Artykuł metodologiczny

Sekcja i dalsza analiza zarodków zięby zeberki we wczesnych stadiach rozwoju

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51596

⸱

21 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

W tym artykule

Podsumowanie

Zięba zebry (Taeniopygiaguttata) jest cennym organizmem modelowym; jednak wczesne etapy rozwoju zeberki nie zostały dokładnie zbadane. Protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzać preparację wczesnych zarodków do zastosowań rozwojowych i molekularnych.

Streszczenie

Zięba zebry (Taeniopygiaguttata) stała się coraz ważniejszym organizmem modelowym w wielu dziedzinach badań, w tym w toksykologii 1,2, zachowaniu3 oraz pamięci i uczeniu się4,5,6. Jako jedyny ptak śpiewający ze zsekwencjonowanym genomem, zeberka ma ogromny potencjał do wykorzystania w badaniach rozwojowych; Jednak wczesne etapy rozwoju zeberki nie zostały dobrze zbadane. Brak badań nad rozwojem zeberki można przypisać trudnościom w rozbiorze małego jaja i zarodka. Poniższa metoda preparacji minimalizuje uszkodzenia tkanki embrionalnej, co pozwala na badanie morfologii i ekspresji genów na wszystkich etapach rozwoju embrionalnego. Pozwala to zarówno na obrazowanie zarodków w jasnym polu, jak i w jakości fluorescencji, wykorzystanie w procedurach molekularnych, takich jak hybrydyzacja in situ (ISH), testy proliferacji komórek i ekstrakcja RNA do testów ilościowych, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qtRT-PCR). Technika ta pozwala badaczom badać wczesne etapy rozwoju, które wcześniej były trudno dostępne.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej techniki jest uzyskanie zarodków zeberki (Taeniopygiaguttata) z najwcześniejszych etapów embriogenezy do wykorzystania w szerokim zakresie badań rozwojowych. Zięba zebry stała się dominującym organizmem modelowym ptaków śpiewających i była szeroko stosowana w różnych dziedzinach, w tym w toksykologii1,2, zachowaniu3, pamięci i uczeniu się4,5,6, neuroanatomii porównawczej7,8 i rozwoju języka9,10. Jako jedyny ptak śpiewający ze zsekwencjonowanym genomem, zeberka umożliwia badania molekularne i genetyczne rzędu Passeriformes, który reprezentuje ponad 50% znanych gatunków ptaków 11,12,13.

Pomimo wykorzystania dorosłych i młodocianych zeberek w różnych dziedzinach, przeprowadzono niewiele badań na embrionach zeberki, szczególnie we wczesnych stadiach rozwoju. Można to przypisać niewielkim rozmiarom ich jaj i zarodków oraz nowszemu statusowi jako organizmu modelowego14,15,16 w badaniach, w których kurczak (Gallus gallusdomesticus) był wcześniej używany jako dominujący system modelowy17,18,19,20,21. Jednakże, jako osoby nieuczące się wokalnie, kurczaki nie są odpowiednim systemem modelowym do badania genetycznych podstaw uczenia się głosu, rozwoju uczenia się głosu, odziedziczalności, zachowania i obwodów zwojów korowo-podstawnych zaangażowanych w uczenie się motoryczne10.

Ważne jest, aby zauważyć, że zarodki zeberki są znacznie delikatniejsze i łatwiej ulegają uszkodzeniu niż zarodki piskląt podczas sekcji i procedur molekularnych. W szczególności należy zachować większą ostrożność podczas wykonywania etapów przepuszczalności na zarodkach zeberki. Silne detergenty i enzymy, które nie zaszkodzą zarodkowi pisklęcia, mogą uszkodzić zarodki zięby zeberki. Jeśli chodzi o ogólną pielęgnację, konieczne jest umieszczenie jaj zeberki w małych kubkach przed umieszczeniem w inkubatorze, aby zapobiec ich pękaniu podczas turlania się podczas inkubacji.

Zebry są podatne na badania behawioralne, łatwo i obficie rozmnażają się przez cały rok w niewoli i uczą się wokalnie. Cechy te pozwalają na wykorzystanie zięby zebry w celu zaspokojenia potrzeby organizmu modelowego, który integruje rozwój, genetykę i behawioralne aspekty języka. Opisane poniżej metody sekcji, w połączeniu z niedawno opracowanym przewodnikiem inscenizacji specyficznym dla zeberki22, sprawiają, że zięba zeberka staje się coraz bardziej użytecznym, ustandaryzowanym organizmem modelowym. Jednak pozyskiwanie zarodków we wczesnych stadiach może być zniechęcające. Protokół ten pozwala badaczom na łatwe uzyskanie zarodków we wczesnym stadium rozwoju. Badania nad wczesnym rozwojem i molekularnymi podstawami rozwojowymi złożonych zachowań zeberki lub toksykologicznym wpływem na rozwój u innych małych ptaków wróblowych uznają tę metodologię sekcji za przydatną.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Metody zostały przeprowadzone na udomowionych ziębach zebry z kolonii hodowlanej w College of William and Mary. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi RSPCA23 i zostały zatwierdzone przez College of William and Mary's OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Animal Welfare Assurance (#A3713-01) oraz uzyskały zatwierdzenie Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (#2013-06-02-8721-dacris).

