Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

19 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

W tym artykule

Podsumowanie

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia >250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Możliwość monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej i projektowania immunoterapii. Tutaj opisujemy zastosowanie technologii fluorescencyjnej macierzy docelowej (FTA), która wykorzystuje niezbędne barwniki, takie jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), fioletowe barwniki pobudliwe laserem (CellTrace Violet: CTV) i barwniki pobudliwe czerwonym laserem (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) do kombinatoryjnego znakowania mysich limfocytów w >250 rozpoznawalnych klastrach komórek fluorescencyjnych. Klastry komórkowe w tych FTA mogą być pulsowane peptydami wiążącymi główną zgodność tkankową (MHC) klasy I i MHC klasy II, a tym samym działać jako komórki docelowe odpowiednio dla limfocytów T CD8 + i CD4 +. Te komórki FTA pozostają żywotne i w pełni funkcjonalne, a zatem mogą być podawane myszom, aby umożliwić ocenę zabijania komórek docelowych FTA za pośrednictwem limfocytów T CD8 + i pomocy komórek docelowych komórek B komórek B FTA za pośrednictwem limfocytów T CD4 + w czasie rzeczywistym in vivo za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ >250 komórek docelowych może być ocenianych jednocześnie, technika ta umożliwia monitorowanie odpowiedzi limfocytów T na kilka epitopów antygenowych w kilku stężeniach i w wielu powtórzeniach. W związku z tym technika ta może mierzyć odpowiedzi limfocytów T zarówno na poziomie ilościowym (np. skumulowana wielkość odpowiedzi), jak i jakościowym (np. awidność funkcjonalna i reaktywność krzyżowa epitopów odpowiedzi). W tym artykule opisujemy, w jaki sposób zbudowane są te FTA i podajemy przykład, w jaki sposób można je zastosować do oceny odpowiedzi limfocytów T indukowanych przez rekombinowaną szczepionkę przeciwko wirusowi ospy.

Wprowadzenie

Limfocyty T odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i często są celem manipulacji w immunoterapii. Limfocyty T efektorowe CD4 + reagują na obcy antygen, wydzielając cytokiny, które regulują wiele aspektów odporności, a także mogą bezpośrednio pomagać limfocytom B w wytwarzaniu przeciwciał. Ctotoksyczne limfocyty T CD8 + (CTL) mogą również reagować na obcy antygen poprzez wydzielanie cytokin, a także odgrywać kluczową rolę w bezpośrednim zabijaniu komórek wyrażających obcy antygen. Podstawowa interakcja, która inicjuje te funkcje efektorowe limfocytów T, obejmuje interakcję receptora limfocytów T (TCR) z obcymi peptydami wyświetlanymi na cząsteczkach MHC na powierzchni komórek. Limfocyty T CD4 + rozpoznają peptydy wyświetlane na cząsteczkach MHC klasy II na komórkach prezentujących antygen, a limfocyty T CD8 + rozpoznają peptydy wyświetlane na cząsteczkach MHC klasy I, które są zwykle wyświetlane na komórkach zakażonych drobnoustrojami.

Aby ocenić rolę limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej, konieczne jest, aby ich funkcje efektorowe były mierzone za pomocą wiarygodnych i czułych technik. Typowe metody oceny odpowiedzi limfocytów T obejmują; Reaktywność tetrameru MHC klasy I/II/peptydu; wytwarzanie cytokin metodą ELISPOT i barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych; i zdolność zabijania za pomocą 51testów uwalniania Cr. Testy te są jednak zwykle wykonywane ex vivo ze stymulacją in vitro lub zapewniają ograniczony wgląd w funkcję komórek T. Idealnie, przy pomiarze odpowiedzi limfocytów T korzystne byłoby ich ocenianie in situ, in vivo w momencie ich wystąpienia, bez manipulacji limfocytami T, aby uniknąć zmian parametrów funkcjonalnych, które mogą wystąpić w wyniku stymulacji in vitro. Niektóre z najczęściej stosowanych testów funkcjonalnych limfocytów T in vivo opierają się na pomiarze zabijania komórek docelowych za pośrednictwem CTL pulsacyjnie peptydami wiążącymi MHC klasy I, które są zliczane in vivo poprzez ich wykrywanie poprzez znakowanie fluorescencyjne za pomocą ważnych barwników, takich jak CFSE. Chociaż tego typu testy mogą monitorować zabijanie celów za pośrednictwem CTL, gdy dzieje się to in vivo, wcześniej miały stosunkowo ograniczoną zdolność do oceny zabijania wielu celów o różnych stężeniach i różnych typach epitopów peptydowych, co jest wymagane, aby umożliwić ocenę parametrów jakościowych, takich jak awidność funkcjonalna i reaktywność krzyżowa wariantu epitopu. Testy te również nie dostarczają żadnych informacji na temat odpowiedzi za pośrednictwem limfocytów T CD4 +.

