Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Podsumowanie

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Streszczenie

Monitorowanie dynamiki protonacji i zmian konformacji szkieletu białka podczas funkcji białka jest niezbędnym krokiem w kierunku zrozumienia jego mechanizmu. Protonacja i zmiany konformacyjne wpływają odpowiednio na wzorzec drgań łańcuchów bocznych aminokwasów i wiązania peptydowego, które można badać za pomocą spektroskopii różnicowej w podczerwieni (IR). W przypadku białek, których funkcja może być powtarzalnie i powtarzalnie wyzwalana przez światło, możliwe jest uzyskanie widm różnicowych w podczerwieni z rozdzielczością (sub)mikrosekundową w szerokim zakresie spektralnym przy użyciu techniki podczerwieni z transformacją Fouriera w trybie step-scan. Przy ~10^{2-10 3} powtórzeniach fotoreakcji, minimalnej liczbie potrzebnej do wykonania skanu w rozsądnej rozdzielczości widmowej i szerokości pasma, poziom szumu w widmach różnicy absorpcji może być nawet ~^10-4, wystarczający do śledzenia kinetyki zmian protonacji pojedynczego aminokwasu. Niższy poziom szumów można osiągnąć poprzez większą liczbę uśredniania danych i/lub przetwarzania matematycznego. Ilość białka wymagana do uzyskania optymalnych wyników wynosi od 5 do 100 μg, w zależności od zastosowanej techniki pobierania próbek. Jeśli chodzi o dodatkowe wymagania, białko musi być najpierw skoncentrowane w buforze o niskiej sile jonowej, a następnie wysuszone w celu utworzenia filmu. Film białkowy jest nawadniany przed eksperymentem, albo małymi kropelkami wody, albo w kontrolowanej wilgotności powietrza. Osiągnięty poziom nawodnienia (g wody / g białka) mierzy się na podstawie widma absorpcji IR. Aby zaprezentować tę technikę, zbadaliśmy fotocykl sterowanej światłem bakteriorodopsyny pompy protonowej w jej natywnym środowisku purpurowej błony oraz bramkowanej światłem kanałowej rodopsyny-2 rozpuszczonej w detergencie.

Wprowadzenie

Aby w pełni wyjaśnić, jak białka pełnią swoją funkcję, konieczne jest mierzenie ich w trakcie pracy, tj. wzdłuż ścieżki reakcji, która często obejmuje szereg produktów pośrednich i rozciąga się na kilka rzędów czasu. Kluczowe etapy funkcjonowania białek często zachodzą w zakresie od mikrosekund do milisekund¹, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów w białkach błonowych. Krystalografia rentgenowska, prawdopodobnie filar biologii strukturalnej, zapewnia statyczne (uśrednione w czasie) gęstości elektronów z dobrze dyfrakcyjnych kryształów białek, notorycznie trudnych do wyhodowania w przypadku białek błonowych². Model atomowy 3D można zbudować na podstawie gęstości elektronów, choć rzadko uwzględnia lokalizację atomów wodoru. Niezwykły postęp w czasowo-rozdzielczej krystalografii rentgenowskiej, opierający się na dyfrakcji Laue'a³ lub femtosekundowych impulsach rentgenowskich⁴, dodaje wymiar czasowy do wysokiej informacji strukturalnej nieodłącznie związanej z krystalografią rentgenowską⁵. Pomijając jednak wyzwania techniczne i analityczne, sieć krystaliczna może zaburzać zmiany konformacyjne w szkielecie i zmieniać dynamikę białek, co jest nieuniknioną wadą metod opartych na^kryształach białek5. W związku z tym dynamiczne aspekty białek są nadal najlepiej ujęte za pomocą metod optycznych, takich jak fotoliza błyskawiczna^6,7, chociaż z ogólną wadą w postaci ograniczonego wglądu w strukturę.

Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) łączy rozdzielczość czasową spektroskopii optycznej z cenną wrażliwością na strukturę białka, ostatnią cechę wykorzystywaną w niezliczonych statycznych badaniach strukturalnych i funkcjonalnych białek błonowych^8-11. W szczególności spektroskopia różnicowa FT-IR okazała się idealnym narzędziem do badania niewielkich zmian spektralnych, gdy białko przechodzi z jednego stanu metastabilnego do drugiego^12-19.

Badania nad dynamiką białek, inne niż na poziomie pojedynczej cząsteczki^20,21, wymagają procesu wyzwalającego do synchronizacji. Reakcja jest dogodnie inicjowana szybko i nieinwazyjnie, przy użyciu światła jako wyzwalacza, jak to ma miejsce w badaniu białek z cyklicznymi fotoreakcjami. Dużym wyzwaniem związanym z badaniami czasowo-rozdzielczymi jest osiągnięcie wystarczającej rozdzielczości czasowej przy zachowaniu dobrej rozdzielczości spektralnej i odpowiedniego stosunku sygnału do szumu. Istotne jest również pokrycie odpowiednio szerokiego zakresu spektralnego i czasowego. Spektroskopia FT-IR ze skanowaniem krokowym w czasie przoduje we wszystkich tych aspektach²², z opublikowanymi przykładami obejmującymi zakresy spektralne tak szerokie, jak 3,900-850 ^cm-1 i dynamikę rozciągającą się ~9 rzędów czasu, z rozdzielczością spektralną do 3,5 ^cm-1 i rozdzielczością czasową^{30 nsec 23-28}.

Spektrometry IR z transformacją Fouriera wykazują zredukowany szum i lepszą dokładność fotometryczną w porównaniu z spektrometrami dyspersyjnymi²⁹. Jednak w normalnym trybie zapisu szybkiego skanowania spektrometry FT-IR mają rozdzielczość czasową ograniczoną do ≥5-10 ms, co wynika z minimalnego czasu wymaganego przez ruchome lustro interferometru do zakończenia skanowania. Z kolei w technice skanowania krokowego zależność czasowa zdarzenia dynamicznego jest oddzielona od czasu trwania skanowania interferometru. Krótko mówiąc, mobilne lustro porusza się w dyskretnych krokach, a nie w sposób ciągły skanowania w celu zakończenia skanowania. Na każdym z tych etapów (ruchome) lustro jest utrzymywane nieruchomo i rejestrowany jest stan nieustalony. W związku z tym rozdzielczość czasowa jest ograniczona czasem narastania detektora rtęciowo-kadmowo-tellurkowego (MCT), który zwykle mieści się w zakresie 10-100 nsec. W praktyce duży zakres dynamiki interferogramu (zawierający intensywny sygnał w rozbłysku centralnym i małe sygnały w skrzydłach), wymaga do prawidłowej digitalizacji przetwornika analogowo-cyfrowego (ADC) o aż 16-24 bitach, co prowadzi do częstotliwości próbkowania nie wyższych niż ~200 kHz (5 μs)³⁰. Nanosekundową rozdzielczość czasową można osiągnąć, mierząc tylko zmiany w interferogramie, dla których wystarczy 8-12 bitowy przetwornik ADC^23,31-33. Aspekty techniczne^30,34,35 oraz zastosowania^36-38 skanowania krokowego z rozdzielczością czasową zostały szczegółowo omówione w innym miejscu.

