Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają ważną rolę w procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w krzepnięciu, reakcjach immunologicznych i raku, lub jako potencjalne środki terapeutyczne w dostarczaniu leków lub medycynie regeneracyjnej. Protokół ten przedstawia metody kwantyfikacji i charakterystyki wielkości izolowanych i nieizolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w różnych płynach przy użyciu przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja i profilowanie wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), w tym 'mikropęcherzyki' i 'egzosomy', są bardzo obfite w płynach ustrojowych. W ostatnich latach obserwuje się ogromny wzrost zainteresowania pojazdami elektrycznymi. Wykazano, że EV odgrywają ważną rolę w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w krzepnięciu, odpowiedziach immunologicznych i raku. Ponadto pojazdy elektryczne mają potencjał jako środki terapeutyczne, na przykład jako nośniki leków lub jako medycyna regeneracyjna. Ze względu na ich niewielkie rozmiary (od 50 do 1000 nm) dokładna kwantyfikacja i profilowanie wielkości pojazdów elektrycznych jest technicznie trudne.
Ten protokół opisuje, jak technologia przestrajalnego czujnika impulsów rezystancyjnych (tRPS), wykorzystująca system qNano, może być wykorzystana do określenia stężenia i wielkości EV. Metoda, która opiera się na wykrywaniu EV po ich przeniesieniu przez pory o rozmiarze nano, jest stosunkowo szybka, wystarcza użycie małych objętości próbek i nie wymaga oczyszczania i zagęszczania EV. Obok zwykłego protokołu operacyjnego opisano alternatywne podejście wykorzystujące próbki wzbogacone kulkami polistyrenowymi o znanej wielkości i stężeniu. Ta technika kalibracji w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do pokonania przeszkód technicznych napotykanych podczas bezpośredniego pomiaru pojazdów elektrycznych w płynach biologicznych.
Wprowadzenie
Pęcherzyki pochodzenia komórkowego są bardzo obfite w płyny ustrojowe1. Te tak zwane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) (o wielkości 50 - 1000 nm) powstają albo w wyniku fuzji ciał wielopęcherzykowych z błoną komórkową, albo w wyniku bezpośredniego pączkowania błony komórkowej na zewnątrz. W ostatnich latach zainteresowanie naukowców pojazdami elektrycznymi znacznie wzrosło, co zaowocowało mnóstwem publikacji poświęconych pojazdom elektrycznym, w których opisano nowe funkcje i cechy pojazdów elektrycznych1. Obecnie uważa się, że EV biorą udział w szerokim zakresie procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak transdukcja sygnału, regulacja immunologiczna i krzepnięcie krwi1-4. W nowotworach EV wydają się odgrywać rolę w tworzeniu nisz przedprzerzutowych5,6, przenoszeniu treści pronowotworowych7,8 i stymulacji angiogenezy8. Poza tym EV są badane jako czynniki dostarczające środki terapeutyczne9.
Pomimo tych zmian, wiarygodna kwantyfikacja pojazdów elektrycznych pozostaje wyzwaniem. Tradycyjnie stosuje się pośrednie metody kwantyfikacji, które opierają się na ilościowym określeniu całkowitej zawartości białka lub określonych białek. Chociaż techniki te są szeroko stosowane, nie uwzględniają różnic w liczbie białek na EV i nie rozróżniają między zanieczyszczającymi agregatami białkowymi a białkami w EV. Co więcej, techniki te wymagają izolacji EV, co w wielu przypadkach uniemożliwia porównanie stężeń EV w próbkach biologicznych.
Dlatego podejmowane są wysiłki w celu opracowania nowych metod, które pozwalają na bardziej precyzyjny i bezpośredni pomiar EV10. W niniejszym raporcie opisano zastosowanie przestrajalnego czujnika impulsów rezystancyjnych (tRPS) do wiarygodnej kwantyfikacji i profilowania wielkości pojazdów elektrycznych.
Obecnie, instrument qNano (Rysunek 1a) jest jedyną komercyjnie dostępną platformą dla tRPS. W tRPS nieprzewodząca elastyczna membrana przerywana porami o rozmiarach nano oddziela dwie płynne komórki. Jedno z ogniw płynu jest wypełnione próbką będącą przedmiotem zainteresowania, podczas gdy drugie ogniwo jest wypełnione elektrolitem wolnym od cząstek. Poprzez przyłożenie napięcia ustalany jest przepływ jonowy/prąd elektryczny, który zmienia się po przeniesieniu cząstek przez pory (rysunek 1b). Wielkość tej blokady prądowej ("impuls rezystancyjny") jest proporcjonalna do objętości cząstki11 (rys. 1c). Czas trwania blokady może być wykorzystany do oceny potencjału zeta cząstek, który opiera się na cechach cząstek, takich jak ładunek lub kształt12. Profilowanie wielkości nieznanych cząstek można przeprowadzić, porównując impulsy rezystancyjne wywołane przez nieznane cząstki z impulsami rezystancyjnymi wywołanymi przez cząstki kalibracyjne o znanej średnicy. Oprócz skali zdarzenia blokującego mierzy się częstotliwość, z jaką do nich dochodzi. Ta szybkość zliczania zależy od stężenia cząstek. Ponieważ stężenie i szybkość blokad są liniowo proporcjonalne13, użycie pojedynczej próbki kalibracyjnej z cząstkami o znanym stężeniu i wielkości cząstek pozwala na pomiar stężenia14 i rozkładu wielkości11 nieznanej próbki.