Aby przezwyciężyć wiele ograniczeń obecnych metod stosowanych do oceny odpowiedzi limfocytów T, niedawno opracowaliśmy test multipleksowy oparty na fluorescencyjnych matrycach docelowych (FTA), który pozwala na monitorowanie odpowiedzi limfocytów T na >250 komórek docelowych jednocześnie u jednego zwierzęcia za pomocą cytometrii przepływowej >1,2. FTA składają się z limfocytów znakowanych kilkoma stężeniami i kombinacjami ważnych barwników, takich jak CFSE, CTV i CPD, co pozwala na wygenerowanie >250 klastrów komórek o unikalnej fluorescencji. Ponieważ komórki te pozostają żywotne i w pełni funkcjonalne, można je wstrzykiwać zwierzętom, aby umożliwić monitorowanie ich interakcji z efektorowymi limfocytami T in vivo3. Na przykład klastry komórek FTA mogą być pulsowane peptydami wiążącymi MHC klasy I, aby umożliwić ocenę zabijania komórek docelowych za pośrednictwem CTL specyficznego dla antygenu1. Ponadto klastry komórek FTA mogą być również pulsowane peptydami wiążącymi MHC klasy II, co pozwala na ocenę aktywności komórek pomocniczych T specyficznych dla antygenu (TH) poprzez ocenę aktywacji (poprzez ocenę markerów aktywacji, takich jak CD69, CD44 i / lub CD62L) komórek B w FTA zawierających pokrewny peptyd2. Ponieważ jednocześnie można wykryć ponad 250 celów, możliwe jest zmierzenie odpowiedzi CTL iT H na wiele docelowych klastrów komórek pulsujących licznymi peptydami o różnych stężeniach i włączeniu wielu powtórzeń. Test FTA zapewnia zatem bezprecedensowy poziom oceny odpowiedzi efektorowej limfocytów T in vivo.

Tutaj szczegółowo opisujemy konstrukcję FTA i pokazujemy, jak można je zastosować do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo. Procedura opisuje konstrukcję FTA składającej się z 252 dostrzegalnych klastrów komórkowych przy użyciu trzech ważnych barwników, składających się z 6 powtórzeń 42 klastrów komórkowych pulsowanych peptydami wiążącymi MHC klasy I i II. Oznakowanie 42 klastrów komórek odbywa się w probówkach o pojemności 10 ml ze stożkowym dnem i pomocne jest ułożenie ich w stojaku na probówki, jak pokazano w tabeli 1. Metodę tę można dostosować do mniejszej liczby dostrzegalnych klastrów zgodnie z wymaganiami, zmniejszając ilość etykietowania każdego wykonanego barwnika1.

Podkreślamy użyteczność testu, pokazując, jak może on mierzyć reakcje generowane przez szczepienie rekombinowanym wirusem ospy przeciwko wielu epitopom w małej kohorcie myszy. Pokazuje to, w jaki sposób test FTA może być wykorzystany do pomiaru skumulowanych odpowiedzi i awidności funkcjonalnej poprzez, odpowiednio, zastosowanie ocen pola pod krzywą (AUC) i pomiar efektywnego stężenia peptydu wymaganego do wygenerowania odpowiedzi połowicznych maksymalnych (EC50).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Myszy wykorzystane w tym protokole były traktowane zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Australijskiego Uniwersytetu Narodowego, a ich eutanazja została przeprowadzona poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.