Celem obecnego wkładu jest dostarczenie protokołu opisującego praktyczne aspekty czasowo-rozdzielczej spektroskopii FT-IR metodą skanowania krokowego na światłoczułych białkach błonowych. W tym miejscu przedstawiono wydajność tej techniki dla dwóch metod próbkowania: transmisji i całkowitego odbicia tłumionego (ATR). Zastosowanie ATR pozwala na pracę w obecności nadmiaru wody, co nie tylko zapewnia pełne warunki nawodnienia białka, ale także pozwala na dokładną kontrolę pH próbki i siły jonowej^49,50. Eksperymenty step-scan zilustrowano na dwóch wybranych systemach: bakteriorodopsyny i rodopsyny kanałowej-2.

Bakteriorodopsyna pompy protonowej (bR) napędzana światłem jest przedmiotem licznych badań biofizycznych od ponad czterdziestu lat^39,40, co czyni ją najlepiej poznanym białkiem błonowym do tej pory. Spośród licznych technik stosowanych do badania funkcjonalności bR, spektroskopia FT-IR wywarła prawdopodobnie jeden z największych wpływów. Mianowicie, spektroskopia FT-IR była kluczem do rozdzielenia grup zaangażowanych w transfer protonów przez błonę, jak opisano w innym miejscu^13,41,51.

Rodopsyna kanałowa (ChR) jest pierwszym kanałem jonowym bramkowanym światłem znalezionym w przyrodzie^42,43. Wzbudzenie świetlne ChR prowadzi do przejściowego otwarcia kanału jonowego. Jego odkrycie utorowało drogę do rozwoju optogenetyki, w której procesy molekularne są kontrolowane przez światło^44,45. ChR należy, podobnie jak bR, do rodziny rodopsyn drobnoustrojów, ale w przeciwieństwie do bR znacznie mniej wiadomo o jego mechanizmie funkcjonalnym⁵². ChR2 łączy swoją funkcję kanału jonowego z aktywnością pompowania protonów^46,47. Niedawno zastosowaliśmy spektroskopię FT-IR z funkcją skanowania krokowego w czasie, aby rozwiązać reakcje transferu protonów wewnątrz białka i dynamikę zmian konformacji szkieletu białka w ChR2 ⁴⁸.

Protokół

1. Ogólne aspekty przygotowania próbek i instrumentów

1. Użyj komercyjnego spektrometru FT-IR wyposażonego w pomiary krokowe z rozdzielczością czasową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, umieść spektrometr FT-IR na stole z odsprzęgnięciem drgań.
2. Opróżnij komorę optyki do kilku mbar. Przedmuchnąć komorę próbki suchym powietrzem lub azotem.
3. Umieść przezroczysty materiał IR nieprzezroczysty dla promieniowania widzialnego przed detektorem MCT spektrometru FT-IR. Ten środek ostrożności jest niezbędny, aby zapobiec artefaktom pochodzącym z wzbudzającego impulsu laserowego podczas eksperymentów ze skanowaniem krokowym. Uwaga: Używamy okna germanowego (Ge) o średnicy 25 mm. Jego wysoki współczynnik załamania światła powoduje niepożądane straty intensywności, których w dużej mierze uniknięto stosując filtr Ge z powłoką antyrefleksyjną.
4. Schłodzić detektor MCT dewara ciekłym azotem. Uwaga: Stosowanie fotowoltaicznych detektorów MCT jest preferowane w stosunku do fotoprzewodzących ze względu na ich liniową odpowiedź, a tym samym lepszą dokładność fotometryczną i niezawodność bazową^31,53.
5. Próbkę użytą do eksperymentów należy wstępnie zagęścić do co najmniej 2 mg białka/ml w buforze o niskiej (<20 mM) sile jonowej, aby zapobiec tworzeniu się kryształów soli podczas suszenia zawiesiny białkowej w celu utworzenia jednorodnego filmu białkowego. W przypadku próbek, które osadzają się, należy je przemyć/zagęścić, stosując ultrawirowanie (np. białka błonowe w liposomach lub w łatach błony komórkowej). Używaj centrikonów o odpowiednim odcięciu dla białek, które nie osadzają się (np. białka błonowe rozpuszczone w detergentach).
6. W celu uzyskania optymalnych rezultatów należy stosować: a) preparaty białkowe tak czyste i aktywne, jak to tylko możliwe; b) stosunek lipidów do białek ≤ 3 w masie dla białek w płatach błony komórkowej lub odtworzonych w liposomach; c) Stosunek detergentu do białka ≤ 1 w masie dla białek rozpuszczalnych w detergentach. Unikaj stosowania detergentów lub lipidów, których pasma drgań pokrywają się z pasmami białka (np. CHAPS).

