PEO) i żelatynę w 65% etanolu w stosunku wagowym 1,5:3:95,5, dokręcić nakrętkę i podgrzać mieszaninę w piecu w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę mieszając, aż stanie się jednorodnym roztworem (roztwór podstawowy).
3. Do elektroprzędzenia należy wymieszać polimer PGD i roztwór podstawowy w stosunku wagowym 4:6. Uwaga: Stężenie PGD ma duży wpływ na średnicę włókna. 30%-50% procent PGD jest dopuszczalne do produkcji włókien dłuższych niż 5 cm przy zwiększonych średnicach włókien.
4. Dodaj 0,1% ryboflawiny do roztworu polimerowego i dobrze wymieszaj.

3. Elektroprzędzenie

1. Wprowadzić roztwór polimerowy do standardowej strzykawki o pojemności 5 ml z igłą ze stali nierdzewnej o sile 18 G.
2. Włożyć strzykawkę do pompy strzykawkowej.
3. Podłącz przewód uziemiający wysokiego napięcia źródła zasilania do metalowej płytki, a dodatnio naładowany przewód do igły.
4. Dostosuj odległość między igłą a paskiem folii aluminiowej do 15 cm.
5. Umieść pompkę strzykawkową pod kątem około 15° w stosunku do poziomu, aby zapobiec agregacji włókien z przodu paska.
6. Włączyć pompę strzykawkową i wyregulować natężenie przepływu pompy na 0,6 ml/h.
7. Włącz źródło zasilania wysokiego napięcia i ustaw napięcie robocze na 14,6 kV.

4. Przetwarzanie włókien

1. Po zakończeniu zbierania wystaw matę z włókna na działanie światła UV przez 60 minut w celu usieciowania.
2. Przenieś matę z włókna z paska folii aluminiowej na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i wystawij ją na działanie światła UV przez kolejne 20 minut w celu sterylizacji.
3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego pokrój matę z włókna na okrągłe kawałki tego samego rozmiaru za pomocą ostrza chirurgicznego i umieść kawałki na 24-dołkowej płytce.
4. W celu zaprawiania przed wysiewem komórek zanurzyć próbki włókien w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
5. Następnego dnia ostrożnie zassać PBS, dodać 1 ml pożywki różnicującej (DMEM/F12, N2 i FGF2) (patrz przepis w tabeli materiałów) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
6. Ostrożnie odessać pożywkę różnicującą, dodać 0,2 ml matrigelu do każdej próbki włókien i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Uwaga: Laminina może być również używana do powlekania włókien. Dodać 0,2 ml 20 μg/ml lamininy do błonnika i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
7. Ostrożnie usuń nadmiar matrigelu z każdej studzienki. Spłukać raz 2 ml pożywki różnicującej. Uwaga: Próbki włókien są gotowe do hodowli komórkowej.

5. Wysiewanie komórek na włóknach

1. Dodać 1 ml Accutazy do naczynia do hodowli komórek mES i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
2. Po 10 minutach komórki mES odłącza się od naczynia hodowlanego. Dodać 4 ml pożywki różnicującej do płytki. Zbierz pływające komórki mES do probówki o pojemności 15 ml i pipetuj komórki w górę iw dół, aby rozbić kolonie (około 15x).
3. Wirować przy 400 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki różnicującej.
4. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Przenieść 200 μl zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml i rozcieńczyć 10 razy pożywką różnicującą. Przenieść 15 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do komory na hemocytometrze z założonym szkiełkiem nakrywkowym. Policz komórki w środkowym kwadracie o średnicy 1 mm i czterech rogach hemocytometru pod mikroskopem. Uwaga: Komórka na ml = średnia liczba na kwadrat x współczynnik rozcieńczenia x 10⁴
5. Umieść około 5 x 10 4 komórek mES na każdym dołku. Powoli upuść zawiesinę komórek na środek próbek włókien, zamiast zsuwać się na bok studzienki, aby zapobiec spływaniu roztworu z maty włóknistej.
6. Dodać 1 ml pożywki różnicującej do każdego dołka i utrzymywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 w} celu umożliwienia przyłączenia, wzrostu i różnicowania komórek.
7. Odessać starą pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki różnicującej co drugi dzień.