1. Przygotowanie barwnika i peptydów

  1. Przygotowanie barwników
    Uwaga: Barwniki są rozcieńczane do różnych stężeń, aby umożliwić znakowanie komórek z określonymi intensywnościami fluorescencji. CFSE stosuje się w siedmiu stężeniach przygotowanych poprzez 3,5-krotne rozcieńczenia szeregowe, a CTV i CPD w sześciu różnych stężeniach przygotowanych poprzez 3,7-krotne rozcieńczenia szeregowe (patrz Tabele 2-4). Stężenia zapasowe barwników wymienione w Tabelach 2-4 zostaną użyte do znakowania komórek docelowych w końcowych stężeniach barwników wymienionych w Tabelach 2-4. Barwniki reagują w kontakcie z roztworami wodnymi. Ważne jest zatem, aby fiolki osiągnęły temperaturę RT przed otwarciem, aby zminimalizować narażenie barwników na kondensację.
    1. CFSE
      Uwaga: CFSE jest nabywany jako ester sukcynimidyloestru diacetatu karboksyfluoresceiny (CFDA, SE; MW 557,47), zazwyczaj w ilości 25 mg/fiolka.
      1. Resuspender 25 mg CFSE w 4,48 ml DMSO, aby otrzymać 10 mM roztwór zapasowy.
      2. Przygotować rozcieńczenia szeregowe CFSE: dodać 35 μl zapasu 10 mM CFSE do 87,5 μl DMSO i powtórzyć tę czynność z rozcieńczonym roztworem zapasowym, aby uzyskać każde stężenie barwnika podane w Tabeli 3.
    2. CTV
      Uwaga: CTV jest zazwyczaj nabywany w opakowaniach po 9 fiolek, z których każdą można zrekonstytuować w 10 μl DMSO, aby otrzymać 10 mM roztwór barwnika.
      1. Zrekonstytuować i połączyć wszystkie 9 fiolek CTV z 90 μl DMSO, aby otrzymać roztwór 10 mM.
      2. Przygotować rozcieńczenia szeregowe CTV: dodać 11 μl zapasu 10 mM CTV do 29,7 μl DMSO i powtórzyć tę czynność z rozcieńczonym roztworem zapasowym, aby uzyskać każde stężenie barwnika podane w Tabeli 2.
    3. CPD
      Uwaga: CPD (MW 792,6) jest zazwyczaj nabywany w ilości 0,5 mg/fiolka.
      1. Resuspender 0,5 mg CPD w 63 ml DMSO, aby uzyskać roztwór 10 mM.
      2. Przygotować rozcieńczenia szeregowe CPD: dodać 11 μl zapasu 10 mM CPD do 29,7 μl DMSO i powtórzyć tę czynność z rozcieńczonym roztworem zapasowym, aby uzyskać każde stężenie barwnika podane w Tabeli 4.
        Uwaga: Zapasy barwników można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy; mogą być one rozmrażane i zamrażane ponownie kilka razy bez istotnej utraty funkcjonalności.
  2. Przygotowanie peptydów
    Uwaga: Peptydy wiążące się z MHC klasy I są zazwyczaj używane do pulsowania komórek docelowych w 6 różnych stężeniach przygotowanych poprzez 10-krotne rozcieńczenia od stężenia początkowego 1 μM (Tabela 5). Peptydy wiążące się z MHC klasy II są zazwyczaj używane do pulsowania komórek docelowych w 6 różnych stężeniach przygotowanych poprzez 3-krotne rozcieńczenia od stężenia początkowego 400 μM (Tabela 5). Każdy peptyd jest przygotowywany w 2-krotnym stężeniu końcowym w PBS, tak aby każde stężenie peptydu miało objętość co najmniej 250 μl. Zapasy peptydów mogą być przygotowane przed konstrukcją FTA i przechowywane w temperaturze -20 °C bez istotnej utraty funkcjonalności.
    1. Przygotowanie zapasów peptydów wiążących się z MHC klasy I
    2. Przygotować najwyższe stężenie każdego epitopu peptydu jako 2 μM roztwór zapasowy (2x 1 μM)
    3. Przygotować rozcieńczenia szeregowe peptydów wiążących się z MHC klasy I: dodać 44,4 μl 2 μM roztworu zapasowego peptydu do 400 μl PBS. Powtórzyć tę czynność z rozcieńczonym roztworem zapasowym, aby uzyskać każde stężenie peptydu podane w Tabeli 5.
    4. Przygotowanie zapasów peptydów wiążących się z MHC klasy II
    5. Przygotować najwyższe stężenie każdego epitopu peptydu jako 800 μM roztwór zapasowy (2x 400 μM).
    6. Przygotować rozcieńczenia szeregowe peptydów wiążących się z MHC klasy II: dodać 150 μl 800 μM roztworu peptydu do 300 μl PBS. Powtórzyć tę czynność z rozcieńczonym roztworem zapasowym, aby uzyskać każde stężenie peptydu podane w Tabeli 5.