2. Przygotowanie eksperymentów z całkowitym odbiciem przy użyciu bakteriorodopsyny

1. Zamontuj akcesorium ATR w komorze na próbkę spektrometru FT-IR. Uwaga: Używamy ZnSe/diamentowego ATR z 5 aktywnymi odbiciami. Unikaj materiałów półprzewodnikowych, takich jak german lub krzem, jako wewnętrznego elementu odbijającego (IRE) akcesorium ATR, ponieważ na ich właściwości optyczne wpływa wzbudzający laser widzialny.
2. Zmierz szerokie spektrum energii (ok. 4 000-800 ^cm-1) o rozdzielczości 4 ^cm-1 czystej powierzchni IRE za pomocą konwencjonalnej szybkiej spektroskopii FT-IR. Użyj tego widma jako widma odniesienia do obliczenia widm absorpcyjnych na późniejszym etapie.
3. Pokryć powierzchnię IRE ATR 20 μl buforu użytego później do ponownego uwodnienia próbki (np. 4 M NaCl i 100 mM NaPi przy pH 7,4). Zmierz absorpcję podczerwieni przez bufor.
4. Usuń bufor i spłucz powierzchnię IRE wodą. Unikaj dotykania powierzchni. Usuń resztki cieczy z powierzchni IRE za pomocą intensywnego przepływu powietrza.
5. Rozprowadź ~3 μl bakteriorodopsyny (bR) w fioletowych błonach (~6 mg białka/ml w wodzie dejonizowanej) na powierzchni IRE (obszar ~0,2 cm2). Wysuszyć zawiesinę białkową pod delikatnym strumieniem suchego powietrza, aż do uzyskania filmu.
6. Zmierzyć widmo absorpcyjne suchej warstwy (patrz rysunek 1).
7. Delikatnie dodaj 20-40 μl buforu o wysokiej sile jonowej, aby ponownie nawodnić suchą warstwę (np. 4 M NaCl i 100 mM NaPi przy pH 7,4). Uwaga: Wysoka siła jonowa zapobiega nadmiernemu pęcznieniu błony membranowej, co pozwala na zatrzymanie jak największej ilości białka blisko badanej powierzchni (ryc. 2).
8. Przykryj uchwyt ATR pokrywką, aby zapobiec parowaniu wody. Opcjonalnie należy umieścić osłonę podłączoną do kąpieli cyrkulacyjnej ustawionej na 25 °C w celu kontroli temperatury. W przypadku białek o długich cyklach fotocyklicznych (>sekund) kontrola temperatury może zwiększyć stabilność linii podstawowej.
9. Zmierzyć widmo absorbancji. Oszacuj procent próbki pozostałej w pobliżu powierzchni po ponownym uwodnieniu filmu, odejmując widmo absorpcyjne buforu (rysunek 3).
10. Potwierdź stabilizację pęcznienia filmu, rejestrując widma absorpcyjne w odstępach 5-20 minut po ponownym nawodnieniu (ryc. 4). Ten krok jest opcjonalny, ale zalecany.

3. Przeprowadzanie eksperymentów transmisyjnych na rodopsynie kanałowej solubionej w detergentach-2

1. Dodać 10 μl ChR2 (~10 mg białka/ml) rozpuszczonego w 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) i decylomaltozydzie (DM) w środku okienka BaF₂ o średnicy 20 mm. Rozprowadzić go za pomocą końcówki mikropipety do średnicy 6-8 mm (gęstość powierzchni białka ~ 200 μg/cm²).
2. Uformuj film za pomocą delikatnego przepływu suchego powietrza. Aby uzyskać najlepsze wyniki, upewnij się, że folia jest jednorodna i ma średnicę mniej więcej odpowiadającą rozmiarowi wiązki podczerwieni przy największej aperturze.
3. Uwodnić folię, dodając 3-5 μl mieszaniny glicerolu/wody rozprowadzonej w 3-5 kroplach wokół suchej folii i szczelnie zamknąć ją drugim okienkiem za pomocą płaskiego silikonowego O-ringu o grubości ≥1 mm. Uwaga: Stosunek mieszaniny glicerolu i wody kontroluje wilgotność względną między oknami⁵⁴. W przypadku próbek higroskopijnych należy zastosować stosunek 3/7 lub 2/8 glicerolu do wody (w/w). Krople glicerolu/wody nigdy nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z filmem białkowym.
4. Włóż okna warstwowe BaF₂ do uchwytu. Zapobiegaj przedostawaniu się światła prostego do detektora, zakrywając okienko próbki nieprzezroczystym materiałem w podczerwieni, takim jak papier, z otworem dopasowanym do rozmiaru uwodnionej folii. Umieścić uchwyt w komorze na próbki.
5. Regulować temperaturę uchwytu do 25 °C za pomocą płaszcza termostatycznego podłączonego do łaźni cyrkulacyjnej o kontrolowanej temperaturze.
6. Zmierz widmo absorpcyjne. Upewnij się, że maksymalna absorpcja w obszarze amidu I (~1,700-1,620 ^cm-1) mieści się w zakresie 0,6-1,0.
7. Oszacuj masę i stosunek molowy białka/detergentu/wody z widma absorpcji uwodnionego filmu (Rysunek 5) przy użyciu referencyjnych widm współczynnika ekstynkcji dla wody, DM i reprezentatywnych białek błonowych (Rysunek 6).
8. Poczekaj, aż poziom nawodnienia ustabilizuje się przed wykonaniem eksperymentów skanowania krokowego (≥1 godzina).

4. Regulacja i synchronizacja ekscytującego lasera

Do eksperymentów na bR użyj drugiej harmonicznej emisji impulsowego lasera Nd:YAG (λ = 532 nm), aby uruchomić fotocykl. W przypadku eksperymentów z udziałem ChR2 należy użyć wzbudzenia λ = 450 nm, jak zapewnia optyczny oscylator parametryczny (OPO) napędzany trzecią harmoniczną (λ = 355 nm) lasera Nd:YAG. Upewnij się, że impuls laserowy jest wystarczająco krótki (~10 nsec), aby zminimalizować wtórne wzbudzenie foto. Uwaga: Energia impulsów laserowych powinna być jak najbardziej stała. W naszej konfiguracji intensywność lasera waha się o ≤10% wokół wartości średniej, co potwierdza pomiar odbicia lasera za pomocą fotodiody podłączonej do rejestratora stanów nieustalonych i całkującej odpowiedź (ilustracja 8).

1. Sprzęgnij laser z próbką. Dostosuj gęstość energii lasera na próbce do 2-3 mJ/^cm2 na impuls za pomocą miernika mocy.
   1. Do konfiguracji ATR użyj światłowodu umieszczonego na górze pokrywy ATR.
   2. W przypadku eksperymentów transmisyjnych należy użyć luster, aby sprowadzić laser do próbki i, jeśli to konieczne, soczewek do kolimacji lub dywersacji wiązki laserowej do średnicy nieco większej niż rozmiar warstwy próbki.
2. Zsynchronizuj impuls laserowy z rejestracją danych przez spektrometr. Użyj impulsu TTL synchronizacji Q-switch elektroniki lasera Nd:YAG, aby wyzwolić spektrometr. Ustaw szybkość wzbudzenia lasera Nd:YAG odpowiednio na 10 Hz dla bR i 0.25 Hz dla ChR2.
3. Użyj generatora opóźnienia impulsów (PDG), aby kontrolować szybkość wzbudzenia lasera, jeśli częstotliwość powtarzania lasera Nd:YAG nie jest łatwa do regulacji.
   1. Podłącz lampę synchronizacyjną lasera Nd:YAG do wejścia zewnętrznego wyzwalacza PDG. PDG zapewnia opóźniony impuls wyjściowy TTL o ~190 μs do wejścia synchronizacji przełącznika Q lasera Nd:YAG w celu wyzwolenia lasera. Bramkuje PDG, aby akceptować wyzwalacz zewnętrzny dopiero po upływie określonego czasu od ostatniego zaakceptowanego wyzwalacza (100 ms dla bR lub 4 s dla ChR2).