Ruch cząstek przez nanopory jest determinowany przez siły elektrokinetyczne (elektroforetyczne i elektroosmotyczne) oraz hydrauliczne15. Dzięki zastosowaniu modułu zmiennego ciśnienia (VPM) można indukować różnicę ciśnień między ogniwami płynu jako dodatkową siłę. Zastosowanie nadciśnienia zwiększa natężenie przepływu cząstek, co może być korzystne, gdy stężenie cząstek jest niskie. Można również zastosować ciśnienie w celu zmniejszenia wpływu sił elektrokinetycznych. Jest to szczególnie ważne w przypadku stosowania nanoporów o stosunkowo małej średnicy porów (NP100, NP150 i ewentualnie NP200), które są często używane do wykrywania pojazdów elektrycznych. W przypadku tych nanoporów, nawet przy wywieraniu znacznego nacisku, siły elektrokinetyczne mogą, w zależności od ładunku powierzchniowego cząstek, pozostać niepomijalne16. Mierząc szybkość cząstek przy wielu ciśnieniach, można obliczyć elektrokinetycznie skorygowane, a tym samym dokładniejsze stężenie EV.
Tutaj dostępne są szczegółowe protokoły do określenia rozkładu wielkości i koncentracji EV. Obok zwykłego protokołu operacyjnego opisano alternatywne podejście, w którym próbki są wzbogacane kulkami polistyrenowymi o znanej wielkości i stężeniu17. Ta technika kalibracji w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do przezwyciężenia niektórych wyzwań technicznych napotykanych podczas pomiaru EV bezpośrednio w płynach biologicznych, takich jak mocz, osocze i supernatant z hodowli komórkowych, lub gdy nie można zapewnić stabilności nanoporów przez długi czas pomiaru.
Protokół
1. Standardowy protokół operacyjny
1.1 Konfiguracja instrumentu i przygotowanie próbki
- Podłącz przyrząd do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem Izon Control Suite.
- Wybierz rozmiar nanoporów, którego chcesz użyć: do pomiaru wielkości i stężenia EV najczęściej stosuje się NP150 (docelowy zakres wielkości 85 - 300 nm) lub NP200 (docelowy zakres wielkości 100 - 400 nm). Podczas pracy z EV, które zostały wyizolowane przy użyciu protokołu, który obejmuje usuwanie większych EV, na przykład poprzez przepuszczenie próbki przez filtr 220 nm, można zastosować pory NP100 (docelowy zakres wielkości 70 - 200 nm). Podczas pracy z EV w próbce biologicznej lub EV wyizolowanymi przy użyciu innego protokołu, NP200 może być używany, ponieważ będzie się rzadziej zapychał. Inne nanopory, takie jak NP300 (docelowy zakres wielkości 150 - 600 nm) lub NP400 (docelowy zakres wielkości 200 - 800 nm), a nawet większe nanopory, mogą być stosowane do większych typów pojazdów elektrycznych.
- Wybierz cząstki kalibracyjne polistyrenu, które uzupełniają nanopory wybrane w kroku 1.1.2. W przypadku nanoporów NP100, NP150 i NP200 stosuje się odpowiednio cząstki CPC100, CP100 i CPC200. Aby uzyskać dokładne oszacowanie rozmiaru, upewnij się, że cząstki kalibracyjne mają podobny rozmiar jak nieznane cząstki.
- Aby zapewnić jednorodność cząstek kalibracyjnych, należy krótko przeprowadzić wirowanie (30 sekund). Opcjonalnie zastosuj sonikację w celu usunięcia agregatów.
- Rozcieńczyć cząstki kalibracyjne w PBS do stężenia docelowego w objętości co najmniej 40 μl. Uwaga: Stężenie docelowe różni się w zależności od nanoporów wybranych w kroku 1.1.2. Stężenia docelowe są dostarczane wraz z nanoporami.