2. Przygotowanie FTA

Uwaga: Poniższa procedura opisuje konstrukcję FTA składającego się z komórek impulsowo stymulowanych 7 różnymi epitopami peptydowymi w 6 różnych stężeniach (t.j. 42 klastry komórkowe) powtórzonych 6 razy, aby uzyskać 252 rozróżnialne klastry komórkowe. W każdym powtórzeniu włączono jako kontrolę klaster komórkowy niestymulowany żadnym epitopem (Nil). W przypadku FTA korzystne jest występowanie różnicy w allotypie CD45 względem zwierząt gospodarzy, co pozwala na ich odróżnienie od komórek biorcy za pomocą znakowania przeciwciałami w czasie analizy. W przeciwnym razie do tego celu FTA można znakować innymi barwnikami, takimi jak PKH-26 (opisano w kroku 2.6). Zazwyczaj procedura przygotowania FTA jest przeprowadzana od początku do końca podczas jednej sesji.

  1. Oznaczyć 42 plastikowe probówki o objętości 10 ml z okrągłym dnem w numerach 1-42 (na przykład zgodnie z Table 1).
  2. Przygotowanie komórek
    1. Wyizolować śledzionę i/lub węzły chłonne z myszy. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z tkanek, przeciskając je przez sito o oczkach 70 μm za pomocą tłoka strzykawki 5 ml, a następnie policzyć komórki przy użyciu hemocytometru.
    2. Resuspendować limfocyty w stężeniu do 200 x 106 komórek/ml w 11,5 ml pożywki Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI lub równoważnej) zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Uwaga: Ważne jest użycie buforu o wysokiej zawartości amin w celu zminimalizowania toksyczności barwnika dla komórek3.
  3. Oznaczanie CTV
    Uwaga: Komórki są początkowo oznaczane sześcioma stężeniami CTV.
    1. Dokładnie resuspendować komórki, odwracając probówkę kilka razy. Przenieść 1,9 ml zawiesiny komórkowej do 6 probówek 10 ml oznaczonych numerami 37-42, dbając o to, aby nie zamoczyć górnej połowy probówek.
    2. Aby oznaczyć komórki barwnikiem CTV, zdjąć zakrętkę probówki i ułożyć ją poziomo.
    3. Dodać 83 μl PBS do niezamoczonej części w górnej części probówki, a do tego dodać 17 μl roztworu zapasu CTV (patrz Table 2 w celu ustalenia, który roztwór zapasu jest przypisany do której probówki). Uwaga: Niezamoczenie górnej części probówki jest ważne, aby zapobiec ruchowi zawiesiny komórkowej i przedwczesnemu zmieszaniu roztworu komórek z roztworem barwnika.
    4. Zakręcić probówkę i szybko oraz dokładnie zmieszać zawiesinę komórkową z barwnikiem za pomocą vortexera.
    5. Powtórzyć kroki 2.3.2-2.3.4 dla roztworów zapasu CTV w wyznaczonych probówkach opisanych w Table 2.
    6. Inkubować komórki przez minimum 5 min w temperaturze pokojowej (20 °C).
  4. Oznaczanie CFSE
    1. Po oznaczeniu CTV dodać 5 ml RPMI zawierającej 5% FCS do każdej probówki i dokładnie resuspendować komórki za pomocą vortexera.
      1. Z probówki 37 przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówek 31, 25, 19, 13, 7 i 1.
      2. Z probówki 38 przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówek 32, 26, 20, 14, 8 i 2.
      3. Z probówki 39 przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówek 33, 27, 21, 15, 9 i 3.
      4. Z probówki 40 przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówek 34, 28, 22, 16, 10 i 4.
      5. Z probówki 41 przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówek 35, 29, 23, 17, 11 i 5.
      6. Z probówki 42 przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do probówek 36, 30, 24, 18, 12 i 6