5. Przygotowania i ustawienia skanowania krokowego z rozdzielczością czasową

1. Umieść dolnoprzepustowy filtr optyczny w ścieżce optycznej. Aby wykonać pomiary krokowe z rozdzielczością w czasie w zakresie spektralnym 1,800-850 ^cm-1, należy użyć filtra nieprzezroczystego powyżej 1,950 ^cm-1 i z dobrą transmisją (>50-80%) poniżej 1,800 ^cm-1 (rysunek 7).
2. Zmień detektor z trybu sprzężonego AC na DC. Uwaga: Po tej regulacji sygnał interferogramu nie będzie już oscylował wokół zera, ale wokół wartości znanej jako poziom DC.
3. Użyj największej możliwej apertury wiązki spektrometru, aby uzyskać wyższy strumień fotonów, a tym samym lepszy stosunek sygnału do szumu, ale w granicach liniowości detektora.
4. Zmniejsz poziom prądu stałego interferogramu do zera i ponownie wyreguluj wzmocnienie elektroniczne, aby lepiej wykorzystać zakres dynamiki analogowego przetwornika cyfrowego (ADC). Osiągnij przesunięcie poziomu DC, stosując polaryzację napięcia do sygnału dostarczanego przez przedwzmacniacz. Uwaga: Ta opcja jest dostępna w nowoczesnych spektrometrach FT-IR. W przeciwnym razie można zamiast tego użyć domowego urządzenia zewnętrznego, umieszczonego między przedwzmacniaczem a ADC ³⁸. Należy wtedy zadbać o to, aby elektronika takiego urządzenia była szybka i liniowa.
5. Uruchom menu skanowania krokowego spektrometru FT-IR. Ustaw docelowe pasmo spektralne dla pomiaru step-scan na 1,975.3-0 ^cm-1. Dostosuj szerokość pasma spektralnego do ułamka liczby falowej lasera He-Ne (1/8^th w tym przypadku), nieznacznie przekraczając granicę odcięcia filtra optycznego.
6. Wyłącz wszelkie górnoprzepustowe filtry elektroniczne, aby zapobiec zniekształceniom kinetyki w późniejszym czasie. Dolnoprzepustowy filtr elektroniczny może być korzystny, gdy jego częstotliwość odcięcia jest w kolejności lub powyżej częstotliwości próbkowania przetwornika ADC (zmniejsza aliasing szumów).
7. Ustaw rozdzielczość spektralną i fazową odpowiednio na 8 ^cm-1 i 64 ^cm-1. Ustaw tryb akwizycji interferogramu na jednostronny do przodu. Przy tych opcjach jeden interferogram wymaga około 500 punktów.
8. Ustaw częstotliwość próbkowania przetwornika ADC na najwyższą dostępną w spektrometrze (np. 160 kHz lub 6,25 μs). Ustaw "spust eksperymentu" na "Zewnętrzny", tj. laser jest mistrzem. Ustaw liczbę punktów danych rozmieszczonych liniowo, które mają być rejestrowane: 7 000 dla bR (do 42 ms) i 20 000 dla ChR2 (do 125 ms). Uwaga: Dłuższe skale czasowe mogą być pokryte bez przepełniania pamięci ADC za pomocą quasi-logarytmicznie rozmieszczonych w czasie zewnętrznych impulsów TTL z generatora fal w celu wyzwolenia akwizycji danych ³⁸ lub przy użyciu dwóch równoległych rejestratorów stanów przejściowych jako substytutów wewnętrznego ADC^31,32.
9. Zapisz około 100 punktów przed wyzwoleniem jako odniesienie dla ciemnego stanu próbki. Uwaga: W milisekundowej skali czasowej jakość danych jest często ograniczona przez wahania w mobilnym lustrze. W związku z tym nie oczekuje się, że zwiększenie punktów przed wyzwoleniem powyżej 100 znacząco poprawi jakość danych.
10. Ustaw liczbę koaddycji, tj. liczbę średnich wyników fotoreakcji na pozycję lustra. W przypadku bR należy użyć 20 koaddycji (20 minut czasu pomiaru przy współczynniku wzbudzenia 10 Hz). Dla ChR2 użyj 2 koaddycji (70 min czasu pomiaru przy szybkości wzbudzenia 0,25 Hz)
11. Powtórz eksperyment 10 razy dla bR i 35 razy na trzech różnych foliach próbek dla ChR2, aby ostatecznie uzyskać ~200 koaddycji na pozycję lustra.

