Artykuł metodologiczny

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

DOI:

10.3791/51595

⸱

17 czerwca 2014

 , 
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia komórki i biologii molekularnej regeneracji narządów i przydatków. Jednak strategie molekularne wykorzystujące genetykę odwrotną nie zostały jeszcze odpowiednio opracowane w celu oceny funkcji genów w regeneracji lub homeostazie tkanek w stadiach larwalnych po embriogenezie danio pręgowanego, a kilka tkanek w larwie danio pręgowanego jest trudnych do zlokalizowania. Wstrzyknięcia dokomorowe specyficznych dla genu morpholinos stanowią alternatywną metodę dla obecnej niezdolności do genomowego celowania w geny danio pręgowanego w sposób kontrolowany czasowo na tych etapach. Metoda ta pozwala na całkowite rozproszenie, a następnie włączenie morfoliny do różnych tkanek w całym ciele, w tym do struktur, do których wcześniej nie można było dotrzeć, takich jak te w larwalnej płetwie ogonowej, strukturze często wykorzystywanej do nieinwazyjnych badań nad regeneracją tkanek. Kilka genów aktywowanych podczas regeneracji fałdowania płetw larw jest również obecnych w regenerujących się tkankach dorosłych kręgowców, więc larwa jest użytecznym modelem do zrozumienia regeneracji u dorosłych. Ta metoda dyspersji morfolino pozwala na szybką i łatwą identyfikację genów niezbędnych do regeneracji tkanek larwalnych, a także innych zjawisk fizjologicznych regulujących homeostazę tkanek po embriogenezie. W związku z tym ta metoda dostarczania zapewnia obecnie potrzebną strategię kontroli czasowej do oceny funkcji genów po embriogenezie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regeneracja organów i przydatków jest fundamentalnie ważna dla przetrwania i sprawności; jednak niektóre kręgowce, w tym człowiek, mają ograniczone zdolności regeneracyjne. Chociaż istnieje kilka modeli zwierzęcych, które mają duże zdolności regeneracyjne, techniki odwrotnej genetyki do oceny funkcji genów podczas regeneracji narządów i przydatków pozostają bardzo ograniczone lub nie istnieją. W związku z tym potrzebne są nowe podejścia do analizy biologii molekularnej regeneracji w tych organizmach modelowych.

Danio pręgowany jest dobrze znanym modelem do zrozumienia komórki i biologii molekularnej regeneracji narządów i przydatków1, nie tylko ze względu na jej znaczącą zdolność do regeneracji wielu organów, tkanek i przydatków, ale także dlatego, że istnieje kilka transgenicznych linii ryb do śledzenia komórek i nadekspresji konstruktów genów 2,3. Jednak hamowanie genów u larw danio pręgowanego ogranicza się głównie do nadekspresji konstruktów dominująco-ujemnych, które nie są dostępne dla wszystkich genów będących przedmiotem zainteresowania lub których produkt transgenu może uzyskać efekty wzmocnienia funkcji, które nie odzwierciedlają endogennej aktywności genu. W związku z tym, aby przezwyciężyć te problemy, potrzebna jest alternatywna metoda specyficznego usuwania ekspresji genów przez nokaut lub knockdown.

Celowanie specyficzne dla genu za pomocą TALENS istnieje jako odwrotny genetyczny sposób na wyeliminowanie funkcji genu; jednak ta strategia nokautu jest bardzo często ograniczona do oceny funkcjonalnej podczas wczesnej embriogenezy, ponieważ początkowe wymagania genu uniemożliwiają dalszy postęp rozwoju embrionalnego. W związku z tym badanie późniejszych zjawisk, takich jak regeneracja lub homeostaza narządów po rozwoju za pomocą TALENS, jest wykluczone 4,5. W związku z tym potrzebna jest alternatywna strategia usuwania genów, która jest ukierunkowana na funkcję genów po wczesnym rozwoju, aby ocenić wymagania dotyczące genów w pełni ukształtowanych narządach i strukturach.