1. Zbieranie jaj i inkubacja

  1. Ustal pary zeberki w cyklu 14:10 światło: ciemność. Zaopatrz się w jedzenie, wodę, siano i budkę lęgową ad libitum. Uwaga: Rutynowa opieka i hodowla zeberek została dobrze opisana23.
  2. Przygotuj standardowy inkubator dla piskląt z uchylnymi półkami. Uwaga: Utrzymuj sztuczny inkubator w temperaturze 37,5 (+/- 1) °C przy wilgotności 80 - 95%, codziennie dodając wodę do dna inkubatora. Pozostawić inkubator do zrównoważenia przez dwa dni przed użyciem.
    1. Wybierz małe kubki na karmę (5 x 7,6 cm) o głębokości co najmniej 2,5 cm, aby pomieścić jaja w inkubatorze. Wyłóż dolną i dolną krawędź kubka dwiema warstwami ręcznika papierowego, aby kubek był wyściełany, a jednocześnie pozwalał jajkom łatwo się toczyć. Umieść te kubki na uchylnych półkach inkubatora. Uwaga: Zbyt duża wyściółka może hamować zwijanie się, co uniemożliwi udaną inkubację ze względu na przyleganie zarodka do wnętrza skorupy.
  3. Zbierz jaja po dwóch godzinach od początku cyklu świetlnego. Uwaga: Minimalizuje to rozbieżności w rozwoju w danym czasie inkubacji spowodowane inkubacją rodzicielską.
    1. Delikatnie podnieś jajka kciukiem i palcem wskazującym na czubku i podstaw wzdłuż jajka. Użyj, miękkiego ołówka grafitowego 4B, aby oznaczyć datę złożenia i godzinę zebrania z gniazda. Uwaga: Bardziej miękka ołówek 4B zmniejsza ryzyko złamania delikatnej skorupki jajka.
    2. 1.3.2) Umieść od 1 do 5 oznakowanych jaj w każdej filiżance w inkubatorze, aby jaja mogły się swobodnie toczyć, aby zapobiec przyleganiu zarodka do wnętrza skorupki. Uwaga: Umieszczenie więcej niż 5 jaj w kubku może zapobiec toczeniu się pojedynczych jaj i zmniejszyć żywotność zarodków.

2. Usunięcie zarodka z komórki jajowej

  1. Aby przygotować się do sekcji, zbierz następujące materiały: czysty skalpel, kleszcze z cienką końcówką i dwa bardzo cienkie szczypce. Umieść papier wagowy o wymiarach 10 x 10 cm na podstawie lunety sekcyjnej, aby zapewnić czystą, niechłonną powierzchnię do sekcji. Uwaga: Papier wagowy jest kluczowy, ponieważ umożliwia łatwą manipulację żółtkiem i jest najlepszą powierzchnią do cięcia delikatnych błon skalpelem.
  2. Przygotować porcję buforu fosforanowego soli fizjologicznej (1 X PBS) w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml i zaopatrzyć się w co najmniej trzy pipety transferowe oraz małe wiadro na odpady. W przypadku mocowania zarodków należy przygotować porcję 4% paraformaldehydu (PFA). Ostrzeżenie: Opary PFA są toksyczne, a wszystkie czynności związane z PFA należy wykonywać wewnątrz dygestorium, aby zminimalizować narażenie. W przypadku błyskawicznego zamrożenia zarodków należy zaopatrzyć się w ciekły azot i trzymać go w pobliżu lunety sekcyjnej. Sterylność nie stanowi problemu w przypadku tego protokołu preparacji, ale upewnij się, że wszystkie materiały są czyste.
  3. Wyjąć jajo z inkubatora w momencie potrzebnym do osiągnięcia pożądanego etapu, zgodnie z opisem w przewodniku dotyczącym oceny stopnia zaawansowania ziębyzeberki 22. Uwaga: Usuń jaja po 36 godzinach inkubacji w celu wypreparowania zarodków w stadium 6 (ryc. 4A)22 i usuń jaja po 56 godzinach inkubacji, aby wypreparować zarodki w stadium 12 (ryc. 3A)22.
  4. Za pomocą lampy oświetlającej światłowód zapal jajko, trzymając je wzdłuż jego osi pionowej i świec światłem przez jajko, aby oświetlić wnętrze. Umieść końcówkę światła za jajkiem i zlokalizuj żółtko oraz rozwijający się zarodek.
    1. Umieść skalpel po stronie przeciwnej do żółtka i przetnij jajko wzdłuż jajka od czubka do podstawy ze słabym naciskiem.
  5. Usuń zawartość jajka, ostrożnie naciskając kciukiem i palcem wskazującym na czubek i podstawę jajka lub delikatnie podważając skorupkę jajka wzdłuż nacięcia kleszczami. Otwórz jajko bezpośrednio nad papierem wagowym, aby żółtko delikatnie się rozwałkowało.
  6. Zbadaj żółtko pod kątem białej strefy połączenia, która jest widoczna jako słaby biały pierścień otaczający rozwój embrionalny i ustaw żółtko za pomocą bardzo cienkich szczypiec zakończonych tak, aby zarodek znajdował się pośrodku.
    Uwaga: Jeśli nie zaobserwuje się słabego białego koła na powierzchni żółtka, weź cienkie kleszcze i delikatnie przetocz żółtko, aż zarodek znajdzie się na żółtku. Uwaga: Dla stadiów 1 - 922 krążek zarodka ma średnicę mniejszą niż 6 mm i jest widoczny jako słaby, lekko nieprzezroczysty krążek na powierzchni żółtka - patrz rysunek 1 w celach informacyjnych. W stadiach 10 istarszych 22 kałużach krwi pozwalają na lepszą widoczność zarodka, ale należy uważać, aby nie przebić woreczka żółtkowego, ponieważ utrudnia to zlokalizowanie zarodka.

