Opracowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odrastania szkliwa in vitro z gęstym interfejsem

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy protokół wytwarzania hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do powierzchownej rekonstrukcji szkliwa. Zorganizowany in situ wzrost kryształów apatytu w hydrożelu utworzył gęstą granicę faz szkliwo-odbudowę, co poprawi skuteczność i trwałość uzupełnień.

Streszczenie

Biomimetyczna rekonstrukcja szkliwa jest ważnym tematem w materiałoznawstwie i stomatologii jako nowatorskie podejście do leczenia próchnicy lub erozji. Udowodniono, że amelogenina jest krytycznym białkiem kontrolującym zorganizowany wzrost kryształów apatytu. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół powierzchownej rekonstrukcji szkliwa przy użyciu nowego hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego. W porównaniu z innymi konwencjonalnymi metodami leczenia, takimi jak miejscowe fluoryzowanie i płyn do płukania jamy ustnej, metoda ta nie tylko może zapobiegać rozwojowi próchnicy, ale także sprzyja znacznej i trwałej odbudowie szkliwa. Zorganizowana mikrostruktura przypominająca szkliwo regulowana przez zespoły amelogeniny może znacznie poprawić właściwości mechaniczne wytrawionej szkliwa, podczas gdy gęsta granica faz odbudowy szkliwa utworzona przez odrastanie in situ kryształów apatytu może poprawić skuteczność i trwałość uzupełnień. Ponadto hydrożel chitozanowy jest łatwy w użyciu i może hamować infekcje bakteryjne, które są głównym czynnikiem ryzyka wystąpienia próchnicy. Dlatego ten biokompatybilny i biodegradowalny hydrożel amelogeninowo-chitozanowy jest obiecujący jako biomateriał do zapobiegania, przywracania i leczenia wadliwego szkliwa.

Wprowadzenie

Szkliwo zębów to twarda, zmineralizowana powierzchnia ludzkich zębów. Składa się z licznych przypominających igły kryształów apatytu, które są połączone w zorganizowane, równoległe pryzmaty, aby zapewnić wyjątkową wytrzymałość mechaniczną i ochronę biologiczną, jaką zapewnia szkliwo^1-2. W przeciwieństwie do innych zmineralizowanych tkanek, takich jak kości i zębina, dojrzałe szkliwo jest bezkomórkowe i nie może się zregenerować po znacznej utracie minerałów^1-2, co często występuje jako próchnica lub erozja. Dostępne na rynku produkty, takie jak lakiery zawierające fluor, pasty do zębów i płyny do płukania jamy ustnej, są skuteczne w remineralizacji szkliwa, ale żaden z nich nie ma potencjału do promowania tworzenia zorganizowanych kryształów apatytu. Klinicznie konwencjonalne leczenie naprawy szkliwa polega na procedurze wypełniania sztucznymi materiałami, takimi jak amalgamat, ceramika lub żywica kompozytowa ³. Jednak materiały te zwykle nie łączą się dobrze z naturalną tkanką otaczającą zmianę, ponieważ ich struktury, składniki i właściwości różnią się od naturalnego szkliwa. W rezultacie próchnica wtórna często rozwija się z czasem na styku zęba z ciałami obcymi. Dlatego odrastanie szkliwa in situ z gęstym interfejsem jest atrakcyjnym celem dla dziedzin materiałoznawstwa i stomatologii. Jednym ze szczególnie obiecujących sposobów osiągnięcia tego celu jest biomimetyczna synteza materiału podobnego do szkliwa na powierzchni szkliwa. W ostatnim czasie podjęto liczne próby przygotowania materiałów podobnych do szkliwa in vitro przy użyciu systemów biomimetycznych zawierających nanoapatyty lub różne dodatki organiczne ^4-12. Jednak opracowanie optymalnej strategii biomimetycznej w celu promowania kryształów remineralizacji w celu uzyskania idealnego gęstego interfejsu nadal stanowi wyzwanie.