Wykazano, że wstrzyknięcie morfolino jest skuteczne w celowaniu w geny w kilku dorosłych organach i dorosłej regenerującej się płetwie6-8, ale te metody wymagają elektroporacji, a wiele organów wewnętrznych jest trudnych do elektroportacji, czy to ze względu na ich lokalizację, czy ze względu na ich wrażliwość na zakłócenia elektryczne. Co więcej, niektóre tkanki larwy są trudne do bezpośredniego wstrzyknięcia, ponieważ bezpośrednie wstrzyknięcie może zakłócić ich integralność strukturalną lub dlatego, że ich rozmiar jest ograniczony. Płetwa ogonowa larwy jest jedną z takich struktur, ponieważ bezpośrednie wstrzyknięcie do fałdy płetwy nie jest możliwe. W związku z tym potrzebna była alternatywa dla elektroporacji i bezpośredniego wstrzykiwania, aby celować w geny w tkankach, które są albo zbyt małe do wstrzyknięcia, albo nie mogą być elektroporowane.

Aby namierzyć i zahamować funkcję określonych genów podczas regeneracji larwalnej płetwy ogonowej, zmodyfikowaliśmy istniejące technologie morpholino, umożliwiając ocenę funkcji genu podczas regeneracji płetwy ogonowej u późno rozwiniętych larw. Metoda ta polega na dokomorowym podawaniu9 morfolinos znakowanych fluoresceiną wraz z odczynnikiem do transfekcji Endo-Porter10. Po dostaniu się do komory mieszanina morpholino-Endo-Porter szybko rozprzestrzenia się po larwie przez układ naczyniowy i wnika do tkanek, które wcześniej były niemożliwe do namierzenia. Ta metoda iniekcji może być zmodyfikowana tak, aby celować w geny w określonych tkankach i całkiem możliwe, że może być zastosowana w innych modelach zwierzęcych, które obecnie nie mają odwrotnych metod genetycznych w celu zahamowania funkcji genów. W związku z tym oferuje szybką i łatwą metodę, która może znaleźć szerokie zastosowanie w celu natychmiastowego zbadania funkcji genów podczas ogólnej homeostazy i regeneracji narządów w stadiach larwalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szklanych igieł (Rysunek 1)

  1. Do przygotowania igieł do wstrzykiwań należy użyć szklanych naczyń włosowatych o średnicy 0,75 mm (ryc. 1A).
  2. Umieść szklaną kapilę w ściągaczu igieł i pociągnij igłę z następującym parametrem: wartość cyklu grzania: 463; wartość cyklu ciągnięcia: 230; prędkość: 150 ms; czas: 150 ms (rysunek 1B).
  3. Rozbij wyciągniętą szklaną kapilarnę za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej, aby uzyskać igłę o średnicy 20 μm pod stereoskopem z okularem mikrometrycznym.
  4. Użyj tokarki z mokrym gumowym kołowrotkiem, aby naostrzyć igłę i uzyskać skos 20 μm (rysunki 1C i 1D). Uwaga: Ostre, skośne igły poprawiają łatwość wprowadzania do komory, a tym samym minimalizują uszkodzenia tkanki i umożliwiają ponowne uszczelnienie perforowanego mięśnia po wyjęciu igły (ryc. 1E-G).

2. Przygotowanie roztworu Morpholino

  1. Przygotować wywar z morfolino, rozpuszczając liofilizowaną morfolinę w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 7,5 mM. [Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach producenta (tabela materiałów)].
  2. Przygotować roztwór do wstrzykiwań morfolino, mieszając 2,5 μl roztworu podstawowego morfolino (7,5 mM) z 2,8 μl roztworu podstawowego Endo-Portera (1 mM) (patrz tabela materiałów) w celu uzyskania końcowego stężenia 3,5 mM morfolino i 0,5 mM Endo-Porter.