- Nałóż i bezpośrednio usuń 78 μl PBS na dolną komórkę płynu; to zwilżenie dolnej komórki płynu zmniejsza ryzyko tworzenia się pęcherzyków powietrza pod nanoporami podczas nakładania elektrolitu na dolną komórkę płynu, gdy nanopory są na swoim miejscu.
- Umieść nanopory na 4 ramionach instrumentu. Użyj suwmiarki cyfrowej, aby zmierzyć odległość między dwoma przeciwległymi ramionami i wprowadź odległość w mm w polu wejściowym "Rozciągnij" i kliknij "kalibruj rozciąganie", aby skalibrować rozciąganie nanoporowe.
- Rozciągnąć nanopory do 47 mm, obracając boczne koło i zwiększając w ten sposób odległość między przeciwległymi ramionami instrumentu, przed ponownym nałożeniem 78 μl PBS na dolną komórkę płynu.
Uwaga: Zakłócenia elektryczne mogą znacząco wpłynąć na jakość pomiarów. Używając laptopa do uruchamiania oprogramowania Izon Control Suite, upewnij się, że laptop jest podłączony do sieci energetycznej za pomocą uziemionego gniazdka i wtyczki. Telefony komórkowe trzymane blisko instrumentu mogą być również źródłem zakłóceń elektrycznych. Zakłócenia elektryczne obserwuje się jako stale powtarzające się szczyty prądu podstawowego, często z szumem średniokwadratowym (RMS) >10 pA.
Uwaga: Prawie każdy bufor może być użyty do rozcieńczania cząstek kalibracyjnych i EV w celu charakteryzacji tRPS. Obecność soli jest warunkiem wstępnym do powstania prądu elektrycznego. Do pomiarów EV należy używać PBS jako bufora. Cząstki kalibracyjne powinny być zawsze rozcieńczane w tym samym buforze co EV, aby zapewnić dokładne pomiary.
1.2. Określ optymalne ustawienia pomiaru
Uwaga: Przed nagrywaniem ważne jest, aby ustalić optymalne ustawienia pomiaru. Wielkość blokady spowodowanej przez cząstkę przechodzącą przez nanopory zależy od zastosowanego rozciągania i przyłożonego napięcia. Aby pomiary były wiarygodne, szum RMS powinien wynosić <10 pA, a wielkość blokady trybu powinna wynosić >0,1 nA.
- Umieść górną kuwetę płynu i klatkę ekranującą na nanoporach i wprowadź 40 μl rozcieńczonych cząstek kalibracyjnych do górnej celi płynu. Użyj VPM, aby zastosować nadciśnienie ≥0.8 kPa.
- Powoli zmniejszaj zastosowane rozciągnięcie w kierunku 44 mm, analizując zdarzenia blokady spowodowane przez cząstki kalibracyjne. Uwaga: Podczas zmniejszania średnicy porów ruch cząstek przez nanopory będzie mniej prawdopodobny, a tym samym szybkość cząstek zmniejszy się. Jednak ze względu na zwiększoną względną blokadę porów wystąpi większe zdarzenie blokady, co spowoduje poprawę stosunku sygnału do szumu. Zwiększenie napięcia może jeszcze bardziej zwiększyć wielkość blokady, ale może również zwiększyć szum RMS.
- Zmniejsz rozciągnięcie, aż w panelu "Śledzenie sygnału" zostaną zaobserwowane odpowiednie zdarzenia blokady (Rysunek 1c). (tryb >0,1 nA), a odpowiadająca mu szybkość cząstek wynosi >100/min. Uwaga: Szybkość cząstek jest mniej rygorystycznym punktem odcięcia, jednak ponieważ pomiary co najmniej 500 cząstek są idealne, szybkość cząstek <100/min spowoduje czas nagrywania wynoszący co najmniej 5 minut. Szybkość cząstek wyższa niż 2 000/min może skutkować mniej dokładnymi pomiarami (jeśli występują, należy przeprowadzić rozcieńczenie próbki).
1.3 Pomiar cząstek kalibracyjnych, mycie celi płynu Uper i pomiar próbki
- W tej sekcji scharakteryzowano EV z supernatantu hodowli komórkowej wielopostaciowej linii komórkowej glejaka wielopostaciowego U87-MG/EGFRvIII. Izolacja i przygotowanie tych pojazdów elektrycznych zostały już wcześniej opisane i zwizualizowane18.
- Umieść cząstki kalibracyjne w górnej komorze płynu. Zastosuj ciśnienie (na przykład 0,8 kPa) za pomocą VPM i zapisz >500 cząstek.
- W przypadku wykonywania pomiaru wielociśnieniowego należy zwiększyć przyłożone ciśnienie (na przykład do 1,0 kPa) i zapisać drugi plik kalibracyjny. Uwaga: Wymagana jest różnica co najmniej 0,2 kPa.