Podczas mineralizacji szkliwa, zorientowany wzrost i wydłużenie kryształów apatytu jest regulowane przez bogatą w amelogeninę matrycę ^1,13-14. Aby naśladować matrycę organiczną w rozwoju szkliwa, w niniejszym artykule opisujemy szczegółowy protokół wytwarzania hydrożelu amelogenina-chitozan (CS-AMEL) do odrastania szkliwa in situ na trawionej kwasem powierzchni szkliwa używanej jako model zmian erozyjnych. Jako "najbardziej wszechstronne podłoże wzrostowe" dla kryształów ¹⁵, matryce hydrożelowe mają przewagę nad systemem roztworów, ponieważ klinicznie są łatwiejsze w obsłudze. Co więcej, CS-AMEL jest biokompatybilny, biodegradowalny i ma unikalne właściwości przeciwdrobnoustrojowe i adhezyjne, które wypadają korzystnie w porównaniu z innymi systemami biomimetycznymi do zastosowań dentystycznych ¹⁶. Co ważne, mineralizacja in situ kryształów apatytu na powierzchni szkliwa zapewnia gęste pasmo faz między naprawianą warstwą a naturalnym szkliwem, co może potencjalnie poprawić trwałość uzupełnień i zapobiec powstawaniu nowej próchnicy na brzegu uzupełnienia.

Protokół

Ludzkie zęby trzonowe zostały pobrane zgodnie ze standardowymi procedurami ekstrakcji w Ostrów School of Dentistry Uniwersytetu Południowej Kalifornii i podjęte za zgodą Institutional Review Board.

1. Przygotowanie wytrawionego kwasem plastra zęba

1. Wybierz trzeci ząb trzonowy człowieka bez przywróconej próchnicy.
2. Usuń część korzeniową zęba trzonowego i pokrój koronę zęba trzonowego wzdłużnie na plastry o grubości 2 mm za pomocą chłodzonej wodą wolnoobrotowej piły diamentowej. Czyść te plastry ultradźwiękowo przez 2 minuty, a następnie spłucz je 3 razy wodą dejonizowaną.
3. Aby zasymulować zmiany nadżerkowe, należy wytrawić plastry zębów 30% kwasem fosforowym przez 30 sekund, a następnie natychmiast spłukać je wodą dejonizowaną.
4. Wyczyść ultradźwiękowo wytrawione plastry przez 2 minuty, a następnie spłucz je 3 razy wodą dejonizowaną.

2. Przygotowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego

1. Przygotowanie roztworu podstawowego chitozanu
   1. Rozpuścić 1% (w/v) chitozan (średnia masa cząsteczkowa, 75-85% deacetylowany) w 1% (v/v) roztworze kwasu octowego, a następnie wymieszać w temperaturze 80 °C O/N.
   2. Po schłodzeniu roztworu do temperatury rynkowej przefiltrować roztwór chitozanu za pomocą filtra 0,45 μm. Dostosować wartość pH do 5,0, dodając 1 M roztwór NaOH.
2. Przygotowanie roztworu podstawowego wapnia i fosforanów (0,1 M)
   1. Odważyć chlorek wapnia (CaCl₂) i przygotować 0,1 M roztwór, a następnie mieszać za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Dostosować wartość pH do 11, dodając 1 M roztwór NaOH.
   2. Odważyć dwuzasadowy fosforan sodu (Na₂HPO₄) i przygotować 0,1 M roztwór, a następnie mieszać za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny.
3. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej amelogeniny^17-18
   Zastosowana tutaj rekombinowana amelogenina wieprzowa o pełnej długości (rP172) ma 172 aminokwasy i jest analogiem pełnowymiarowej rodzimej świni P173, ale brakuje N-końcowej metioniny, a także grupy fosforanowej na Ser16 ¹⁸.
   1. Dodać 20 g bulionu lizogenicznego (LB) w proszku agarowym do 500 ml wody dejonizowanej, roztworu sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C (ustawienie cieczy) przez 20 minut. Pozostawić agar do ostygnięcia do temperatury ~ 55 °C, dodać ampicylinę (100 μg/ml) do roztworu agaru.
   2. Przenieś roztwór agaru na szalki Petriego, pozwól każdej płytce ostygnąć, aż stanie się twarda, a następnie odwróć, aby uniknąć kondensacji na agrze. Przechowywać talerze w plastikowych torebkach w temperaturze 4 °C.
   3. Na płytce agarowej LB umieścić prążki rekombinowanymi komórkami (E.coli–BC21) z glicerolu (-80 °C). Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
   4. Przygotować 50 ml pożywki NZCYM i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia, dodać 50 μl 100 μg/ml ampicyliny do pożywki o objętości 50 ml.
   5. Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki agarowej LB do 50 ml pożywki NZCYM uzupełnionej ampicyliną. Inkubować komórki O/N w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.
   6. Przygotować 1 l pożywki NZCYM i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Dodać 1 ml ampicyliny 100 mg/ml do 1 000 ml pożywki. Wykonaj odczyt gęstości optycznej (OD) jako ślepą próbę za pomocą spektrofotometru UV-Vis. UWAGA: Nie wyrzucaj tego po pierwszym przeczytaniu.
   7. Zaszczepić 10 ml kultury komórkowej z kroku 2.3.5 do 1 000 ml pożywki z kroku 2.3.6. Odczytać gęstość optyczną przy 595 nm natychmiast po inokulacji. Wykonuj okresowy odczyt gęstości optycznej, aby śledzić wzrost. UWAGA: Czytaj puste miejsce za każdym razem, gdy pobierana jest średnica zewnętrzna.
   8. Indukować 700 μl izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG, 1 M), gdy wzrost bakterii osiągnie około 0,75 ~ 0,8 OD przy 595 nm.
   9. Zbierz komórki, gdy OD osiągnie 1,1. Wlej zawartość kolby do 6 plastikowych butelek. Zrównoważyć i zważyć butelki przed użyciem wirówki. Wirować przez 20 minut w temperaturze 8,554 x g w temperaturze 4 °C. Przechowywać osad komórkowy w temperaturze -20 °C O/N.
   10. Wyjmij granulki komórek i połącz je w probówce o pojemności 50 ml. Dodać 3,5 ml 4M chlorowodorku guanidyny na litr fermentacji. Sonikuj 2-3 razy na lodzie, za każdym razem 30 sekund, w odstępach 1 minut.
   11. Wykonać 6-krotne rozcieńczenie objętości komórki 0,5% kwasem mrówkowym i pozostawić do mieszania w chłodni przez 2 godziny. Wirować przez 30 minut, 8,554 x g w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant. Dodać 20% nasyconego siarczanu amonu za pomocą nasyconego roztworu podstawowego i wymieszać w chłodni, O/N.
   12. Wirować przez 30 minut, 8,554 x g w temperaturze 4 °C i zachować osad. Rozpuść granulki w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA), załaduj na kolumnę C4 (10 x 250 mm, 5 μm) i frakcjonuj przy użyciu gradientu liniowego A=0,1% TFA i B=60% acetonitrylu w TFA, przy natężeniu przepływu 1,5 ml·^min-1.
   13. Zamrozić roztwór białkowy na suchym lodzie i liofilizować zamrożoną próbkę O/N.
4. Przygotowanie hydrożelu amelogenina-chitozan (CS-AMEL) (ryc. 1A)
   1. Dodać 200 μg rp172 do probówki zawierającej 960 μl 1% roztworu chitozanu, a następnie mieszać za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny.
   2. Dodać 25 μl 0,1 M roztworu CaCl₂, a następnie 15 μl 0,1 M Na₂HPO₄ roztworu do roztworu chitozanu zawierającego amelogeninę, a następnie mieszać za pomocą wiru przez 5 minut.
   3. Doprowadzić pH roztworu CS-AMEL do 6,5, ostrożnie dodając 1 M roztwór NaOH. Hydrożel CS-AMEL powstanie, gdy wartość pH osiągnie 6,5.