3. Oddzielenie zarodka od tkanki pozaembrionalnej

  1. Nakłuć krawędzie żółtka, aby zmniejszyć ciśnienie (ryc. 1B) i wykonać pojedyncze nacięcia na całej długości średnicy żółtka wzdłuż krążka zarodkowego. Powtarzaj wykonywanie tych ukośnych linii, aż część żółtka zawierająca zarodek zostanie pomyślnie oddzielona (ryc. 1B). Uwaga: Ten krok pozwala na to, aby masa żółtkowa pozostała nienaruszona, ale zmniejszony nacisk na powierzchnię żółtka pozwala na większą precyzję podczas cięcia wokół zarodka, zapobiegając uszkodzeniom struktur zarodka.
  2. Usuń brzegi żółtka za pomocą pipety transferowej. Uwaga: Usuń jak najwięcej żółtka, ale pozostaw niewielką ilość, aby zarodek nie przylegał do suchej powierzchni bibuły do ważenia i nie rozerwał się.
  3. Umyj krążek zarodkowy, dozując 1X PBS pod kątem 45° w kierunku dna zarodka. Umieść końcówkę pipety transferowej obok krążka embrionalnego, a nie nad nim. Jeżeli konieczne jest usunięcie dodatkowego żółtka, przed przeniesieniem zarodka na szalkę Petriego należy oddzielić je skalpelem od papieru do ważenia. Uwaga: Ta metoda polega na usunięciu zarodka z powierzchni bibuły wagowej.
  4. Przenieś zarodek za pomocą pipety transferowej wraz z minimalną objętością 1X PBS na małą, plastikową szalkę Petriego. Umyj zarodek, dodając więcej 1X PBS do szalki Petriego i kapiąc 1X PBS w pobliżu, ale nie bezpośrednio na zarodek. Zakręć szalką Petriego, aby umyć i usunąć resztki żółtka, przechyl szalkę Petriego i usuń odpady 1X PBS za pomocą pipety transferowej.
    UWAGA: Po usunięciu 1X PBS zarodek zazwyczaj nie przylega do dna szalki Petriego, ponieważ plastikowa powierzchnia jest śliska z resztkami 1X PBS. Można jednak dodać więcej 1X PBS, jeśli zarodek przyklei się do naczynia.
    W przypadku mocowania zarodka należy postępować zgodnie z krokami 3.5 i 3.6. W przypadku błyskawicznego zamrożenia zarodka należy natychmiast przejść do kroku 3.8.
  5. W przypadku mocowania zarodka do hybrydyzacji in situ, natychmiast dodaj 4% PFA do szalki Petriego, aby zanurzyć zarodek. Wlej 4% PFA bezpośrednio na wierzch zarodka, aby go spłaszczyć; Zapobiega to zwijaniu się zarodka. Utrwalić zarodek w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 12 godzin.
    1. Po utrwaleniu odwodnić zarodki w stopniowanych roztworach metanolu (MeOH) i przechowywać w temperaturze -20 °C w 100% MeOH.
  6. Jeśli zarodek znajduje się w stadium od 1 do 822, usuń błonę witeliny przylegającą do zarodka. Uwaga: Ten krok można wykonać w trakcie lub po utrwaleniu. Zarodki młodsze niż stadium 822 nie są łatwe do uwidocznienia, ponieważ przylegają do błony witeliny, zasłaniając kluczowe struktury, jak widać na rycinie 2A.
    1. Chwyć krawędź membrany, która wystaje poza strefę połączenia, za pomocą bardzo cienkich kleszczyków. Ostrożnie przewróć zarodek kilka razy, aby zmyć resztki granulek żółtka i poluzować przyleganie krążka zarodka do błony witeliny. Uwaga: Nie dotykaj środka zarodka, ponieważ spowoduje to uszkodzenie struktur embrionalnych.
    2. Jeśli między strefą połączenia a membraną witelinową nie pojawi się szczelina, delikatnie porysuj strefę połączenia kleszczykami z bardzo cienką końcówką, aby poluzować ją od membrany witelinowej. Chwyć błonę witelinową za pomocą szczypiec z bardzo cienką końcówką i delikatnie odciągnij ją od zarodka. W razie potrzeby delikatnie odciągnij zarodek od błony witelinowej, chwytając za obwodową krawędź dysku zarodka w strefie połączenia.
    3. Po usunięciu membranę witeliny należy wyrzucić wraz z odpadami stanowiącymi zagrożenie biologiczne 1 (poziom bezpieczeństwa biologicznego 1).
  7. Przeprowadzając test ISH na młodych stadiach zarodkowych, postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami ISH dla zarodków piskląt24, 25, ale weź pod uwagę następujące sugestie.
    1. Aby zmniejszyć uszkodzenia zarodków podczas zabiegu ISH, należy użyć pojedynczej szklanej fiolki o pojemności 5 ml z zakrętką dla każdego zarodka. Fiolki należy napełniać tylko 2-3 ml roztworu, upewniając się, że zarodki są całkowicie zanurzone. Fiolki nutować pionowo, umieszczając fiolki o pojemności 5 ml w styropianowym stojaku (lub innym stojaku, który zapewni bezpieczeństwo fiolek), który jest przymocowany do nutatora. Uwaga: Ten środek ostrożności zapobiega rozerwaniu zarodka, do którego może dojść w przypadku kontaktu z wieczkiem fiolki podczas nutacji poziomej.
    2. W przypadku zarodków w stadium 0 - 622 należy podawać 5 μg/ml proteinazy K w 1X PTw przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Traktować zarodki w stadium 7 - 1222 10 μg/ml proteinazy K w 1X PTw przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aby zmniejszyć barwienie tła.
    3. Aby wytworzyć reakcję barwną wystarczającą do wykrycia niskiego poziomu ekspresji genów w etapach 1 - 1022, inkubuj z sondą o stężeniu 10 μg/ml przez 12 godzin. W przypadku starszych etapów inkubować w próbce o stężeniu 1 μg/ml w temperaturze 60 °C.
  8. W przypadku błyskawicznego zamrażania zarodka, po rozbiorze należy szybko dodać 2 - 3 ml 1X PBS do szalki Petriego po rozbiorze i przechylić szalkę Petriego, aby oddzielić zarodek od granulek żółtka. Usuń płyn i powtórz 2-3 razy, aby usunąć całe żółtko. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś zarodek do wstępnie znakowanej probówki do mikrowirówki i błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.