        Uwaga: Należy uważać, aby nie zamoczyć górnej połowy probówek podczas wykonywania kroków 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Aby oznaczyć komórki CFSE, zdjąć zakrętkę probówki i ułożyć ją poziomo.
    3. Dodać 103 ml PBS do niezamoczonej części w górnej części probówki, a do tego dodać 7 ml roztworu zapasu CFSE (patrz Table 3 w celu ustalenia, który roztwór zapasu jest przypisany do której probówki).
    4. Zakręcić probówkę i szybko oraz dokładnie zmieszać zawiesinę komórkową z barwnikiem za pomocą vortexera.
    5. Wykonać kroki 2.4.2-2.4.4 dla roztworów zapasu CFSE w wyznaczonych probówkach opisanych w Table 3.
    6. Inkubować komórki przez minimum 5 min w temperaturze pokojowej (20 °C).
    7. Przemyć komórki: Rozcieńczyć zawiesinę komórkową 9 ml RPMI o temperaturze 20 °C zawierającej 5% FCS, odwirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C i usunąć nadlewki poprzez aspirację pipetą transferową.
  5. Pulsowanie peptydami i przemywanie komórek
    Uwaga: Po oznaczeniu komórek barwnikami CTV i CFSE, są one poddawane pulsowaniu peptydami wiążącymi się z MHC klasy I i/lub MHC klasy II (przygotowanymi w 1.2). Jedna z populacji komórkowych nie może być pulsowana peptydem (np. Nil w Table 1) i służyć jako kontrola negatywna do obliczeń odpowiedzi komórek T.
    1. Pulsowanie peptydami
      1. Resuspendować komórki w całkowitej objętości 250 μl RPMI zawierającej 5% FCS. Uwaga: Zazwyczaj po aspiracji nadlewki na końcu kroku 2.4.7 pozostaje 50 μl zawiesiny komórkowej, dlatego należy dodać 200 μl pożywki do osadu komórkowego.
      2. Dodać 250 μl wcześniej przygotowanych zapasów peptydów (zgodnie z Table 5) do odpowiednio wyznaczonych probówek (zgodnie z Table 1), pamiętając o dołączeniu probówki kontrolnej, do której dodano sam PBS bez peptydu, jako kontroli Nil.
      3. Zmieszać zawiesiny komórkowe za pomocą vortexera. Uwaga: Krytyczne jest, aby każdy epitop peptydowy i każde stężenie peptydu przypisano do jednej probówki i wyraźnie to odnotowano na podstawie oczekiwanej fluorescencji komórek w tej probówce, ponieważ sygnatura fluorescencyjna tej grupy zdefiniuje ten konkretny peptyd (na przykład zgodnie z Table 1).
      4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 h.
    2. Przemywanie komórek
      1. Dodać 5 ml schłodzonego (4 °C) RPMI zawierającego 5% FCS do zawiesiny komórkowej i resuspendować komórki, odwracając probówkę. Ostrożnie podłożyć pod zawiesinę komórkową 3 ml schłodzonego (4 °C) FCS.
      2. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Użyć powolnego przyspieszania i hamowania, aby zapewnić utrzymanie granicy między FCS a roztworem zawiesiny komórkowej.
      3. Ostrożnie odessać RPMI, a następnie FCS pipetą transferową, nie naruszając przemytych osadów komórkowych. Uwaga: Zastosowanie warstwy FCS pod zawiesiną podczas przemywania komórek pomaga usunąć jak najwięcej roztworu peptydu z komórek, ograniczając tym samym ekspozycję populacji komórkowych na wiele wolnych peptydów podczas łączenia komórek.
      4. Przemyć komórki ponownie: Resuspendować osady komórkowe w 10 ml RPMI o temperaturze 4 °C zawierającego 5% FCS. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odlać nadlewki.
      5. Połączyć wszystkie populacje komórkowe w jednej probówce za pomocą pipety, używając 6 ml RPMI o temperaturze 4 °C zawierającego 5% FCS. Odwirować połączone komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odessać nadlewkę pipetą transferową.
  6. Oznaczanie komórek CPD
    Uwaga: Na tym etapie można stworzyć sześć powtórzeń wewnątrzanalizy, oznaczając komórki pulsowane peptydami sześcioma różnymi stężeniami CPD.
    1. Dodać 11,4 ml RPMI o temperaturze 20 °C zawierającego 5% FCS do połączonego osadu komórkowego i dokładnie resuspendować za pomocą pipety.
    2. Dodać 1,9 ml zawiesiny komórkowej do 6 probówek 10 ml oznaczonych literami A-F, dbając o to, aby nie zamoczyć górnej połowy probówek.
    3. Aby oznaczyć komórki CPD, zdjąć zakrętkę probówki i ułożyć ją poziomo.
    4. Dodać 92 μl PBS do niezamoczonej części w górnej części probówki, a do tego dodać zapas CPD (patrz Table 4 w celu ustalenia ilości roztworu zapasu przypisanej do każdej probówki).
    5. Zakręcić probówkę i szybko oraz dokładnie zmieszać zawiesinę komórkową z barwnikiem za pomocą vortexera.
    6. Wykonać kroki 2.6.3-2.6.5 dla roztworów zapasu CPD w wyznaczonych probówkach opisanych w Table 4. Uwaga: W przeciwieństwie do CFSE i CTV, stężenie oznaczania CPD nie jest dokładnie liniowo powiązane z wynikową intensywnością fluorescencji oznaczonych komórek, dlatego stężenie oznaczania użyte do uzyskania równoodległych pików fluorescencyjnych kilku oznaczonych populacji zostało określone empirycznie (patrz Table 4).
    7. Inkubować komórki przez minimum 5 min w temperaturze pokojowej (20 °C).
    8. Przemyć komórki dwukrotnie: Resuspendować komórki do objętości 10 ml za pomocą RPMI o temperaturze 20 °C zawierającego 5% FCS. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C. Odessać nadlewkę pipetą transferową. Powtórzyć.
    9. Połączyć wszystkie komórki w jednej probówce za pomocą pipety, używając 8 ml RPMI o temperaturze 4 °C zawierającego 5% FCS. Odwirować połączone komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i odessać nadlewkę pipetą transferową.
  7. (Opcjonalnie) Oznaczanie komórek PKH-26
    Uwaga: Jeśli nie można stworzyć FTA z komórkami wykazującymi allotypową różnicę CD45 względem myszy gospodarza, można je oznaczyć PKH-26, aby umożliwić ich odróżnienie od komórek biorcy.
    1. Dodać 2,9 ml PBS o temperaturze 20 °C do połączonego osadu komórkowego i dokładnie resuspendować pipetą.
    2. Przenieść zawiesinę komórkową do niezamoczonej probówki 10 ml, dbając o to, aby nie zamoczyć górnej połowy probówki.
    3. Zdjąć zakrętkę probówki i ułożyć ją poziomo.
    4. Dodać 58 μl rozcieńczalnika C (z zestawu do barwienia PKH-26) do niezamoczonej części w górnej części probówki, a do tego dodać 42 μl 1 mM zapasu PKH-26.
    5. Zakręcić probówkę i dokładnie zmieszać roztwór komórek z barwnikiem za pomocą vortexera.
    6. Inkubować komórki przez minimum 10 min w temperaturze pokojowej (20 °C).
    7. Przemyć komórki dwukrotnie: Resuspendować komórki do objętości 10 ml za pomocą RPMI o temperaturze 20 °C zawierającego 5% FCS. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C. Odessać nadlewkę pipetą transferową. Powtórzyć.
  8. Wstrzykiwanie FTA do zwierząt gospodarzy
    Uwaga: Aby zmierzyć odpowiedzi komórek T in vivo, FTA są wstrzykiwane zwierzętom z aktywną odpowiedzią immunologiczną i pozostawiane in situ do 24 h. Krytyczne jest, aby FTA zostały również wstrzyknięte zwierzęciu naiwnemu jako kontrola negatywna.
    1. Policzyć i resuspendować komórki w stężeniu 2,5 x 108 komórek na ml w PBS. Wstrzyknąć dożylnie 200 μl komórek myszom gospodarzom, w tym zwierzęciu naiwnemu jako kontroli.

3. Cytometria przepływowa

  1. Od 18 do 24 godzin po wstrzyknięciu FTA pobierz krew lub śledzionę (lub inne interesujące tkanki) z myszy gospodarzy.
  2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanek poprzez rozcieranie za pomocą 70 μm przeciśnij przez sito za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
  3. Resuspendować komórki w stężeniu do 65 x 106 komórek/ml w PBS zawierającym 0,1% BSA.
  4. Odmierzyć 100 μl alikwoty zawiesiny komórkowej do studzienek płytki mikrotytrowej w celu znakowania przeciwciałami.
  5. Oznakuj komórki przeciwciałami znakowanymi fluorochromem oraz fluorescencyjnymi sondami żywotności o fluorescencji kompatybilnej spektralnie z CFSE, CTV i CPD. Uwaga: Przeciwciała przeciwko markerom komórek B, takim jak B220, oraz markerom aktywacji, takim jak CD69, są niezbędne do pomiaru aktywacji komórek B w przypadku użycia FTA do pomiaru TH odpowiedzi komórkowe2Należy dołączyć przeciwciało przeciwko CD45.1 i/lub CD45.2, jeśli między FTA a myszami gospodarzami występuje różnica allotypowa CD45.
  6. Dodaj 100 μl roztworu stockowego 2x przeciwciał/barwników żywotności (w PBS zawierającym 0,1% BSA) do 100 μl alikwoty komórek, wymieszać dokładnie i inkubować w lodzie (4 °C) przez 30 min.
  7. Przemycie komórek: Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz. Resuspendować komórki w 200 μl buforu PBS zawierającego 0,1% BSA, osadzić komórki poprzez wirowanie przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  8. Resuspendować komórki w całkowitej objętości 400 μl  buforu PBS zawierającego 0,1% BSA, przefiltrować komórki przez 70 μm przefiltrować przez sito i przeanalizować metodą cytometrii przepływowej w cytometrze przepływowym zdolnym do detekcji odpowiednich barwników i koniugatów fluorescencyjnych. Zebrać do 3 x 106 zdarzenia limfocytów, aby rozdzielić każdy klaster komórek FTA i pozyskać wystarczającą liczbę komórek do analizy statystycznej. Uwaga: Należy upewnić się, że zastosowano wszystkie typowe kontrole dla cytometrii przepływowej (takie jak kontrole jednobarwne). Zazwyczaj CFSE wymaga wzbudzenia za pomocą niebieskiego lasera (zazwyczaj o długości fali 488 nm) i detekcji za pomocą filtrów pasmowych wycentrowanych na 520 nm; CTV wymaga wzbudzenia za pomocą fioletowego lasera (zazwyczaj o długości fali 405 nm) i detekcji za pomocą filtrów pasmowych wycentrowanych na 450 nm; a CPD wymaga wzbudzenia za pomocą czerwonego lasera (zazwyczaj o długości fali 633 nm lub 640 nm) i detekcji za pomocą filtrów pasmowych wycentrowanych na 670 nm.

4. Analiza danych

  1. Analizę danych z cytometrii przepływowej należy przeprowadzić przy użyciu standardowego oprogramowania do cytometrii przepływowej (przykładowy wynik prezentuje zastosowaną strategię bramkowania).
  2. Aby obliczyć % specyficznej lizy, należy wyznaczyć liczbę komórek w każdym klastrze komórek FTA poddanych impulsowaniu peptydami wiążącymi się z MHC klasy I oraz w klastrach FTA, które nie były poddane impulsowaniu peptydami („Nil”), a następnie zastosować poniższy wzór do obliczenia % specyficznej lizy.
    % specyficznej lizyRównania analizy celu, wzór obliczania stosunku, proces matematyczny, kontekst badawczy.
    Uwaga: W powyższym wzorze termin „primed” odnosi się do celów pochodzących od zwierząt, u których przypuszcza się wystąpienie odpowiedzi immunologicznej przeciwko peptydom docelowym, „naïve” odnosi się do celów od zwierząt naiwnych, „peptide” odnosi się do celów poddanych impulsowaniu peptydami, a „nil” do celów niepoddanych impulsowaniu żadnymi peptydami.
  3. W celu oceny aktywacji limfocytów B jako miary aktywności TH, należy obliczyć geometryczną średnią intensywności fluorescencji (GMFI) dla przeciwciała anty-CD69 na komórkach B FTA poddanych impulsowaniu peptydami wiążącymi się z MHC klasy II u zwierząt „primed” i od tej wartości odjąć GMFI ekspresji CD69 na odpowiadających im komórkach B FTA u zwierząt „naïve”, aby uzyskać miarę aktywności TH.
  4. Na podstawie statystyk wygenerowanych w krokach 4.2 i 4.3, należy wykorzystać oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych, takie jak GraphPad Prism, aby obliczyć pozostałe parametry ilościowe i jakościowe, takie jak pole pod krzywą (AUC) oraz EC50 (szczegółowy opis sposobu obliczania AUC znajduje się pod adresem
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, a dla EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index.htm?reg_the_ec50.htm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako przykład zastosowania testu FTA, mysz szczepu BALB/c zimmunizowano rekombinowanym wirusem ospy krowiej (VV) wykazującym epitopy HIV-I (VV-HIV), a następnie oceniono odpowiedzi na epitopy CTL HIV-I (Gag, Gag mut, Env i Pol), epitopy CTL VV (F2L i F2L mut) oraz epitop komórek TH HIV-I, Gag Th (opisany w2), wykorzystując test FTA o 252 parametrach (Rycina 1B). Warianty epitopów Gag (Gag mut) i F2L (F2L mut) nie są ekspresowane w wektorze VV-HIV, zatem odpowiedzi przeciwko tym epit...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaletą testów opartych na FTA jest to, że umożliwiają one dyskryminację >250 żywotnych i w pełni funkcjonalnych populacji komórek docelowych od pojedynczego zwierzęcia gospodarza za pomocą cytometrii przepływowej. Zapewnia to poziom złożoności testów opartych na cytometrii przepływowej in vivo , który wcześniej nie był możliwy. Zostało to podkreślone w 2 doświadczeniach na zwierzętach pokazanych powyżej, w których odpowiedzi na 7 różnych epitopów wirusa w 6 stężeniach można było monitorować w powtórzeniach 6 jed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Project Grants #1010395 (BQ i CP) oraz #525431 (CR), oraz Program Grant #455395 (CP) od National Health and Medical Research Council of Australia, grant Australijskiego Centrum Wirusowego Zapalenia Wątroby i HIV EOI 2012 (CR i RJJ) oraz grant od Fundacji Gordona i Małgosi Bootes (BQ i CR). Pragniemy podziękować Harpreet Vohra i Michaelowi Devoyowi za doskonałe utrzymanie laboratorium JCSMR FACS, Australijskiej Fundacji Badań nad Rakiem Biomolecular Resource Facility, JCSMR, ANU, za syntezę peptydów oraz dr Davidowi Boyle'owi z CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australia za dostarczenie zapasów rodzicielskiej szczepionki przeciwko HIV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMISigmaR8758
Surowica cielęca płoduSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anty-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anty-CD69 fioletowy brylantowy 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
Wirówka VortexScientific Industries Inc
Cytometr przepływowy Eppendorf (Fortessa lub odpowiednik z niebieskim, czerwonym i fioletowym źródłem lasera)BD Bioscience

Bibliografia

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fluorescencyjna matryca cel wcytometria przep ywowabarwienie barwnikami ywotno cipulsowanie peptydami MHCCellTrace Violetbarwienie CFSEbarwnik proliferacji CPDpowt rzenia wewn trztestoweocena in vivo
Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.