6. Przetwarzanie danych

1. Potwierdź stan próbki, porównując widmo różnicowe podczerwieni wywołane światłem uzyskane z pierwszego i ostatniego pomiaru. Rozważ odrzucenie wszelkich pomiarów, w których intensywność widma różnicowego spadnie poniżej 60% pierwszego pomiaru.
2. Uśrednić zarejestrowane interferogramy.
   1. Za pomocą oprogramowania OPUS ze spektrometru FTIR wybierz interferogramy czasowo-rozdzielcze do uśrednienia i dodaj je do "Kalkulatora widma".
   2. Kliknij "=", aby uzyskać średnią z interferogramów.
      Uwaga: Gdy faza interferogramu jest stała podczas pomiaru, jest ona obojętna dla średnich interferogramów lub widm jednokanałowych. Fazę stałą można potwierdzić poprzez obliczenie i porównanie widma fazowego dla pierwszego i ostatniego zarejestrowanego interferogramu.
3. Wykonać transformację Fouriera uśrednionych interferogramów czasowo-rozdzielczych, aby uzyskać uśrednione czasowo rozdzielcze widma jednokanałowe.
   1. Korzystając z tego samego oprogramowania, co w kroku 6.2.1, wybierz uśredniony interferogram czasowo-rozdzielczy i kliknij ikonę "interferogram do widm". Użyj metody korekcji fazy Mertza, zerowego współczynnika wypełnienia wynoszącego 2 (dwa punkty cyfrowe na rozdzielczość instrumentalną) i funkcji apodyzacji (np. trójkąt, 3-wyrazy Blackmanna-Harrisa itp.).
   2. Kliknij dolny przycisk "konwertuj", aby przekształcić interferogram czasowo-rozdzielczy w widma czasowo-rozdzielcze.
4. Eksportuj dane jednokanałowe z rozdzielczością czasową jako "tabelę punktów danych" lub plik "matlab" za pomocą ikony "zapisz jako" w oprogramowaniu OPUS. Kontynuuj przetwarzanie danych w zewnętrznym programie.
   1. Uśrednij widma jednokanałowe przed laserem i przekształć dane jednokanałowe rozdzielcze w czasie na widma różnic absorpcji w czasie.
   2. Oblicz wektor oczekiwanego odchylenia standardowego szumu w widmach różnicowych w funkcji liczby falowej (rysunek 12), używając odchylenia standardowego szumu, ε i średniej, S₀(ν), ze 100 widm jednokanałowych poprzedzających laser: ε / S₀(ν). Wartość ε jest szacowana poprzez odjęcie kolejnych widm jednokanałowych i obliczenie odchylenia standardowego skorygowanego o √2.
   3. Usuń obszary widmowe zbyt hałaśliwe, aby były użyteczne (np. powyżej 1,825 ^cm-1 i poniżej 850 ^cm-1).
   4. Przeprowadzić uśrednianie quasi-logarytmiczne (np. 20 widm/dekadę czasu). Wygląd danych ulegnie poprawie, a liczba widm zostanie zmniejszona z ~10⁴ do ~10² bez utraty jakichkolwiek istotnych informacji (Rysunek 9).
   5. Zwiększ czterokrotnie gęstość widmową punktów (do 1 punktu/^cm-1) za pomocą interpolacji Fouriera (po wypełnieniu zerem).
      Uwaga: Wykonujemy kroki od 6.4.1 do 6.4.4 w domowym programie działającym w MATLAB.
5. Przetwarzaj uzyskane widma czasowo-rozdzielcze (rysunek 10A) z dekompozycją wartości osobliwych, SVD, (rysunek 13). Odszumianie danych odbywa się poprzez rekonstrukcję danych przy użyciu ograniczonej liczby istotnych składników SVD (Rysunek 10B). Uwaga: SVD wykonujemy w MATLAB, korzystając z wbudowanej funkcji "svd".

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia widmo absorpcyjne suchego filmu bR osadzonego na powierzchni diamentowego elementu wewnętrznego odbicia stosowanego w spektroskopii ATR. Wyraźnie widoczne są charakterystyczne pasma drgań wiązania peptydowego (amid A, amid I i amid II). Przybliżoną grubość suchego filmu można oszacować na ~1 μm, biorąc pod uwagę ilość dodanego białka (18 μg) oraz powierzchnię ATR (~0.2 cm²), a także przyjmując gęstość białka na poziomie ~1.4 g/cm³,⁵⁸, lipidów 1.0 g/cm³,⁵⁹ oraz stosunek lipidów do białek 1/3 (w/w) w błonie purpurowej⁶⁰.

Suchą błonę rehydratowano nadmiarem 4 M NaCl, 100 mM NaPi o pH 7.4 (Rysunek 3). Poziom hydratacji oraz efektywne stężenie białka w objętości sondowanej przez falę ewanescentną można wyprowadzić z czynnika skalującego niezbędnego do cyfrowego usunięcia pasm absorpcyjnych wody. Optymalny czynnik skalujący wyniósł 0.87, co oznacza, że w tym przypadku bufor zajmuje 87%, a próbka 13% objętości w pobliżu powierzchni. Biorąc pod uwagę gęstość białek i lipidów oraz stosunek lipidów do białek w purpurowych błonach (patrz wyżej), możemy wyznaczyć efektywne stężenie białka wynoszące 125 mg/ml w objętości sondowanej przez falę ewanescentną. Na podstawie poziomu hydratacji można wywnioskować, że w tym konkretnym przypadku grubość błony próbki zwiększyła się ~6 razy podczas rehydratacji, z ~1 do ~6 μm. Dla kąta padania 45°, typowego dla naszej i większości konfiguracji ATR, głębokość penetracji pola ewanescentnego (d_p) dla hydratowanej błony białkowej w zakresie 1,800-850 cm^-1 waha się od 0.3 do 0.6 μm ⁶¹. Ponieważ pole ewanescentne jest niemal niewrażliwe na próbkę znajdującą się na wysokości dwukrotności d_p ⁶¹, wnioskujemy, że ilość białka użyta w eksperymencie ATR mogłaby w zasadzie zostać zredukowana 5x bez żadnej znaczącej utraty sygnału.

Przy użyciu buforów o niższej sile jonowej film bardziej pęcznieje, a ilość białka w objętości sondowanej przez pole ewanescentne ulega zmniejszeniu (Rysunek 2). Dokładna zależność między pęcznieniem filmu a siłą jonową buforu będzie zależeć, między innymi, od rodzaju lipidów. Na przykład podobne pęcznienie filmu, jakie uzyskano tutaj dla bR w błonie purpurowej przy użyciu 4 M NaCl, osiągnięto dla białka błonowego zrekonstytuowanego w polarnych lipidach E. coli przy użyciu zaledwie 0,1 M NaCl ⁶². Jeśli próbka zajmuje mniej niż 5% objętości sondowanej, należy rozważyć powtórzenie etapu hydratacji z użyciem buforu o wyższej sile jonowej. Pęcznienie filmu po hydratacji wymaga pewnego czasu do osiągnięcia stabilizacji (Rysunek 4). Dla bR w błonie purpurowej proces ten jest monoeksponencjalny, ze stałą czasową wynoszącą 12 min: uzyskanie stabilnego rehydratowanego filmu zajmuje nie więcej niż 30-60 min

Rysunek 5 przedstawia widmo absorpcyjne IR uwodnionego filmu ChR2 uzyskane metodą transmisji. Uwodnienie osiągnięto poprzez wystawienie suchego filmu na działanie atmosfery o kontrolowanej wilgotności, zapewnionej przez mieszaninę glicerolu i wody. Widmo można rozłożyć na wkłady pochodzące z wody, detergentu i białka. Ilość każdego z tych składników oszacowano przy użyciu widm współczynnika ekstynkcji, przeskalowanych tak, aby pasowały do widma eksperymentalnego. Dla wody przyjęto widmo współczynnika ekstynkcji z literatury⁶³, a dla DM zmierzono je z roztworu o stężeniu 100 mg/ml (Rysunek 6). Wykorzystano również współczynniki ekstynkcji dla dwóch reprezentatywnych białek błonowych: mitochondrialnego transportera ADP/ATP⁶⁴ oraz bR (Rysunek 7). Współczynnik skalowania wskazuje na gęstość powierzchniową masy wody i DM w filmie wynoszącą odpowiednio 260 μg/cm² i 200 μg/cm². Pozostała absorpcja (Rysunek 5, czerwona linia) pochodzi głównie z białka, którego gęstość powierzchniową oszacowano na 250 μg/cm², wykorzystując współczynnik ekstynkcji pasma amidu II dla dwóch różnych białek błonowych (patrz Rysunek 6). Stosunek molowy białko/detergent/woda obliczono na 1/60/2000, przyjmując odpowiednio masy cząsteczkowe 35 kDa, 480 Da i 18 Da.