- Usunąć próbkę kalibracyjną z górnej komory płynu. Przemyj górną komórkę płynu 3 razy 100 μl PBS, aby usunąć resztki cząstek. Przed wprowadzeniem próbki do górnej komórki płynnej użyj niestrzępiącej się tkanki, aby usunąć resztki PBS z górnej komórki płynu.
- Wprowadzić próbkę do górnej komory płynu. Upewnij się, że prąd linii bazowej mieści się w zakresie 3% prądu bazowego obserwowanego podczas pomiaru cząstek kalibracyjnych. Jeśli nie mieści się w granicach 3%, zastosuj strategię opisaną poniżej, aby ustabilizować prąd bazowy. Zastosuj dokładnie takie ciśnienie, jakie zastosowano do cząstek kalibracyjnych i zapisz pliki próbki.
Uwaga: Wykres szybkości cząstek powinien pokazywać stałe wykrywanie cząstek (rysunek 2a). W przypadku nagłego przerwania wykrywania cząstek, nagłego spadku prądu podstawowego lub nagłego wzrostu szumu RMS, pory mogą zostać zatkane; W ten sposób wstrzymaj nagrywanie. Aby przywrócić linię bazową, dotknij lub przekręć nasadkę ekranującą, nałóż tłok lub całkowicie usuń nanopory, umyj je wodą dejonizowaną i umieść na instrumencie.
Uwaga: Alternatywnie, zwiększ rozciągliwość nanoporów do 47 mm w połączeniu z maksymalnym naciskiem ze strony VPM przez około 5 minut.
1.4 Analiza danych
- Kliknij zakładkę "Analizuj dane", aby przejść do sekcji analizy w oprogramowaniu. Przetwarzaj pliki kalibracyjne i przykładowe, klikając prawym przyciskiem myszy "Nieprzetworzone pliki" i wybierając "Przetwarzaj pliki".
- Kliknij pole wyboru obok próbki w kolumnie "Skalibrowane", aby powiązać przykładowe pliki z nagraniami kalibracyjnymi. Wybierz odpowiednią próbkę i kalibrację files i kliknij "OK". Uwaga: w przypadku korzystania z opcji kalibracji wielociśnieniowej wybierz zakładkę "Kalibracja wielociśnieniowa" po lewej stronie, aby połączyć wiele próbek z wieloma plikami kalibracyjnymi.
- Po pomyślnym sprzężeniu, oprogramowanie Izon Control Suite będzie wyświetlać różne charakterystyki próbki, takie jak rozkład wielkości (rysunek 2b), czas trwania linii bazowej, połowa maksimum pełnej szerokości (FWHM) i analiza stężenia. Opcjonalnie: Dla każdej próbki poszczególne punkty danych można wyeksportować jako plik rozdzielany przecinkami.
2. Alternatywny protokół – Próbkowanie próbek za pomocą koralików kalibracyjnych
Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, standardowa procedura operacyjna może być stosowana podczas pracy z izolowanymi pojazdami elektrycznymi. Podczas pracy z nieizolowanymi EV w próbkach biologicznych lub izolowanymi preparatami EV zanieczyszczonymi dużymi agregatami białkowymi, obsługa urządzenia może być wyzwaniem. Wyzwania te polegają głównie na wysokim wskaźniku blokowania nanoporów (nagły spadek prądu podstawowego), niemożności odzyskania prądów podstawowych w ciągu 3% pomiaru kalibracyjnego lub znacznych różnicach w szybkości cząstek między identycznymi próbkami (rysunek 3a). Dla próbek, które wykazywały te trudności, opracowano alternatywny protokół ilościowego oznaczania EV17 . Metodologia ta polega na wprowadzeniu większych kulek kalibracyjnych z polistyrenu do próbki będącej przedmiotem zainteresowania (rysunek 3b). Szczegółowa procedura dla tego alternatywnego protokołu została omówiona poniżej.
2.1. Przygotowanie próbki
Uwaga: Podczas przygotowywania próbek metodą alternatywną pożądane jest ustalenie stosunku EV do ściegu wynoszącego około 1. Konieczne jest również dołączenie próbki "tylko kulki kalibracyjnej", aby umożliwić dokładne "bramkowanie" kulek kalibracyjnych i określenie liczby cząstek tła (na przykład agregatów białkowych) obecnych w buforze.
- Odwirować 100 μl supernatantu do hodowli komórkowych przez 7 minut przy 300 x g
- Dodać 20 μl supernatantu do 20 μl PBS i 10 μl 75-krotnie rozcieńczonych kulek polistyrenowych o długości fali 335 nm (zapas 7e10/ml).
2.2. Pomiar próbki
- Należy zastosować strategię opisaną w sekcji 1.2 w celu określenia optymalnych ustawień urządzenia.