4. Test proliferacji komórek EdU. Włączenie i wykrywanie EdU w zarodkach zięby zeberki.

  1. Świeczić jajko za pomocą światłowodowej lampy oświetlającej, aby zlokalizować zarodek lub żółtko.
  2. Zaznacz stronę jaja przeciwną do położenia zarodka lub żółtka w jaju, aby upewnić się, że zarodek nie zostanie uszkodzony podczas procesu mikroiniekcji.
  3. Wyłóż plastikowe naczynie o średnicy 60 mm plasteliną i uformuj je w kształt miski, aby utrzymać jajko w pożądanej orientacji. Oznaczone miejsce powinno być zorientowane w taki sposób, aby umożliwić wprowadzenie igły do mikroiniekcji za pomocą mikromanipulatora. Uwaga: Glinka ustabilizuje jajo podczas mikroiniekcji i podczas inkubacji w kroku 4.11.
  4. Wyciągnąć dwie szklane kapilarne igły do mikroiniekcji. jedną igłę, aby zrobić dziurę w jajku w zaznaczonym miejscu. Przygotować drugą igłę do mikroiniekcji do wstrzykiwań, napełniając ją olejem mineralnym i wkładając do mikroiniektora.
  5. Ustawić objętość roztworu uwalnianego w jednym wstrzyknięciu na 59,8 nl w mikrowstrzykiwaczu.
  6. Załadować igłę do mikroiniekcji podstawowym roztworem EdU o stężeniu 10 mM.
  7. Zrób otwór w skorupce w zaznaczonym miejscu z szklaną kapilarą, uważając, aby nie rozbić skorupki ani nie wrzucić kawałków skorupki do jamy jajowej. Ustawić jajo tak, aby otwór był ustawiony pod kątem 45°, umożliwiając wprowadzenie igły do mikroiniekcji bezpośrednio przez jamę do żółtka lub zarodka.
  8. Za pomocą mikromanipulatora wprowadzić załadowaną igłę na około 1,0 cm do ubytku.
  9. Wstrzyknąć żądaną ilość roztworu EdU bezpośrednio na rozwijający się zarodek lub żółtko. Uwaga: Można wstrzyknąć maksymalnie 478 nl EdU bez powodowania śmierci zarodka.
  10. Natychmiast owiń jajko i gliniany uchwyt wieloma warstwami folii plastikowej, aby przykryć jajko i naczynie, aby zapobiec wysuszeniu zarodka podczas inkubacji. Przyklej krawędzie folii do dna naczynia, aby zapobiec rozpakowaniu się folii podczas inkubacji. Uwaga: Folię należy usuwać tylko bezpośrednio przed preparacją.
  11. Pozwolić nowo namnażającym się komórkom na włączenie EdU poprzez inkubację jaja w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia pożądanego etapu. Po wstrzyknięciu jaja nie należy odkładać z powrotem na uchylne półki w inkubatorze. Umieść owinięte w plastik naczynie wyłożone gliną na stabilnej powierzchni wewnątrz inkubatora.
  12. Usuń folię i wypreparuj zarodek zgodnie z wyżej wymienionym protokołem. Utrwalić zarodek w 4% PFA i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4 °C, jak opisano powyżej. Po utrwaleniu przemyć 100% etanolem (EtOH) przez 5 minut i przechowywać w świeżym 100% EtOH w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.