Wykres 3D z typowego eksperymentu czasowo-rozdzielczego FT-IR z metodą step-scan na bR przedstawiono na Rysunku 10A; dane uzyskano metodą ATR w czasie akwizycji wynoszącym 200 min. Widma można wyodrębnić dla konkretnych momentów czasowych, na przykład gdy produkty pośrednie L, M i N fotocyklu bR osiągają najwyższą populację (Rysunek 11). Ich cechy spektralne zostały szeroko opisane^13,41,65 i nie będą tutaj dalej omawiane. Rysunek 12 przedstawia przebiegi czasowe dla wybranych liczb falowych. Mianowicie, wzrost kinetyki przy 1,762 cm^-1 (t_1/2 ~60 μsec) informuje o dynamice protonowania Asp85 z zasady Schiffa retinalu⁶⁶, a jej spadek do zera wskazuje na deprotonowanie podczas powrotu do stanu podstawowego⁶⁷. Ujemny wzrost kinetyki przy 1,740 cm^-1 (t_1/2 ~1 msec) informuje o deprotonowaniu łańcucha bocznego Asp96, który jest donorem protonu dla zasady Schiffa⁶⁸. Spadek intensywności do zera informuje o jego reprotonowaniu z cytoplazmy⁶⁷. Dynamikę zmian konformacyjnych białka można badać poprzez zmiany absorpcji w obszarze amidu I i amidu II, które osiągają maksymalną zmianę przy ~3 msec w temperaturze pokojowej^67,69.

Zastosowanie SVD w problemach spektroskopowych było już wcześniej omawiane^55,56. W skrócie, SVD rozkłada dane eksperymentalne, uporządkowane w macierzy A, jako: A = U S V^T. Rozkład ten można zmodyfikować, aby uwzględnić zależność szumu od liczby fal oraz aby zminimalizować wpływ fluktuacji/dryftów linii bazowej⁵⁷. Kolumny macierzy U i V zawierają odpowiednio ortonormalne widma oraz wektory przebiegów czasowych dla każdego komponentu SVD. S jest macierzą diagonalną zawierającą tzw. wartości osobliwe. (Abstrakcyjne) komponenty spektro-temporalne w macierzach U i V pojawiają się w kolejności malejącej istotności dla opisu danych eksperymentalnych w sensie najmniejszych kwadratów, co jest określane przez przypisaną im wartość osobliwą. Rycina 13A przedstawia wartości osobliwe jako funkcję numeru komponentu oraz reprodukuje pierwsze osiem kolumn/komponentów macierzy U (abstrakcyjne widma, Rycina 13B) i V (abstrakcyjne przebiegi czasowe, Rycina 13C). Sygnał jest skoncentrowany w pierwszych pięciu komponentach (zgodnie z oczekiwaniami dla fotocyklu zawierającego pięć stanów pośrednich), podczas gdy komponenty powyżej są w dużej mierze zdominowane przez szum losowy i inne źródła błędów. Dane eksperymentalne zostały zrekonstruowane przy użyciu tylko pierwszych pięciu kolumn macierzy U i V oraz pierwszych pięciu kolumn i wierszy macierzy S. Dane zrekonstruowane metodą SVD stanowią najlepszą aproksymację danych eksperymentalnych w sensie najmniejszych kwadratów do macierzy o randzie pięć. Zrekonstruowane dane wykazują poprawioną jakość (Rycina 10B). A konkretnie, znacząco zredukowano szum, a także niektóre ledwo zauważalne fluktuacje i dryfty linii bazowej (częste w spektroskopii step-scan z rozdzielczością czasową ²⁵). Przetwarzanie SVD jest szczególnie korzystne dla poprawy jakości eksperymentalnych przebiegów czasowych w zakresie milisekund (czerwone linie na Rycini 12).

Dane z pomiarów step-scan z rozdzielczością czasową dla fotocyklu ChR2 uzyskano zgodnie z opisanym powyżej protokołem dla eksperymentów transmisyjnych (Rysunek 14A), co obejmowało łącznie około 120 h pomiarów. Zakres czasowy danych zebranych metodą step-scan wynosi od 6,25 µsec do 125 msec. Fotocykl ChR2 wymaga około 60 s do pełnego powrotu do stanu wyjściowego. Końcową fazę fotocyklu można objąć pomiarami rapid-scan FT-IR, a następnie połączyć zbiory danych step-scan i rapid-scan, zgodnie z opisem przedstawionym w innym opracowaniu⁴⁸. Zmiany spektralne ChR2 są około 10-krotnie mniejsze niż te uzyskiwane dla bR, co czyni pomiary bardziej wymagającymi. W szczególności przy tak niskich zmianach absorbancji wyraźnie widoczne stają się oscylacje linii bazowej w zakresie milisekundowym. Wynikają one z niewielkich drgań ruchomego lustra w skali czasowej milisekundowej²⁵. Oscylacje te, wraz z częścią szumu, można w dużej mierze usunąć za pomocą SVD, co znacząco poprawia wygląd danych (Rysunek 14B).

Rysunek 1. Widmo absorpcyjne bR w purpurowej membranie osuszonej na diamentowej powierzchni akcesorium ATR. Oznaczono pasma drgań wiązania peptydowego (amid I, II i A).

Rycina 2. Widmo absorpcyjne błony bR po rehydratacji przy użyciu buforów o różnych mocnościach jonowych (rozcieńczenia 4 M NaCl, 100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ przy pH 7.4). Zwróć uwagę na spadek pasma amidu II, t.j. zwiększone pęcznienie błony, wraz ze spadkiem mocności jonowej buforu. (Wstawka) Względna ilość białka w pobliżu powierzchni, określona na podstawie intensywności absorbancji przy 1,541 cm^-1 (maksimum amidu II) po odjęciu wkładu absorpcyjnego buforu.