3. Przygotowanie iniekcji Morpholino (Rysunek 2)

  1. Załadować do igły ze skosu szklanego 5 μl tego roztworu za pomocą mikropipety z końcówką do pipet o pojemności 10 μl.
  2. Włóż szklaną igłę do uchwytu igły mikromanipulatora podłączonego do pneumatycznej pompy pico (rysunki 2A-C).
  3. Umieść uchwyt igły obok mikroskopu, tak aby igłę trzeba było przesunąć tylko w jednym płaskim kierunku, aby wprowadzić ją do komory serca larwy (ryc. 2A).
  4. Ustawić kąt wstrzyknięć na około 45°.
  5. Ustaw wartości mikrowtryskiwaczy w następujący sposób: ciśnienie podtrzymania: 20 funtów na cal kwadratowy (psi); ciśnienie wyrzutu: 15 psi; zakres bramkowania 100 ms, wartość okresu 1,9 (odpowiada 10,9 ms).
  6. Rozpuść agarozę w 1x PBS za pomocą standardowej kuchenki mikrofalowej, aby uzyskać 20 ml żelu o stężeniu 1,5% (w/v). Wlej stopiony żel do 10 cm szalki Petriego. Umieść rowkowaną formę iniekcyjną w ciepłej agarozie, tak aby po stwardnieniu agaroza miała bruzdy, w których zostanie umieszczona uspokojona larwa11 (ryc. 2D i 2E).

4. Zastrzyki (Rysunek 3)

  1. Znieczulić larwy w 100 ml wody akwariowej za pomocą 20 mg/l trikainy (L-etylo-m-amino-benzoesanu-metanosulfonianu), aż przestaną reagować na dotyk.
  2. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura ostrożnie przenieś uspokojoną larwę do rowka mokrej formy agarozowej, tak aby strona brzuszna była skierowana w stronę pionowej ścianki agarozy rowka (ryc. 3A).
  3. Umieścić płytkę agarozową pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby komora była skierowana w stronę przeciwną do igły iniekcyjnej (ryc. 3A).
  4. Opuścić igłę, aby wprowadzić ją do komory serca. Igłę należy wprowadzić tylko na 1-2 μm do komory, uważając, aby nie włożyć igły zbyt głęboko (rysunki 3B i 3C).
  5. Po wprowadzeniu igły wstrzyknąć roztwór morfoliny do komory z 4-6 impulsami, z których każdy dostarcza 3 nl roztworu, z przerwami na odczekanie, aby umożliwić oczyszczenie serca (ryc. 3D i 3E).
  6. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę (równolegle do płaszczyzny wprowadzenia), a następnie ostrożnie przenieść larwę za pomocą plastikowej pipety Pasteura wypełnionej pożywką E3 z powrotem na szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę E3.
  7. Umieścić igłę na szalce Petriego zawierającej 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu igły podczas przenoszenia wstrzykniętej larwy.
  8. Powtarzaj kroki 4.1-4.6 co 12-24 godziny przez cały czas trwania eksperymentu. Uwaga: Powtarzanie wstrzyknięć zapewnia wychwyt i utrzymanie morfolino w komórkach.

5. Analizy iniekcji (Rysunek 4)

  1. Znieczulić ryby w 100 ml wody akwariowej z 20 mg/l trikainy, aż przestaną reagować na dotyk.
  2. Umieść larwę bocznie na płaskiej, mokrej 1,5% (w/v) płytce agarozowej pokrytej podłożem E3.
  3. Obrazowanie larw za pomocą mikroskopu stereoskopowego z obrazowaniem w jasnym polu i fluorescencji. Uwaga: Ponieważ larwy są przezroczyste, znakowany fluoresceiną morfolino powinien być widoczny jako fluorescencyjny zielony kolor w naczyniach krwionośnych zwierzęcia bezpośrednio po wstrzyknięciu. Ta fluorescencja będzie dalej rozpraszać się w unaczynionych tkankach przez 15 minut (ryc. 4A-4C).