- Najpierw zmierz próbkę "tylko koralik kalibracyjny". Upewnij się, że wykrywanie tła małych cząstek niebędących kulkami jest jak najniższe (<10% kulek).
- Zmierz każdą pojedynczą próbkę raz przed zarejestrowaniem kontrprób w celu równomiernego rozłożenia fluktuacji w warunkach nanoporowych na różne próbki. Zmierzyć co najmniej 3 powtórzenia każdej próbki.
- Ponownie zmierzyć próbkę "tylko koralik kalibracyjny" po zakończeniu rejestrowania wszystkich próbek.
2.3. Analiza danych
Uwaga: W przypadku korzystania z alternatywnego protokołu, do obliczenia stężenia nie wystarcza wyłącznie użycie oprogramowania Izon Control Suite. Wymagane jest dodatkowe oprogramowanie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. W tabeli 1 przedstawiono przykład obliczenia stężenia próbek przedstawionych na rysunku 3.
- Otwórz próbkę "tylko koralik kalibracyjny" i jeden lub więcej przykładowych plików.
- Określ, który rozmiar zdarzenia blokującego (w nA) może być użyty jako punkt odcięcia dla rozróżnienia między EV a kulkami polistyrenowymi. Wyznaczanie wartości blokady (nA) odpowiadającej lewej podstawie populacji kulek styropianu (rys. 3b). Uwaga: upewnij się, że rozmiary pojemników wszystkich pomiarów są równe (można je dostosować w "ViewSettings", do którego można uzyskać dostęp, klikając przycisk "pop-up" poniżej "Indywidualny ślad blokady").
- Wartości całkowitej liczby cząstek dla każdej próbki można uzyskać, klikając zakładkę "Podsumowanie analizy cząstek" w próbce.
- Przefiltruj zestawy danych przy użyciu poziomu odcięcia określonego w kroku 2.3.2, wybierając wyskakujące okienko "Filtrowanie danych". Wyświetlaj tylko cząstki mniejsze niż wartość odcięcia.
- Pobierz wartości liczby EV dla każdej próbki z "Podsumowania analizy cząstek".
- Odejmij ilość EV od całkowitej liczby cząstek, aby określić ilość kulek kalibracyjnych.
- Określ stosunek EV do ściegu, dzieląc liczbę EV przez liczbę ściegów kalibracyjnych.
- Określić średni stosunek tła, uśredniając proporcje wyznaczone dla każdej próbki kalibracyjnej "tylko ścieg". Odejmij tę wartość od każdej pojedynczej próbki.
- Pomnóż skorygowany stosunek EV do kulki przez stężenie kulek kalibracyjnych, aby określić stężenie EV dla każdej próbki.
- Pomnożyć stężenie stwierdzone w kroku 2.3.9 przez współczynnik rozcieńczenia EV wprowadzony przez dodanie kulek kalibracyjnych do próbki EV. Uwaga: W przykładowej konfiguracji próbki całkowite rozcieńczenie próbki w PBS i kulkach kalibracyjnych wynosi 2,5 raza, a zatem stężenie stwierdzone w kroku 2.3.9 należy pomnożyć przez 2,5 w celu określenia stężenia surowej próbki EV.
- Obliczanie danych statystycznych, takich jak średnie, odchylenie standardowe i błąd standardowy średniej dla każdej grupy powtórzeń.
Uwaga: w niektórych przypadkach obserwuje się nakładanie się EV i kolczastych kulek polistyrenowych. Jeżeli wymagana jest korekta ze względu na niedoszacowanie stężenia EV, należy również zmierzyć próbki bez kulek polistyrenowych z kolcami. Użyj tego samego punktu odcięcia, jak określono w kroku 2.3.2, aby określić stosunek "ściegu do EV", aby obliczyć stosunek EV, które mieszczą się w zakresie kolczastych kulek polistyrenowych. Ten stosunek stopki do EV należy dodać do stosunku EV do stopki określonego w kroku 2.3.8.
2.4. Opcjonalnie: rozkład wielkości EV przy użyciu metody alternatywnej.
- Otwórz próbkę nagrania dwukrotnie w oprogramowaniu Control Suite.
- Ustaw opcje filtrowania jednej z próbek tak, aby wyświetlały tylko cząstki większe niż wartość odcięcia określona powyżej. Spowoduje to wyświetlenie tylko cząstek kalibracyjnych.
- Ustaw przefiltrowaną próbkę na "plik kalibracyjny" i wprowadź rozmiar trybu koralików kalibracyjnych.
- Połącz przykładowy plik z "plikiem kalibracyjnym" utworzonym w kroku 2.4.3, jak opisano w 1.4.2. Przykładowy plik będzie teraz wyświetlał rozkład rozmiarów zarówno EV, jak i koralików kalibracyjnych w oparciu o koraliki kalibracyjne z kolcami.