Rycina 3. Widmo absorpcyjne filmu bR rehydratyzowanego buforem objętościowym (siła jonowa 4,3 M) po odjęciu wkładu buforu. Współczynnik odejmowania, 0,87, wybrano w celu usunięcia silnej absorpcji wody w zakresie 3700-3000 cm^-1 oraz uzyskania płaskiej linii bazowej w zakresie 2700-1800 cm^-1.

Rycina 4. Widmo absorpcyjne bR po rehydratacji buforem o sile jonowej 4,3 M (dla przejrzystości odjęto absorpcję buforu, analogicznie jak na Rycini 3). Wstawka przedstawia przebieg pęcznienia filmu po rehydratacji, a następnie absorbancję amidu II białka przy 1 541 cm^-1. Dopasowanie do pojedynczej funkcji wykładniczej wskazuje, że stała czasowa stabilizacji pęcznienia filmu wynosi 12 min.

Rysunek 5. Widmo absorpcyjne uwodnionej warstwy ChR2 zmierzone metodą transmisji (linia niebieska). Widmo współczynnika ekstynkcji wody (przerywana linia pomarańczowa) i DM (przerywana linia cyjanowa) zostało przeskalowane i odjęte (linia czerwona).

Rysunek 6. Odtworzone widma współczynnika ekstynkcji masowej w 25 °C dla wody w stanie ciekłym (http://www.ualberta.ca/~jbertie/JBDownload.HTM#Spectra) oraz dla uwodnionego filmu nośnika ADP/ATP (AAC)⁶⁴. Widmo współczynnika ekstynkcji masowej zmierzono w roztworze dla DM (100 mg/ml) oraz w uwodnionym filmie dla bR.

Rycina 7. Transmitancja filtra optycznego zastosowanego w pomiarach FT-IR w trybie scan-scan z rozdzielczością czasową.

Rycina 8. Charakterystyka impulsów laserowych generowanych przez drugą harmoniczną (532 nm) lasera Nd:YAG. Histogram zmienności energii względnej 1 000 impulsów laserowych oraz dopasowanie do rozkładu Gaussa z odchyleniem standardowym 0,05.

Rycina 9. Zmiany absorbancji bR indukowane światłem przy trzech reprezentatywnych liczbach falowych w jednolitych odstępach czasu (linie zielona, czarna i niebieska) oraz po uśrednianiu kwazi-logarytmicznym do ~20 punktów/dekady (linie czerwone). Zauważalna jest redukcja szumów po uśrednianiu logarytmicznym, co ujawnia oscylacje przebiegów czasowych w zakresie milisekund.

Rysunek 10. Trójwymiarowa reprezentacja zmian absorbancji indukowanych światłem dla bR zarejestrowanych za pomocą ATR przy pH 7.4 (4 M NaCl, 100 mM NaPi). A) Dane surowe. B) Dane zrekonstruowane z pięciu komponentów SVD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 11. Spektra różnicowego pochłaniania FT-IR fotocyklu bR w trzech wybranych punktach czasowych, w których najwyższe stężenie wykazują produkty pośrednie L (12.5 µsec), M (300 µsec) oraz N (6 msec).

Rysunek 12. Transfer protonów i dynamika szkieletu białkowego w fotocyklu bR rozstrzygnięta za pomocą spektroskopii różnicowej FT-IR w trybie step-scan z rozdzielczością czasową. Zmiany absorbancji przy 1,762 cm^-1 informują o dynamice protonowania/deprotonowania Asp85, a przy 1,741 cm^-1 o dynamice deprotonowania/reprotonowania Asp96 (w tym o zmianach wiązań wodorowych przed 300 μsec). Przebiegi czasowe przy 1,670 i 1,555 cm^-1 informują o zmianach w drganiach amidowych I i II, które są wrażliwe na konformację szkieletu peptydowego. Linie czarne odpowiadają surowym danym, a czerwone danym przetworzonym metodą SVD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13. Rozkład według wartości osobliwych (SVD) eksperymentalnych danych FT-IR z rozdzielczością czasową i skanowaniem skokowym dla fotocyklu bR (patrz Rysunek 10A). SVD wykonano po ważeniu danych eksperymentalnych z uwzględnieniem zależności odchylenia standardowego szumu od liczby falowej (Rysunek 15); w połączeniu z 1^szą pochodną w celu zmniejszenia wagi statystycznej fluktuacji linii bazowej, zgodnie z wcześniejszym opisem⁵⁷. A) Wykres względnych wartości osobliwych dla pierwszych 50 komponentów (czarne kółka). Pierwsze pięć komponentów przypisano do komponentów sygnału (czerwone kółka). Pozostałe komponenty zanikają wykładniczo, co jest oczekiwane dla komponentów szumu (patrz przerywana szara linia). B) Pierwsze osiem widm abstrakcyjnych (U₁ do U₈). C) Pierwsze osiem abstrakcyjnych przebiegów czasowych (V₁ do V₈). Widma abstrakcyjne i przebiegi czasowe przypisane do sygnału przedstawiono czerwonymi liniami, a pozostałe czarnymi liniami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 14. Trójwymiarowa reprezentacja zmian absorbancji IR indukowanych światłem dla ChR2, zarejestrowanych metodą step-scan w trybie transmisji. Dane step-scan obejmują czas do 125 msec, co pokrywa jedynie część fotocyklu. A) Dane surowe. B) Dane zrekonstruowane przy użyciu pięciu komponentów SVD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 15. Szacowany poziom szumu w spektrometrze FT-IR. Widmo różnicowe absorpcji przy rozdzielczości czasowej 6,25 μsec i spektralnej 8 cm^-1 dla eksperymentu obejmującego 1 koaddycję/pozycję lustra (500 fotoreakcji) lub ~200 koaddycji/pozycji lustra (10⁵ fotoreakcji). Wartości przedstawiono dla układu osłabionego całkowitego odbicia (ATR) oraz układu transmisyjnego.