6. Ocena wzrostu regeneracyjnego

  1. Oceń przechwycone obrazy za pomocą bezpłatnego oprogramowania Fiji Image J (http://fiji.sc/Fiji). Aby zbadać regenerację, użyj narzędzia do śledzenia linii, aby określić ilość wzrostu regeneracyjnego, który wystąpił na larwie kontrolnej i wstrzykniętej morfolinie.
  2. Aby skalibrować obrazy, otwórz jeden z oryginalnych plików obrazów na Fidżi, przeciągając i upuszczając plik do głównego okna Fidżi.
  3. Aby ustawić skalę dla wszystkich poniższych obrazów, przejdź do "Analizuj" w menu głównym.
  4. W rozwijanym menu kliknij "Ustaw skalę".
  5. W tym oknie włącz opcję "Globalne", klikając pole wyboru.
  6. Teraz otwórz obraz, aby ponownie zmierzyć stopień wzrostu regeneracyjnego metodą przeciągnij i upuść (patrz krok 6.1).
  7. Wybierz narzędzie "zaznaczenia odręczne" na pasku narzędzi.
  8. Okrąż obszar, który ma być mierzony (rysunki 4J-4L).
  9. Naciśnij Ctrl+M. Spowoduje to otwarcie nowego okna "Wyniki" pokazującego wartość zakreślonego obszaru w kwadratowych pikselach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostra, skośna igła do wstrzykiwań jest łatwo umieszczana w komorze serca larwy danio pręgowanego, gdy zbliża się do niej grzbietowo (Rysunek 3A). Serce nadal pompuje, a przepływ krwi jest utrzymywany pomimo obecności igły (ryc. 3B i 3C). Ostrożne wstrzyknięcia nie zaburzają morfologii komory ani skurczów serca (ryc. 3D) pomimo wstrzyknięcia morfolino do serca (ryc. 3E).

W ciągu kilku minut, roztwór morpholino-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstrzyknięcie dokomorowe zapewnia szybką i wiarygodną metodę oceny funkcji genu na późniejszych etapach rozwoju lub homeostazy organizmu bez wpływu na funkcję genu podczas embriogenezy. Aby zapewnić powodzenie tej techniki, należy pamiętać o czterech krytycznych punktach: 1) rozmiarze igły, 2) wysychaniu igły, 3) minimalizacji objętości i 4) minimalnym czasie ekspozycji w roztworze uspokajającym. Zbyt małe igły będą się często zatykać, podczas gdy zbyt duże igły uszkodzą komorę i spowodują nadmierne krwawienie. Chociaż z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), chcielibyśmy podziękować Ayele Tsedeke Taddese za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Morfolino z 3&ostrym; znacznik fluoresceinyGene Tools Inc.DostosowaneWięcej informacji w www.gene-tools.com
Endo-PorterGene Tools Inc.Więcej informacji na stronie www.gene-tools.com
AgarozaServa120623Do nalewania płytek w celu umieszczenia ryb podczas iniekcji i obrazowania
Trikaina (L-etylo-m-amino-benzatenosulfonian metanu)ApplichemDo znieczulenia
Podłoże E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4)Do hodowli larw
Szalki PetriegoSarstedt821.472Do umieszczania ryb podczas iniekcji i obrazowania
Cienkościenne szklane kapilaryWorld Precision Instruments, Inc.TW100F-3Do przygotowania igieł iniekcyjnych
Końcówki do pipet MicroloaderEppendorf5,242,956,003Do ładowania igły
Pipety Pasteura (3 ml/1 ml)Marka747760/ 74775Do przenoszenia larw
Flaming/Brown Ściągacz do igiełSutterWięcej informacji na stronie www.sutter.com
Zegarmistrz (Dumont) Pęseta (rozmiar 5)Światowa precyzja Instrumenty, Inc.501985Aby zahamować igłę przed ostrzeniem
Mikroskop preparacyjnyOlympus, Leica, ZeissRóżni się w zależności od producentaCzęść całego zestawu wtrysku
Kamera fluorescencyjnaOlympus, Leica, ZeissRóżni się w zależności od producentaAby zobrazować fluorescencję po injeciton
Zestaw dysz PicoNozzle (uchwyt mikrowtryskiwacza)World Precision Instruments5430-12Do mikroiniekcje
Pneumatyczna pompa PicoPump (mikrowtryskiwacz)World Precision InstrumentsSYS-PV820Do mikroiniekcji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  2. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
  3. Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
  4. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
  5. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
  6. Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
  7. Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
  8. Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
  9. Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
  10. Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
  11. Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  13. Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
  15. Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
  16. Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
  17. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  18. Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
  19. Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
  20. Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
  21. McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
  22. Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zebrafish LarvaMorpholino InjectionVentricular InjectionFin RegenerationGene KnockdownTissue TargetingFiji ImageJAnesthesia ProtocolCapillary NeedleRegeneration Assessment

Powiązane artykuły