6. Żywotność komórek

1. Odessać stare podłoże z każdej studzienki.
2. Zmieszać 1/10 objętości odczynnika fluorescencyjnego Rezazuryny z pożywką hodowlaną i dodać 1 ml do każdej studzienki.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 4 godziny, chroniąc przed bezpośrednim działaniem światła.
4. Po 4 godzinach przenieś 100 μl 3x odczynnika z każdej studzienki na płytkę 96-dołkową, a następnie próbki są gotowe do pomiaru na spektrofotometrze fluorescencyjnym przy użyciu ustawień filtra 560EX nm/590EM.

7. PCR w czasie rzeczywistym

1. Po 14 dniach hodowli dodać bufor do lizy do próbek i wyizolować całkowite RNA z komórek na próbkach włókien.
2. Użyj 4 μl całkowitego RNA do syntezy cDNA w 20 μl skalach reakcji przez odwrotną transkrypcję.
3. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR w każdej probówce optycznej: 10 μl Master Mix (2x), 0,2 μl barwnika, 8 μl wody wolnej od nukleaz, 1 μl cDNA i 1 μl startera (startery użyte w tym badaniu są wymienione w tabeli 1).
4. Ustaw program PCR: a. 95 °C 2:20 min, 1 cykl b. 95 °C 3 sek→60°C 1 min, 40 cykl ok. 95°C 15 sek., 1 cykl d. 60°C 1 min, 1 cykl e. 95°C 15 sek., 1 cykl. Wybierz metodę porównawczą CT, aby określić względne poziomy ekspresji genów.
5. Po zakończeniu PCR przeanalizuj wyniki PCR w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania StepOne i wyeksportuj wyniki do programu Excel.

Wyniki

Główne elementy elektroprzędzenia są pokazane na rysunku 1. Matę z włókna o dużych rozmiarach uzyskiwano zwykle poprzez prostopadle przymocowany pasek folii aluminiowej i płaską metalową płytkę. Rysunek 2 przedstawia konstrukcję kolektora i matę z włókien elektroprzędzących. Szerokość i długość można dostosować do różnych zastosowań. Długość włókna wykonanego z mieszaniny polimeru PGD i roztworu podstawowego wynosi do 10 cm. Morfologię włókien elektroprzędzonych przedstawiono na ...

Dyskusja

Ograniczenia prostych kolektorów lub złożoność kolektorów obrotowych, które są obecnie używane do elektroprzędzenia, zwiększają ograniczenie w uzyskiwaniu pożądanej długości i rozmiaru maty włóknistej dla niektórych zastosowań. Dodatkowo przeniesienie włókien z kolektora gruntowego do naczynia hodowlanego lub innych substratów jest wyzwaniem⁵. W tym raporcie nowo zaprojektowany kolektor, wykonany po prostu przez przymocowanie paska folii aluminiowej do uziemionego kolektora, był w stanie uzyskać maty włókniste...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
Kwas dodekanodiowy	Sigma-Aldrich	D1009
Żelatyna	Sigma-Aldrich	D1890
Poli(tlenek etylenu) (PEO)	Sigma-Aldrich	182028
Ryboflawina	Sigma-Aldrich	132350250	0,10%
Mysie embrionalne komórki	macierzysteGlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
Suplement N2	Invitrogen	17502048	1%
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng/ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Invitrogen	10010-031
Barwnik fluorescencyjny Resazurin	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV System izolacji całkowitego RNA System odwrotnej	Promega	Z3100
GoScript System odwrotnej transkrypcji	Promega	A5000
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001
Pompa strzykawkowa	Fisher scientific	14-831-200
Źródło zasilania wysokiego napięcia	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
Światło UV	Philips		308643 15W/G15T8
Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600	Perkin Elmer	8488
StepOne System PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems	4376357

transkrypcji