Dyskusja

Jednym z pierwszych aspektów, który należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania czasowo-rozdzielczych eksperymentów FT-IR na białku jest przygotowanie próbki w odpowiedniej formie do spektroskopii w podczerwieni. Absorpcja podczerwieni przez substancje inne niż białko będące przedmiotem zainteresowania musi zostać zmniejszona, zwłaszcza przez wodę. Najczęstszym podejściem jest odparowanie wody w próbce w celu utworzenia filmu. Folię można ponownie nawodnić, dodając kilka kropel roztworu wodnego lub wystawiając folię na działanie atmosfery o kontrolowanej wilgotności. Pokazaliśmy, jak w obu przypadkach możliwe jest oszacowanie poziomu hydratacji uzyskanego za pomocą spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni (patrz rysunek 3 i rysunek 5). Chociaż uzyskane poziomy nawodnienia mogą wydawać się niskie w porównaniu z tymi w roztworze, w rzeczywistości są one zbliżone do tych znajdujących się w żywych komórkach⁷⁰, co sprawia, że badanie uwodnionych warstw białek jest funkcjonalnie istotne. Oprócz wody ważne jest również, aby znać i kontrolować ilość lipidów lub detergentów w próbce. Oba powinny być utrzymywane na tyle niskim, aby mieć zmniejszony wpływ spektroskopowy na absorpcję podczerwieni, ale wystarczająco wysokim, aby zachować integralność i funkcjonalność białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Czasowo-rozdzielcza spektroskopia skanowania krokowego ma bezpośrednie zastosowanie tylko do białek wykazujących odwracalne reakcje, które mogą być wywołane w sposób powtarzalny przez światło (ale zobacz postęp w sprzężeniu skanowania krokowego z szybką wymianą)⁷¹. W skanowaniu krokowym reakcja musi być powtarzalna przez co najmniej ~500x, co jest minimalną liczbą, aby ukończyć interferogram obejmujący obszar 1,800-850 ^cm-1 z rozdzielczością 8 ^cm-1 . W praktyce jednak zazwyczaj wymagane jest dodatkowe uśrednianie danych, aby obniżyć poziom hałasu. Dla 200 koaddycji/pozycji lustra (10,⁵ powtórzeń reakcji) widmo różnicy absorbancji o rozdzielczości 6,25 μs może wyświetlać odchylenie standardowe szumu między 2 x ^10-5 i 2 x ^10-4 dla ATR oraz między 5 x ^10-6 a 3 x ^10-5 dla eksperymentu transmisyjnego (rysunek 15). Dzięki wyższej przepustowości fotonów, transmisja pozwala na ~7 niższy poziom szumów niż ATR, co jest kluczowym aspektem dla pomyślnego badania próbek dających słabe zmiany absorpcyjne, takie jak ChR2. Z drugiej strony, ATR wymaga od 5 do 25 razy mniej próbki niż eksperyment transmisyjny.

Zastosowanie spektroskopii FT-IR z funkcją skanowania krokowego w czasie jest problematyczne w przypadku białek wykazujących powolne cykle fotocyklowe: rejestracja interferogramu za pomocą skanowania krokowego może stać się niepraktyczna przez długi czas. Przedstawiono pewne rozwiązania postępowania w takich przypadkach^72,73, często oparte na użyciu wielu wymiennych próbek w celu przyspieszenia pomiarów kosztem zwiększonego zużycia białka i złożoności eksperymentalnej^27,74. W niektórych przypadkach możliwe jest obejście tego problemu poprzez wzbudzenie próbki przed ścisłym zakończeniem fotocyklu. W przypadku ChR2, przy fotocyklu wymagającym po fotowzbudzeniu 60 sekund do 99% odzysku, odzysk po 4 sekundach wynosi już 80%⁴⁸. Przy wydajności wzbudzenia wynoszącej 10% na impuls laserowy, 98% cząsteczek ChR2 znajduje się w stanie ciemnym 4 sekundy po fotowzbudzeniu, co umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z częstotliwością powtarzania lasera do 0,25 Hz.

Przetwarzanie danych jest ostatnim aspektem technicznym wymaganym do osiągnięcia najlepszych możliwych wyników. Uśrednianie logarytmiczne zmniejsza szum i, co równie ważne, zmniejsza rozmiar danych bez zniekształceń, co jest cechą niezbędną do późniejszej analizy danych przy użyciu dekompozycji wartości pojedynczych lub dopasowania globalnego. Uśrednianie logarytmiczne nie jest jednak zbyt skuteczne w uśrednianiu fluktuacji śladów czasowych spowodowanych oscylacjami w ruchomym zwierciadle i innymi źródłami szumu 1/f podczas pomiarów (rysunek 9). Te wahania linii bazowej mogą przekroczyć szum w zakresie milisekund i pogorszyć jakość danych. Dekompozycja wartości osobliwych wykorzystuje nadmiarowość danych w celu zmniejszenia szumu, a przy pewnych modyfikacjach⁵⁷ może również zredukować wahania linii bazowej.

Wreszcie, trudniejsza i najbardziej czasochłonna część eksperymentu FT-IR ze skanowaniem krokowym odpowiada przypisaniu pasm oraz spektralnej i kinetycznej interpretacji danych. W przypadku bakteriorodopsyny wiele pasm pojawiających się w widmach różnicowych IR zostało przypisanych lub zinterpretowanych dzięki skumulowanej pracy wielu grup badawczych na przestrzeni dziesięcioleci. W przypadku znacznie mniej zbadanego białka, takiego jak rodopsyna kanałowa-2, przedstawionym powyżej eksperymentom w podczerwieni z rozdzielczością czasową muszą towarzyszyć równoległe eksperymenty na mutantach skierowanych na miejsce i połączone z informacjami z technik komplementarnych, aby osiągnąć interpretację mechanistyczną⁴⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrometr FT-IR	Bruker	Vertex 80v	Wyposażony w detektor fotowoltaiczny MCT, zewnętrzny globalny i pompę bezolejową. Oprogramowanie układowe 2.3.
Okna BaF2	korth Kristalle
Diamond ATR akcesorium	Smiths Detekcja		Dziewięciorefleksyjny DuraDisk
Łaźnia termostatyczna	Julabo	F25
Stół z odsprzęgnięciem drgań	OPTA
Impulsowy laser Nd:YAG z generatorem drugiej harmonicznej	Elektrooptyka Continuum	Minilite
Optyczny oscylator parametryczny (OPO)	OPTA	BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Cyfrowy generator opóźnień/impulsów	Stanford Research Systems	DG535
Impulsowy laser Nd:YAG z generatorem trzeciej harmonicznej	Spectra-Physics	Quanta-Ray
Różne lustra i soczewki optyczne	ThorLabs
		Vertex 80v
			Wstępne przetwarzanie danych