Uwaga: Standardowy protokół operacyjny najczęściej wystarcza do określenia rozkładu wielkości pojazdów elektrycznych. Zdarza się jednak, że dokładne składniki bufora nie są znane (na przykład w osoczu lub moczu), co uniemożliwia przygotowanie próbki kulek kalibracyjnych w tym samym buforze, co interesujące nas EV. Próbka EV wzbogacona cząstkami kalibracyjnymi może być wykorzystana do oszacowania wielkości EV w tych specyficznych warunkach.
Wyniki
Aby użyć instrumentu tRPS, na 4 ramionach urządzenia należy umieścić nieprzewodzący nanopor (Rysunek 1a) i przyłożyć napięcie (Rysunek 1b). Po ustaleniu linii bazowej prądu elektrycznego, impulsy rezystancyjne wywołane przez cząsteczki przechodzące przez por będą wykrywane, jak zilustrowano na Rysunku 1c.
EVs zostały oczyszczone z supernatantu hodowli komórkowej linii komórek glejaka U87-MG/EGFRvIII za pomocą ultrawirowania. Po pomiarze wyizolowanych EVs (Ryc. 2a) na nanoporze NP100 zaobserwowano stabilny wykres częstotliwości cząsteczek (rate-plot). Stabilny wykres ten jest niezbędny do wiarygodnego pomiaru stężenia EVs. Po sparowaniu zapisu próbki EVs z zapisem kalibracyjnych kulek polistyrenowych o rozmiarze 115 nm, można uzyskać rozkład wielkości (Ryc. 2b) oraz oszacowanie stężenia próbki EVs (dane nie zostały przedstawione).
EVs poddano również bezpośredniemu ilościowemu oznaczeniu w supernatancie z hodowli komórek glejaka. Podczas pomiaru EVs w próbkach biologicznych zatykanie nanoporów często prowadzi do przerw i/lub wahań na wykresach szybkości przepływu cząstek (Figrue 3a). Skutkuje to niedokładnymi szacunkami stężenia EVs. Poprzez dodanie do próbki kulek polistyrenowych o znanej wielkości i stężeniu można określić stosunek EVs do kulek. Figure 3b przedstawia wyniki uzyskane po dodaniu do supernatantu z hodowli komórkowej kulek polistyrenowych o rozmiarze 335 nm. Obserwuje się dwie wyraźne populacje. Cząstki wywołujące blokadę mniejszą niż 0,46 nA uznano za EVs, natomiast większe cząstki za kulki polistyrenowe. Stosunek EVs do kulek polistyrenowych wykorzystuje się do obliczenia surowego stężenia EVs (Table 1). Figure 3c ilustruje szacowanie rozmiaru obu populacji w oparciu o dodane kulki polistyrenowe. Zastosowany układ nanoporów pozwolił na detekcję EVs o rozmiarze >140 nm. Wartość tę można obniżyć poprzez zmniejszenie otworu nanoporu, co jednak doprowadzi do częstszych przypadków zatykania.
Rycina 1: Instrument qNano i zasada działania. (A) Zdjęcie instrumentu. Nanopora jest umieszczona w urządzeniu, oddzielając dolną komorkę z cieczą od górnej komorki z cieczą. Komorki z cieczą są chronione przed zewnętrznymi zakłóceniami elektrycznymi przez osłonę ekranującą. (B) Ilustracja przedstawiająca regulowaną detekcję impulsów rezystancyjnych (tRPS). Nieprzewodząca, elastyczna nanopora oddziela dwie komorki z cieczą. Poprzez przyłożenie napięcia w porze wykonanej w nanoporze ustalany jest prąd elektryczny. Gdy pęcherzyki zewnątrzkomórkowe przemieszczają się przez nanoporę, przepływ jonowy ulega zmianie, co jest wykrywane jako impuls rezystancyjny. W tRPS rozmiar otworu nanopory można regulować (zmniejszać lub zwiększać) poprzez rozciąganie nanopory za pomocą zwiększania odległości między przeciwległymi ramionami instrumentu lub zmniejszania tej odległości. (C) Ilustracyjny przykład impulsów rezystancyjnych. Amplituda pojedynczego impulsu rezystancyjnego jest proporcjonalna do objętości cząstki: większe impulsy wskazują na większe cząstki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Wykres liczby cząsteczek i rozkładu wielkości uzyskane z pomiaru wyizolowanych EV z supernatantu hodowli komórek U87-MG/EGFRvIII. (A) Wykres liczby cząsteczek wskazujący na ogólną stałość detekcji cząsteczek. Krótki spadek detekcji cząsteczek zaobserwowano między 80 a 100 s rejestracji. Po wstrzymaniu rejestracji i stuknięciu