5. Protokół reakcji EdU "Click"

Poniższe kroki są wykonywane w szklanych fiolkach.

  1. Nawadniaj zarodki, wykonując kolejne 5-minutowe płukanie następujących substancji:
  2. EtOH, 75% EtOH i 25% sterylna dejonizowana woda destylowana (sdd), 50% EtOH i 50% woda sdd, 25% EtOH i 75% 1X PTw, 100% 1X Ptw
  3. Pierz trzy razy w 100% 1X PTw po 10 min.
  4. Rozcieńczyć dodatek buforowy do reakcji (składnik F) przez połączenie 1 części 10-krotnego roztworu buforowego (10 μl) z 9 częściami wody sdd (90 μl).
  5. Przygotować mieszaninę reakcyjną w osobnej probówce, mieszając następujące elementy: 875 μl 1X PBS, 20 μl CuSO4, 5 μl azydku, 100 μl rozcieńczonego dodatku buforowego reakcyjnego. Uwaga: Objętość mieszaniny reakcyjnej można zmniejszyć. Reakcja zadziała, jeśli zarodek jest całkowicie pokryty mieszaniną reakcyjną. Dodać rozcieńczony dodatek buforu reakcyjnego (krok 5.3) bezpośrednio przed użyciem. Wszystkie kolejne kroki wykonywane są w ciemności. Przykryj zarodki folią, aby chronić je przed światłem.
  6. Przykryj fiolki folią aluminiową i inkubuj je pionowo w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, umieszczając je w styropianowym stojaku przymocowanym do nutatora.
  7. Umyj zarodki 3 razy w świeżych 1X PBS przez 10 minut każdy.
  8. Inkubować zarodki w świeżym 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Umyć 3 razy w 1X PBS przez 10 minut każdy i przechowywać w świeżym 1X PBS w temperaturze 4 °C. Przykryj zarodki folią do czasu dalszej analizy.

Wyniki

Kroki przedstawione na Rysunku 1 obrazują wygląd zarodka przytwierdzonego do błony witelinowej (A) oraz demonstrują prawidłową metodę oddzielenia zarodka od żółtka (B). Zarodek można zidentyfikować po strefie połączenia, która jest znacznie jaśniejsza niż błona witelinowa. Sam zarodek jest często trudny do rozróżnienia, dopóki żółtko nie zostanie odcięte. Po wypreparowaniu zarodka z jaja można go utrwalić lub zamrozić w ciekłym azocie do późniejszego użycia. Jeśli w przypadku wypreparowanego zarodka planowana jest hybrydyzacja in situ, konieczne jest usunięcie błony witelinowej, która przylega do zarodka poprzez strefę połączenia. Rysunek 2 ilustruje poprawioną widoczność zarodka po usunięciu tej błony (C) oraz prawidłowy sposób odrywania błony witelinowej (A, B). Po sekcji i utrwaleniu przeprowadzono hybrydyzację in situ całych preparatów, co przedstawiono na Rysunku 3 (A, A’, B, B’), Rysunku 4 (A, A', B, B’) oraz Rysunku 5 (A, B, C), aby wykryć różnice w ekspresji orthodenticlehomeobox 2 (Otx2) w zarodkach poddanych rozwojowo niskim dawkom metylortęci. Rysunek 5 przedstawia wyniki dla sondy sensu, wykazując brak tła. Na Rysunku 4, mimo wypreparowania z jaj w tym samym punkcie czasowym, zarodek poddany rozwojowo działaniu metylortęci (MeHg) rozwinął się do stadium 522 (B, B’), podczas gdy zarodek kontrolny rozwinął się do stadium 622 (A, A’). Grupa zarodków wypreparowanych i pokazanych na Rysunku 4 została zebrana z gniazda i wyjęta z inkubatora w tym samym czasie. Chociaż w rozwoju występuje pewna naturalna zmienność, na podstawie wcześniejszych danych z sekcji jest mało prawdopodobne, aby wahania temperatury w inkubatorze spowodowały opóźnienie rozwojowe wyłącznie u zarodków poddanych działaniu 2,4 ppm metylortęci. Różnice w stadiach rozwoju wskazują na zmiany w proliferacji komórek w zarodkach poddanych rozwojowo działaniu metylortęci.

Przed sekcją do jaja w 2. dniu inkubacji wstrzyknięto EdU i pozostawiono do inkubacji na noc. Po sekcji i utrwaleniu zarodka w stadium 1622, EdU zwizualizowano za pomocą chemii „klik”, co umożliwiło wykrycie proliferujących komórek, jak pokazano na Rysunku 6 (A, B, C). Ważne jest, aby uważnie monitorować punkty czasowe podczas umieszczania jaj w inkubatorze oraz podczas sekcji, ponieważ ekspozycja na metylortęć lub przeprowadzenie testu EdU może zakłócić przebieg rozwoju. Pierwsze wstrzyknięcie wykonano w dniu 0, który był dniem pobrania, zgodnie z opisem w kroku 1.3. Zarodek ten poddano sekcji około 38 godzin później (stadium 722). Stwierdzono, że przeżywalność wynosiła około 90% (taka sama stopa jak w przypadku zarodków kontrolnych), pod warunkiem, że ilość wstrzykniętej substancji nie przekroczyła 478 nl.

Ta metodologia sekcji pozwala również na wysokiej jakości ekstrakcję RNA. Po przeprowadzeniu sekcji embrionów w stadium 1622, wykonano ekstrakcję RNA zgodnie z protokołem producenta bez konieczności optymalizacji, co przedstawiono na Rysunku 7. Usunięcie błony żółtkowej nie było konieczne do ekstrakcji RNA i późniejszych zastosowań qRT-PCR.

Uwaga: Wszystkie ryciny z zarodkami są zorientowane tak, aby region przedni znajdował się u góry, a region tylny u dołu obrazów.

Analiza struktury zarodka; obraz mikroskopowy i schemat z adnotacjami ilustrujący kluczowe komponenty.
Rycina 1. Procedura lokalizacji i preparowania zarodków kanarka zebrowatego, stadia 1-1022. Lokalizacja zarodka poprzez delikatne obracanie żółtka do momentu pojawienia się słabo widocznego białego krążka (A). Po zlokalizowaniu zarodka w centrum żółtka, żółtko jest preparowane etapowo (B), gdzie pierwsze cięcie zmniejsza nacisk błony witelinowej (1), a kolejne cięcia (2) wyznaczają granice strefy połączenia (zj), która przylega do błony witelinowej. Paski skali reprezentują 1 mm.

Przekroje mrożonej tkanki, obrazy mikroskopowe, badanie biologiczne, analiza struktury anatomicznej.
Rycina 2. Usunięcie błony żółtkowej i widoczność struktur embrionalnych. Po oddzieleniu zarodka od żółtka, należy umieścić go w szalce Petri zawierającej 4% PFA. Jeśli wymagane jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ, kluczowa jest widoczność struktur embrionalnych, którą można uzyskać poprzez usunięcie błony żółtkowej (A). Należy chwycić błonę żółtkową bardzo precyzyjną pęsetą i delikatnie odkleić ją od zarodka, w razie potrzeby trzymając zarodek bezpośrednio za zewnętrzną krawędź (B). Usunięcie błony żółtkowej zwiększa przejrzystość struktur embrionalnych i umożliwia obrazowanie zarodków lub ich przetwarzanie metodą hybrydyzacji in situ (C). Paski skali reprezentują 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopowe obrazy rozwoju zarodka: porównanie paneli regionów op i mb; wyniki ekspresji genów.
Rysunek 3. Hybrydyzacja in situ całego preparatu przeprowadzona na zarodkach zięby zebry wystawionych w fazie rozwoju na metylortęć. Wzorce ekspresji orthodenticlehomeobox 2 (Otx2) scharakteryzowano w zarodkach wystawionych na 0,0 ppm metylortęci (A, A’) oraz 2,4 ppm metylortęci (B, B’) poprzez dietę rodziców. Grzbietowa (A) i brzuszna (A’) ekspresja Otx2 jest widoczna w całym śródmózgowiu i pęcherzykach optycznych podczas stadium 1222. Zarodki z grupy badanej zostały wypreparowane w tym samym punkcie czasowym, lecz wykazywały opóźnienie rozwojowe, co widać w widoku grzbietowym (B) i brzusznym (B’) struktur głowy, które są charakterystyczne dla stadium 1122. Skróty: mb, śródmózgowie; op, pęcherzyk optyczny. Paski skali reprezentują 1 mm.

Schemat etapów rozwoju embrionalnego, analiza ekspresji genów, przekroje barwione na fioletowo.
Rycina 4. Hybrydyzacja in situ całego preparatu przeprowadzona na embrionach zięby diamantowej wystawionych w trakcie rozwoju na metylortęć. Wzory ekspresji orthodenticlehomeobox 2 (Otx2) scharakteryzowano w embrionach w stadium 622 wystawionych na 0.0 ppm metylortęci (A, A’) oraz w embrionach w stadium 522 wystawionych na 2.4 ppm metylortęci (B, B’) poprzez dietę rodzicielską. Skróty: am, przedni brzeg mezodermy; no, notochorda, mezoderma notochordy; po, proamnion, przedni blastopor; ps, prążek pierwotny22. Paski skali reprezentują 1 mm.

Etapy rozwoju embrionalnego, obrazy mikroskopowe, przedstawiające progresję wzrostu, różnicowanie komórkowe.
Rycina 5. Hybrydyzacja in situ całego preparatu przeprowadzona na embrionach zięby zebrowej z użyciem sondy sens. (A) Embrion w stadium 522 . (B) Embrion we wczesnym stadium 622. (C) Embrion w stadium 1122. Paski skali reprezentują 1 mm.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; oznakowane struktury korzeni roślin; badanie organizacji komórkowej.
Rycina 6.Wbudowywanie i wykrywanie EdU w embrionach zebry kanarkowej. Do wykrywania proliferujących komórek w embrionie w stadium 1622 wykorzystano chemię „klik” EdU (A, B, C). EdU wbudowuje się do DNA w miejsce tymidyny26,27 i jest wykrywana za pomocą chemii klik27. Proliferacja jest wyraźnie widoczna w bocznych krawędziach somitów oraz w pączku ogonowym. Panel A przedstawia proliferację zachodzącą wyłącznie w tylnej części embrionu, a także pojedyncze komórki proliferujące. Panel B przedstawia miejsca proliferacji w całym embrionie. Panel C przedstawia region przedni i ukazuje w większym szczególe silnie proliferujące telencephalon (te). Skróty: af, fałd amniotyczny; flb, pączek kończyny przedniej; hlb, pączek kończyny tylnej; le, pęcherzyk soczewki; ms, mesencephalon; mt, metencephalon; opc, puchar optyczny; pa, łuk gardłowy; sm, mezodermą somitów; tb, pączek ogonowy; te, telencephalon. Paski skali reprezentują 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy w żelu; rozdzielenie prążków DNA; drabinka, stężenia ppm; analiza badawcza.
Rycina 7. Jakość RNA wyizolowanego z wypreparowanych embrionów zebra finch. Embriony kontrolne (0.0 ppm) oraz eksponowane na 1.2 ppm metylortęci zostały wypreparowane i zamrożone w ciekłym azocie zgodnie z opisem w kroku 3.8. Każda ścieżka przedstawia RNA wyizolowane z dwóch homogenizowanych embrionów z każdej grupy badawczej.

Dyskusja

Niedawne opracowanie przewodnika oceny stopnia zaawansowania badań embriologicznych22 i adnotacji genomu sprawiają, że zięba zeberka jest pożądanym organizmem modelowym do badań rozwojowych. Jednak niewielki rozmiar i kruchość zarodków zeberki, które wahają się od 3 do 7 mm w stadiach 1 - 1022, może utrudniać sekcje 11,14. Zlokalizowanie i czyste usunięcie zarodków z powierzchni żółtka może być trudne. Protokół ten zapewnia wystarczającą ilość szczegółów, aby z łatwością wykonać procedurę. Protokół ten pokazuje krytyczne kroki, które zwykle nie są znane, ale są niezbędne do zapewnienia pomyślnej sekcji. Na przykład ważne jest, aby pozostawić niewielką warstwę żółtka między zarodkiem a arkuszem papieru do ważenia, aby zapobiec przywieraniu.

Zarówno identyfikacja, jak i usunięcie zarodka może być trudne. Aby rozwiązać problem z identyfikacją zarodka na powierzchni żółtka, należy poświetlić światło bezpośrednio nad żółtkiem po jego usunięciu z jaja i spojrzeć na żółtko pod kątem 45°, aby znaleźć zarodek. Po zlokalizowaniu zarodka pokrój żółtko na papierze wagowym, uważając, aby nie rozerwać zarodka.

Jeśli dalsze zastosowania obejmują obrazowanie różnic anatomicznych, hybrydyzację in situ lub testy proliferacji komórek, ważne jest, aby usunąć błonę witeliny na etapie 1 - 822 w celu lepszej wizualizacji struktur. W przypadku wystąpienia trudności z usunięciem żółtka lub błony witeliny we wczesnym stadium, należy utrwalić zarodek w 4 % PFA przed umyciem go w 1X PBS, aby zmniejszyć kruchość zarodka. Usuwając najpierw błonę witeliny podczas sekcji, jak opisano, struktury są wyraźnie widoczne i nienaruszone w zarodkach zeberki po przeprowadzeniu hybrydyzacji in situ .

Ograniczeniem EdU jest to, że podawanie dawek większych niż 478 nl prowadzi do śmiertelności zarodka. Jednak szeroki zakres dawek pozwala na różne poziomy znakowania komórek proliferacyjnych.

Reakcja "kliknięcia" zastosowana w tym zestawie to cykloaddycja miedzi(I)-katalizowana-alkino-azyd-azydokładka (Cu(I)AAC). W tej specyficznej reakcji cząsteczka analogu tymidyny zawierająca alkiny (EdU) jest włączana przez aktywnie dzielące się komórki. Grupa alkinowa w EdU wystaje ze spiralnej struktury DNA i jest wykrywana przez ekspozycję na cząsteczkę azydku sprzężoną z zieloną, fluorescencyjną cząsteczką, która wiąże się z wolną grupą alkinową. Zielona fluorescencja pokazuje nowo proliferujące komórki w zarodku. Bioortogonalność grup azydkowych i alkinowych zapobiega niespecyficznemu barwieniu, ponieważ te reaktywne gatunki nie są naturalnie obecne w organizmach. Ponadto, ponieważ DNA nie musi być denaturowane, aby reakcja zaszła, można łatwo przeprowadzić dalszą analizę zależną od DNA27.