3. Odrost szkliwa w hydrożelu amelogeninowo-chitozanowym

1. Przygotowanie roztworu sztucznej śliny
   1. Rozpuścić pewną ilość chlorku magnezu (MgCl₂, 0,2 mM), chlorku wapnia (CaCl₂, 1 mM), diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄ 4 mM), chlorku potasu (KCl, 16 mM) i chlorku amonu (NH₄Cl, 4,5 mM) w 20 mM buforze HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy)¹².
   2. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą 1 M NaOH i przechowywać sztuczny roztwór śliny w temperaturze 4 °C.
   3. Przed użyciem roztworu dodać fluorek sodu (NaF, 300 ppm).
2. Zastosowanie hydrożelu CS-AMEL
   1. Nałóż około 20 μl hydrożelu CS-AMEL na wytrawiony plaster zęba za pomocą strzykawki (Rysunek 1B).
   2. Pokryty hydrożelem plaster zęba wysuszyć w eksykatorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
   3. Przenieś plaster zęba do zlewki zawierającej 30 ml roztworu sztucznej śliny. Przykryj zlewkę folią aluminiową, a następnie przechowuj ją w piekarniku w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
   4. Usuń plasterek zęba i wysusz go w eksykatorze o temperaturze pokojowej.

4. Charakterystyka interfejsu między nowo wyhodowaną warstwą a szkliwem

Mikrostruktura granicy faz między nowo wyrosłą warstwą a szkliwem została zaobserwowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej o wysokich obrotach (HR-TEM). Próbkę TEM przygotowano przy użyciu techniki skupionej wiązki jonów (FIB), której kroki są następujące.

1. Załaduj próbkę do przyrządu FIB-SEM i zakończ wszystkie wyrównania zgodnie z instrukcją obsługi. UWAGA: Regulację Fine Z należy wykonać co najmniej 2 razy.
2. Osadzać warstwę węgla (15 × 3 μm) na próbce w celu ochrony podstawowej struktury (rysunek 2A).
3. Ostrożnie zmiel próbkę po górnej, dolnej i prawej stronie warstwy węgla, aby przygotować cienki kawałek próbki, a następnie odetnij dolną stronę tego cienkiego kawałka. UWAGA: Sprawdź wyrównanie wiązki jonów przed każdym etapem frezowania (Rysunek 2B).
4. Przyspawaj końcówkę Pt do cienkiego kawałka i odetnij lewą stronę, aby oddzielić próbkę (Rysunek 3C). UWAGA: Sprawdź wyrównanie wiązki jonów przed etapem spawania.
5. Powoli wyjmij końcówkę Pt z próbką i zamontuj blaszkową próbkę na wysuwanej siatce TEM.
6. Odłączyć końcówkę od próbki i rozcieńczyć próbkę, aż jej grubość będzie mniejsza niż 100 nm (rysunek 3D). Wyjąć próbkę z przyrządu w celu przeprowadzenia obserwacji TEM. UWAGA: Sprawdź wyrównanie wiązki jonów przed każdym procesem przerzedzania.

5. Ocena właściwości wiążących i mechanicznych nowo wyrastającej warstwy

1. Wytrzymałość wiązania ocenia się za pomocą obróbki ultradźwiękowej. Naprawiony plaster zęba należy przechowywać w myjce ultradźwiękowej (42 kHz, 100 W) przez 10 minut, a następnie obserwować granicę faz między naprawioną warstwą a naturalnym szkliwem za pomocą analizy SEM z rozproszonymi wstecznie elektronami.
2. Zmierz twardość i moduł sprężystości w 20 punktach testowych na każdej naprawionej powierzchni szkliwa (n=3) za pomocą nano-wgłębnika z końcówką Berkovicha.

6. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Umyj plaster zęba solą fizjologiczną Tris buffer soli fizjologicznej (TBS) przez 15 minut.
2. Blok z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w TBS przez 15 min.
3. Usunąć ciecz i inkubować próbkę O/N z 1°Ab (1:500 anty-amelogenina kurczaka) rozcieńczoną w TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
4. Przemyć próbkę TBS przez 30 minut i inkubować O/N z 2°Ab (1:100 Anti-Chicken FITC) rozcieńczonym w TBS.
5. Umyć próbkę TBS przez 30 minut i pozostawić do wyschnięcia na kolejne 30 minut.
6. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

Skuteczność opisanego tutaj protokołu została wykazana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), analizy dyfrakcji elektronów w wybranym obszarze (SAED) oraz dyfrakcji rentgenowskiej (XRD). Po naprawie hydrożelem amelogenina-chitozan (CS-AMEL) przez 7 dni, na wytrawionej powierzchni szkliwa utworzyła się warstwa przypominająca szkliwo o grubości 15 μm. Nowo wyhodowana warstwa została utworzona z wysoce uporządkowanych układów kryształów o średnicy ~50 nm, rosnących preferencyjnie wzdłuż osi c, prostopadłej do...

Dyskusja

Chociaż zawartość minerałów w szkliwie jest wysoka, co czyni ją najtwardszą zmineralizowaną tkanką w ludzkim ciele, ta bioceramika jest podatna na procesy demineralizacji, które często występują jako próchnica lub erozja. Mutacje genów mogą również powodować cienkie lub miękkie szkliwo, prowadząc do szeregu dziedzicznych chorób wad rozwojowych szkliwa zwanych Amelogenesis Imperfecta²⁰. Produkty do higieny jamy ustnej zawierające fluor lub CPP-ACP są dostępne na rynku od kilku lat (tj.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trzeci trzonowiec ludzki	Ostrowska Szkoła Stomatologii Uniwersytetu Południowej Kalifornii	Nie dotyczy	Ludzkie zęby trzonowe zostały pobrane zgodnie ze standardowymi procedurami ekstrakcji w Ostrów School of Dentistry Uniwersytetu Południowej Kalifornii i podjęte za zgodą Institutional Review Board.
Rekombinowana amelogenina pocinowa	Ekspresja i oczyszczanie  w laboratorium	N/A	rP172, pełnej długości
Chitozan	Sigma-Aldrich	448877	Średnia masa cząsteczkowa, 75-85% deacetylowany
kwas fosforowy	VWR	AA033266
Kwas octowy lodowaty	VWR	A036289
Wodorotlenek sodu	VWR	BDH9292
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	223506
Dwuzasadowy fosforan sodu bezwodny	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP	Agilent Technologies Inc.
Siarczan amonu	VWR	BDH8001
Kwas trifluorooctowy	VWR	AAAL06374
Acetonitryl	VWR	BDH1103
Chlorek magnezu	VWR	BDH0244
Diwodorofosforan potasu	VWR	BDH9268
Chlorek potasu	VWR	BDH0258
Chlorek amonu	VWR	AAAA15000
HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy)	VWR	AAA14777
Fluorek sodu	VWR	AA11561
Sól fizjologiczna buforowana trisem	Bio-Rad	170-6435	10 razy; TBS
Albumina surowicy bydlęcej	EMD Millipore	12659	CalBioChem, Albumina, Surowica bydlęca, frakcja V, metale o niskiej zawartości metali ciężkich
Triton X-100	EMD Milipore	TX1568-1
Anty-Amelogenina	z kurczaka N/A	/A	Prezent od prof. Malcolma Sneada, Uniwersytet Południowej Kalifornii
Bydlęce IgY-FITC	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2700
Wysokowydajny system chromatografii cieczowej	Agilent Technologies Inc.	Kolumna Varian Prostar 210
C4	Fenomenx	Jupiter 5μ 300A
Skaningowa mikroskopia elektronowa	JEOL	JSM-7001
FIB-SEM	JEOL	JIB-4500
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	JEOL	JEM-2100F
Cyfrowa wolnoobrotowa piła diamentowa	MTI Corporation	SYJ-150
Mikroskopia fluorescencyjna	Leica	DMI3000 B
Myjka ultradźwiękowa	Bransona	2510	42 kHz, 100 W
Nano-indendent	Agilent Technologies Inc.	Punkty MTS XP