w osłonę ochronną szybkość detekcji cząsteczek ustabilizowała się, po czym wznowiono rejestrację. (B) Rozkład wielkości wyizolowanych EV przedstawiono po skalibrowaniu nieznanej próbki (EV) względem kulek kalibracyjnych z polistyrenu o średnicy 115 nm. (Interwał 5 nm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Ilościowe oznaczanie EVs w supernatancie z hodowli komórkowej metodą tRPS z zastosowaniem alternatywnego protokołu. (A) Typowe wykresy szybkości przepływu cząstek uzyskane podczas pomiaru EVs bezpośrednio w płynie biologicznym. Zapychanie się porów powoduje krótkie przerwy i wahania w szybkości detekcji cząstek. Każdy wykres przedstawia pomiar powtórzony tej samej próbki. (B) Trzy powtórne wykresy rozkładu wielkości uzyskane po dodaniu do supernatantu z hodowli komórkowej kalibracyjnych kulek polistyrenowych o rozmiarze 335 nm. Wszystkie cząstki wywołujące impuls rezystancyjny mniejszy niż 0,46 nA zostały zaklasyfikowane jako EVs. (C) Dodane kulki polistyrenowe mogą służyć do wyznaczenia rozkładu wielkości w próbce (rozmiar przedziału 5 nm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Pomiar | Kalibracja tylko #1 | Kalibracja tylko nr 2 | Nadkład #1 | supernatnat nr 2 | supernatnat nr 3 |
| Prąd średni (nA) | 117 | 120 | 116 | 118 | 120 |
| Szybkość uwalniania cząsteczek | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| zastosowana wartość progowa (nA) | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| Całkowita liczba cząstek | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| Kuleczki kalibracyjne z dodatkiem wzorca | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| EVs/koraliki kalibracyjne | 0.01 | 0.003 | 0.772 | 0.788 | 0.884 |
| Próbka – wprowadzenie | 0.765 | 0.781 | 0.877 | ||
| Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (107)/ml | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| Próbka rozcieńczona 2,5-krotnie | |||||
| Surowe stężenie EV (107)/ml | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
Tabela 1: Przykładowe obliczenie stężenia EV z zastosowaniem alternatywnego protokołu. Wyznaczana jest wartość odcięcia (cut-off), aby odróżnić EV od kuleczek kalibracyjnych. Następnie można określić całkowitą liczbę EV oraz kuleczek. Dla każdego pomiaru oblicza się stosunek EV do kuleczek. Ilość cząstek tła w elektrolicie (na przykład agregatów białek) oblicza się poprzez wyciągnięcie średniej ze stosunku EV do kuleczek dla poszczególnych pomiarów próbki zawierającej „wyłącznie kuleczki kalibracyjne”. Dla każdej próbki od otrzymanego stosunku odejmuje się stosunek tła. Ten skorygowany stosunek mnoży się przez stężenie kuleczek kalibracyjnych w próbce (w tym przykładzie: 9.33e7/ml). Aby wyznaczyć surowe stężenie EV, otrzymane stężenie mnoży się przez całkowity czynnik rozcieńczenia EV (w tym przykładzie: 2.5).
Dyskusja
Protokoły opisane w tym manuskrypcie oferują metodologie kwantyfikacji i charakterystyki wielkości EV za pomocą tRPS. Głównymi zaletami platformy tRPS są mała wielkość próby, stosunkowo krótki czas trwania pomiaru oraz brak konieczności manipulowania próbką.
Warunkiem dokładnego pomiaru tRPS jest zachowanie identycznych warunków między kalibracją a pomiarami próbki. Obejmuje to użycie identycznych, a także identycznych ustawień urządzenia, takich jak rozmiar nanoporów, napięcie i przyłożone ciśnienie. Oryginalny VPM nie ma mechanizmu dokładnego ustawiania przyłożonego ciśnienia, co powoduje niewielkie różnice w przyłożonym ciśnieniu między próbkami. Ponadto parowanie płynu zalewającego w VPM może powodować niewielkie różnice ciśnienia podczas pomiaru w różnych punktach czasowych, dlatego VPM należy często ponownie zalewać. Ograniczenia te zostały potencjalnie rozwiązane przez wprowadzenie VPM2, który ma skalowanie oparte na kliknięciach i jest oparty na ciśnieniu powietrza.