Nieodłącznym ograniczeniem tej metody jest niewielki rozmiar i kruchość zarodków zeberki. Usunięcie błony witelinowej zarodków w stadiach 1 - 1522 może spowodować uszkodzenie struktur zarodka, jeśli nie zostanie wykonane z ostrożnością. Jednak protokół ten upraszcza metodę sekcji, umożliwiając badaczom wykorzystanie wczesnych stadiów embrionalnych do zbadania anomalii strukturalnych i ekspresji genów, które nie były wcześniej dogłębnie badane. Protokół ten otwiera drogę do mnóstwa testów komórkowo-molekularnych, które pozwolą badaczom określić pochodzenie rozwojowe dorosłych fenotypów. Na przykład, możliwe będzie zbadanie ekspresji genów związanych z uczeniem się głosu w różnych warunkach środowiskowych lub po leczeniu farmakologicznym na najwcześniejszych etapach rozwoju 28,29,30,31. Chociaż nie wykazano tego w tym artykule, metoda ta potencjalnie pozwala na inne procedury, takie jak radioaktywna hybrydyzacja in situ na skrawkach tkanek zeberki i elektroporacja/chirurgia in ovo 32,33,34. Biorąc pod uwagę, że zięba zebry została uznana za ważny organizm modelowy w obszernej literaturze, takie badania dostarczają niewykorzystanych możliwości powiązania mechanizmów rozwojowych z fizjologią i zachowaniem dorosłych, w szczególności z rozwojem języka 7,9.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują swoim źródłom finansowania, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education Program dla College of William and Mary; Sponsor grantu: NIH (M.S.S.); Numer grantu: R15NS067566. Dziękują również za wsparcie ze strony College of William and Mary, Department of Biology i College of Arts and Sciences za pomoc w opiece nad zwierzętami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubatorkurzych Używamy inkubatora Picture Window Hova-Bator, model z obiegiem powietrza     
Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488InvitrogenC10337Wykrywanie proliferacji komórek. 
Mikroskop preparacyjny Olympus SZ61
7'' Drummond do wtryskiwacza Nanoject IIDrummond3-00-203-G/X
Mikrowtryskiwacz Drummond Nanoject IIPęseta Drummond
Dumont #55World Precision Instruments14099
Etanol (EtOH)
50 ml Rurka Falcon (polipropylen)Fisher Naukowy06-443-18 
Rurki FastPrep Lysis Matrix H MPbiomedicals6917-100Służy do ekstrakcji RNA, służy do homogenizacji zarodków
Lampy oświetlacze światłowodowe (oświetlacz o wysokiej intensywności)Dolan-Jenner Industries Światłowód MI-150 
Szklane fiolki z zakrętką (poddane działaniu DEPC)Fisher Scientific03-338A
Probówka do mikrowirówki eppe (1,5 ml)Fisher Scientific05-408-129
Olej mineralnySigma-AldrichM-8410
Plastelinadowolna marka
Narshige PB-7 Ściągacz igłowyNarshige
Omni Bead Homogenizator RuptorOMNI International19-010Używany do ekstrakcji RNA
4% Paraformaldehyd (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehydu, 350 ml sdd H2O, dostosować pH do 7,6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBSUtrwalanie zarodków. Uwaga, jest szkodliwy i nie wdychać.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, dostosować pH do 7,4
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dwuzasadowy, 200 ml Barnstead H2O, dostosować pH do 6,5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, dostosować pH do 7,4, 2 ml Tween-20
35 ml Plastikowa szalka Petriego Fisher Scientific08-757-100A plastikowa folia
dowolnej marki
Prepease RNA Spin KitPrepEase, Affymetrix78766 1 KTSłuży do ekstrakcji RNA, służy do homogenizacji zarodków
Mieszanka reakcyjna: 875 μ l 1xPBS, 100 mM 20 μ l CuSO4 (Zestaw Komponent E), 5 μ l Azydek Alexa Fluor 488 (zestaw składnika B), 100 μ l rozcieńczony dodatek buforowy do reakcji (składnik zestawu F)InvitrogenC10337Wykrywanie proliferacji komórek. 
sdd H2O
Kubek nasienny Używamy go jako pojemnika podczas inkubacji jaj
Skalpel ze stali nierdzewnej 
Standardowa budkaUżywamy Abba Plastikowe budki lęgowe Finch
4 ml, nasadka wyłożona teflonem, szklane fiolkiFisher Scientific02-912-352
Pipety transferowe (polietylen)Fisher Scientific13-711-7M 
Papier o wadze 4 x 4Fisher Scientific09-898-12B
jaj Używamy kapilary lęgowa

Bibliografia

  1. Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
  2. Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
  3. Maney, D. L., Goodson, J. L. Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds. Adv Genet. 75, 83-119 (2011).
  4. Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
  5. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
  6. Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
  7. Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
  8. Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
  9. Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  10. Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
  11. Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. , (2012).
  12. Warren, W. C., et al. The genome of a songbird. Nature. 464, 757-762 (2010).
  13. Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
  14. Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
  15. Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  16. Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
  17. Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
  18. Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
  19. Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
  20. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
  21. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
  22. Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. , (2013).
  23. Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. , (2001).
  24. Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
  25. Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
  26. Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
  27. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
  28. Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
  29. Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
  30. Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
  31. Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
  32. Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  33. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
  34. Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja zarodkawczesne stadia embrionalnebiologia rozwojuanaliza ekspresji gen whybrydyzacja in situtest proliferacji kom rekekstrakcja RNAtechnika mikroiniekcjiekspozycja na metylort
Sekcja i dalsza analiza zarodków zięby zeberki we wczesnych stadiach rozwoju
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.