Alternatywny protokół opisany w tym manuskrypcie jest szczególnie przydatny do pomiaru EV w nieoczyszczonych próbkach biologicznych17. Uważamy, że składniki buforowe, takie jak cukry, lipidy, białka i inne większe zanieczyszczenia, mogą w niektórych przypadkach wpływać na warunki pomiaru zbyt mocno, aby można było zastosować standardowy protokół. Dodanie kulek kalibracyjnych do próbki zamiast porównywania dwóch oddzielnych pomiarów wprowadza "kalibrację w czasie rzeczywistym". Metoda ta jest szczególnie przydatna przy porównywaniu próbek (np. osocza krwi różnych dawców), które mają różną i/lub nieznaną zawartość tła płynnego. Chociaż istnieją różnice między EV a cząstkami polistyrenu (np . gęstość cząstek i ładunek powierzchniowy), modele teoretyczne, jak również dane eksperymentalne podkreślają przydatność kulek polistyrenowych do kwantyfikacji i profilowania wielkości EV, pod warunkiem że stosuje się znaczny nacisk15,19. Aby zminimalizować wpływ sił elektrokinetycznych, zaleca się stosowanie stosunkowo większych nanoporów NP150/NP200 i znacznego nadciśnienia.
EV i koraliki kalibracyjne różnią się rozmiarem. W związku z tym nanopory muszą zostać otwarte poprzez rozciągnięcie do średnicy, w której obserwuje się wykrywanie zarówno EV, jak i większych cząstek kalibracyjnych. Ponieważ otwarcie porów zmniejszy czułość na mniejsze cząstki, rejestrowane są tylko EV większe niż określony rozmiar (często EV >120 nm przy użyciu koralika kalibracyjnego 335 nm). Minimalna granica wykrywalności dla pojazdów elektrycznych może zostać zmniejszona do około 90 nm, przy użyciu kulek kalibracyjnych 203 nm na nanoporze NP150. Jednak taka konfiguracja może być nieopłacalna, gdy większe pojazdy elektryczne powodują częste zatykanie nanoporów. Obecność tych przeszkadzających pojazdów elektrycznych może wymusić wykorzystanie konfiguracji, w której populacja pojazdów elektrycznych, zbyt mała, aby osiągnąć próg wykrywalności, nie zostanie wykryta.
Trudność w obsłudze systemu wzrasta przy próbie pomiaru cząstek o wielkości mniejszej niż 100 nm. W takich przypadkach wykrywalność można poprawić poprzez zwiększenie stężenia soli w elektrolicie. Zwiększone stężenie jonów wywoła stosunkowo zwiększoną wielkość blokady dla małych cząstek (większy stosunek sygnału do szumu). Przydatność tej techniki do pomiarów pojazdów elektrycznych musi jednak zostać zweryfikowana, ponieważ zwiększone stężenie soli może wpływać na objętość pojazdów elektrycznych.
Podsumowując, platforma tRPS może być wykorzystywana do bezpośredniej kwantyfikacji i charakterystyki wielkości pojazdów elektrycznych. Ponieważ nie jest wymagana izolacja ani manipulacja EV (wiązanie przeciwciał lub znakowanie fluorescencyjne), platforma nadaje się do bezpośredniego oznaczania ilościowego EV w płynach biologicznych. Zapewniony jest alternatywny protokół, który może być korzystny w przypadku próbek, w których składniki buforowe wywołują znaczne zdarzenia zatkania porów, co sprawia, że niezawodne wykorzystanie standardowego protokołu jest nieopłacalne.
Oświadczenia
Opracowanie zarysowanego protokołu i napisanie tego manuskryptu było częściowo wspierane finansowo przez Holenderską Fundację Mózgu, Fundację Schumachera Kramera i Fundusz Bohnenna. Produkcja tego wideo-artykułu była częściowo sponsorowana przez Izon.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Moduł zmiennego ciśnienia | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Wybór nanoporów różni się w zależności od cząstki docelowej. Dla różnych rozmiarów docelowych dostępne są różne nanopory. |
| Cząstki kalibracyjne | Izon Science Sp. z o.o. | Cząstki kalibracyjne CPC100, CPC200, CPC400 | są dostępne w różnych rozmiarach. |
| Kąpiel sonikacyjna | Wiele dostępnych | Wystarczy podstawowa kąpiel sonikacyjna | |
| (Mini) wirówka | Wiele dostępnych | ||
| tkanek bez podnoszenia | Wiele dostępnych | ||
| soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) | Wiele dostępnych | ||
| komputerów | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Nauka Sp. z o.o. | Nie dotyczy Oprogramowanie do arkuszy | |
| kalkulacyjnych | Wiele dostępnych | Nie dotyczy |
Bibliografia
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery. 12, 347-357 (2013).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9, 871-881 (2008).
- Bobrie, A., et al. Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression. Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine. 18, 883-891 (2012).
- Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).
- Dommelen, S. M., et al. Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).
- Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).
- Kozak, D., et al. Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS. 6, 6990-6997 (2012).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosensor. 31, 17-25 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions. Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).
- Vrij, J., et al. Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing. Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (3037), (2012).
- Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing. Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie