Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

27.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51628

⸱

14 czerwca 2014

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Streszczenie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to technika molekularna, która umożliwia wykrywanie kwasów nukleinowych w komórkach. DNA FISH jest często stosowany w cytogenetyce i diagnostyce nowotworów i może wykrywać aberracje genomu, co często ma ważne implikacje kliniczne. RNA FISH może być używany do wykrywania cząsteczek RNA w komórkach i dostarczył ważnych informacji na temat regulacji ekspresji genów. Połączenie DNA i RNA FISH w tej samej komórce jest technicznie trudne, ponieważ warunki odpowiednie dla DNA FISH mogą być zbyt surowe dla delikatnych, jednoniciowych cząsteczek RNA. Przedstawiamy tutaj łatwy do zastosowania protokół, który umożliwia połączone, jednoczesne wykrywanie RNA Xist i DNA kodowanego przez chromosomy X. Ten połączony protokół DNA-RNA FISH może być prawdopodobnie zastosowany do innych systemów, w których konieczne jest wykrycie zarówno RNA, jak i DNA.

Wprowadzenie

Badanie komórek i tkanek za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) pozwoliło, od czasu jej wprowadzenia pod koniec lat siedemdziesiątych1, badaczom badać geny, organizację chromatyny i ekspresję genów na poziomie subkomórkowym. DNA FISH jest często stosowany w cytogenetyce, kariotypowaniu2, diagnostyce nowotworów3 i preimplantacyjnych badaniach genetycznych4 i odgrywa ważną rolę w badaniach molekularnych5-6, ponieważ umożliwia wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku. Analiza ekspresji pojedynczej komórki za pomocą RNA FISH może wykryć natywne pierwotne transkrypty i niekodujące RNA transkrybowane z chromosomów i oferuje korzyści innym technikom, które oceniają ekspresję genów na poziomie populacji, w tym na przykład ilościowemu RT-PCR, analizie ekspresji całego genomu lub Northern blotting. Wizualizując transkrypty RNA pochodzące bezpośrednio z miejsc ich pochodzenia, zauważono na przykład, że ekspresja genów jest stochastyczna7, a czasami może być specyficzna dla alleli8. Udoskonalenia w tej technice pozwoliły nawet na wykrycie i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w komórkach9-11.

Podstawowa zasada działania FISH polega na hybrydyzacji kwasów nukleinowych w komórce z sondą kwasów nukleinowych za pomocą wysoce specyficznego parowania zasad Watsona i Cricka. Sonda może być wykrywana bezpośrednio lub pośrednio, co skutkuje sygnałem, który można wizualizować pod mikroskopem. Początkowe próby polegały na radioaktywnie znakowanych sondach, które miały wady związane z kwestiami bezpieczeństwa, ograniczoną rozdzielczością przestrzenną i możliwością wykrywania tylko jednego celu na raz12-14. Późniejszy rozwój nieradioaktywnych znaczników, w tym fluorochromów, haptenów i enzymów, pozwolił na szerokie zastosowanie FISH jako rutynowej techniki biologii molekularnej. Sonda FISH może być albo bezpośrednio znakowana fluorochromami poprzez chemiczne łączenie cząsteczek fluorescencyjnych z sekwencjami kwasów nukleinowych15 i integrację znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów16-19, albo sonda może być pośrednio wizualizowana po integracji haptenów (w tym biotyny i digoksygeniny) i immunologicznej detekcji haptenów przez przeciwciała specyficzne dla haptenów sprzężone z fluorescencyjnymi cząsteczkami reporterowymi20-21. To ostatnie podejście pozwala na wzmocnienie sygnału poprzez użycie kilku warstw znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał, które są używane do wzmocnienia oryginalnego sygnału i umożliwia wykrywanie gatunków RNA, które ulegają ekspresji na niskich poziomach. Łącząc techniki etykietowania bezpośredniego i pośredniego oraz różne hapteny, kilka celów może być jednocześnie wizualizowanych w tej samej komórce.

Jednym z najważniejszych kroków w protokołach FISH jest hybrydyzacja sondy do jej celu. Chociaż teoretycznie sonda będzie specyficznie wiązać się tylko ze swoim celem, w praktyce ta specyficzność nie zawsze jest osiągana, ponieważ sondy mogą wiązać się z regionami homologicznymi, a warunki hybrydyzacji nie zawsze będą idealne dla określonego regionu DNA lub gatunku RNA. Mycie po hybrydyzacji ma zatem szczególne znaczenie, ponieważ może zwiększyć rygorystyczność procedury FISH i może zapobiec niespecyficznemu wiązaniu sond FISH, co skutkowałoby wysokim poziomem szumu tła. Ponieważ cząsteczki RNA są jednoniciowe, można je łatwo zhybrydyzować z sondą FISH. W przeciwieństwie do tego, dwuniciowa cząsteczka DNA najpierw potrzebuje etapu denaturacji, po którym sonda może się hybrydyzować. Zwykle osiąga się to poprzez podgrzanie próbki, co powoduje denaturację DNA. Jednak w tych trudnych warunkach kruche, jednoniciowe cząsteczki RNA mogą zostać utracone. W związku z tym połączone DNA-RNA FISH wymaga znacznej optymalizacji warunków i jest trudniejsze technicznie w porównaniu z oddzielnym wykrywaniem tylko RNA lub DNA.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół połączonego, jednoczesnego DNA-RNA RYB, który pozwolił nam badać inaktywację chromosomu X (XCI) w różnicowaniu żeńskich embrionalnych komórek macierzystych myszy22-24. XCI jest kluczowym mechanizmem epigenetycznym dla rozwoju embrionalnego samic25 i powoduje heterochromatynizację, a tym samym wyciszenie jednego z dwóch chromosomów X u samic26-27. Niezbędne w tym procesie jest niekodujące RNA Xist28-30, które jest regulowane przez białka RNF1222-23 i REX124. Ekspresja Xist ulega zwiększeniu na przyszłym nieaktywnym chromosomie X (Xi) podczas rozwoju embrionalnego lub po różnicowaniu komórek ES in vitro i może rozprzestrzeniać się wzdłuż chromosomu X, a tym samym przyciągać enzymy przebudowujące chromatynę, co powoduje wyłączenie transkrypcji chromosomuX 31. To rozprzestrzenianie się RNA Xist może być wizualizowane przez RNA FISH jako powłoka chromosomu X, który jest również określany jako chmura Xist. Ponieważ żeńskie komórki ES mogą stracić jeden ze swoich chromosomów X z powodu niestabilności genomu, my i inni zastosowaliśmy połączone DNA-RNA FISH do badania XCI, aby upewnić się, że tylko kariotypowo stabilne komórki są oceniane w analizie tego ważnego procesu22,32-34. Podobnie jak w przypadku każdej techniki biologii molekularnej, opublikowano kilka różnych doskonałych protokołów35-38. Tutaj przedstawiamy naszą metodę, zaczynając od indukcji różnicowania w mysich komórkach ES, utrwalenia komórek, znakowania sond FISH przez translację Nicka, wstępnej obróbki utrwalonych komórek w celu umożliwienia przepuszczalności i późniejszego wychwytu sondy, hybrydyzacji sondy do celu, a na końcu wykrywania sondy przez przeciwciała znakowane fluorescencyjnie. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół pozwala na wierne wykrycie RNA Xist i chromosomu X w ciągu dwóch dni, a podstawy tej techniki mogą być prawdopodobnie zaadaptowane do innych systemów i obszarów badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Indukcja różnicowania w żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych w celu wywołania inaktywacji chromosomu X

UWAGA: Embrionalne komórki macierzyste samic myszy (dostępne na życzenie) są hodowane w standardowych warunkach komórek ES na żelatynizowanych szalkach hodowlanych pokrytych mysimi fibroblastami embrionalnymi (MEF). Zakładamy tutaj, że czytelnik jest zaznajomiony ze standardowymi technikami hodowli komórkowych39-41. Aby indukować różnicowanie, komórki ES hodowane na szalkach T25 zostaną oddzielone od MEF i zostaną posiane w pożywce różnicowej.

  1. Usunąć pożywkę ES z hodowli komórkowej ES i przemyć dwukrotnie PBS hodowli komórkowej.
  2. Dodać 1,5 ml trypsyny-EDTA (podgrzanej do temperatury 37 °C) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 7 minut. Po 3,5 minuty delikatnie wstrząsnąć naczyniem, aby rozbić kolonie.
  3. Dezaktywuj trypsynę-EDTA, dodając do komórek 3,5 ml pożywki różnicującej. Pipetować komórki w górę i w dół, aby uzyskać roztwór jednokomórkowy, i zebrać w probówce o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 200 x g i zebrać komórki w 10 ml pożywki różnicującej.
  4. Dodać zawiesinę komórkową do nieżelatynizowanej naczyń hodowlanej i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych. UWAGA: MEF-y będą w stanie przylegać do nieżelatynizowanej płytki hodowlanej, podczas gdy komórki ES pozostaną w zawiesinie.
  5. W międzyczasie dodaj wysterylizowane szklane szkiełka nakrywkowe (24 x 24 mm) do płytek 6-dołkowych, dodaj 0,2% żelatyny i inkubuj przez minimum 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Po 1 godzinie zebrać supernatant z wstępnie posianej hodowli komórek ES, która będzie składać się głównie z nieprzylegających komórek ES. Umieścić komórki ES na 6-dołkowych płytkach zawierających szkiełka nakrywkowe. UWAGA: Użyj 1/6 częścizlewającej się płytki T25 na 6 dołków 6-dołkowej płytki. Pozwoli to na zlewające się różnicowanie długo po 3 dniach różnicowania. Zmieniaj medium codziennie. Aby uzyskać dłuższy czas różnicowania, należy wstępnie posiać komórki ES w pożywce różnicowej w szalkach bakteryjnych i inkubować na wytrząsarce komórek zintegrowanej z inkubatorem do hodowli komórkowych. Umożliwi to komórkom tworzenie ciał zarodkowych, które można posiać na szkiełkach nakrywkowych na 1-2 dni przed utrwaleniem.

2. Fiksacja zróżnicowanych komórek ES do późniejszej analizy DNA-RNA FISH

  1. Usunąć pożywkę różnicującą z kultur różnicujących i przemyć dwukrotnie PBS z kulturą komórkową. UWAGA: Ostrożnie dodaj PBS, aby zapobiec wypłukaniu komórek.
  2. Usuń PBS z hodowli komórkowej i utrwal komórki, dodając 4% paraformaldehydu (PFA)/PBS i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: PFA jest toksyczny i może powodować znaczne zagrożenie dla zdrowia podczas wdychania lub w kontakcie ze skórą lub oczami. Ponadto PFA jest rakotwórczy.
  3. Usuń 4% PFA/PBS i umyj szkiełka nakrywkowe 3x 70% etanolem. UWAGA: Prawidłowe mycie jest ważne, ponieważ wszelkie ślady PFA będą przeszkadzać w kolejnych krokach FISH. Szkiełka nakrywkowe mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy przed analizą FISH.

3. Etykietowanie sond DNA do eksperymentów FISH

UWAGA: Uzyskaj fragment DNA interesującego nas genu (minimalna długość >2 kb dla RNA FISH, lub >20 kb dla DNA FISH), lub BAC pokrywający interesujący nas gen. Do wykrywania RNA może wystarczyć mniejsza sonda w porównaniu z detekcją DNA, ponieważ najprawdopodobniej transkrypcja spowoduje powstanie wielu transkryptów, które można wykryć jednocześnie. Aby uzyskać silny sygnał na pojedynczej kopii nici DNA, wymagana jest dłuższa sonda, aby móc wykryć wystarczającą liczbę włączonych haptenów. Najlepiej, aby do zaprojektowania sondy DNA wybrano nietranskrybowany region genomowy. Ponadto, przy użyciu mniejszej sondy do wykrywania RNA, nie będzie można dopuścić do tego, że loci genomowe, z których RNA jest transkrybowany, są wykrywane w połączonym podejściu DNA-RNA FISH, chociaż nie można tego całkowicie wykluczyć. Do wykrycia >mysiego Xist użyto sondy cDNA o wielkości 5,5 kb. Do wykrywania chromosomu X można użyć kilku sond BAC. Dobre wyniki uzyskano z mieszaniną BAC RP23-100E1 i BAC CT7-474E4, które znajdują się w bliskiej odległości od locus Xist. W zależności od genu lub chromosomu, który jest przedmiotem zainteresowania, może być wymaganych kilka różnych sond w celu uzyskania optymalnych wyników. Za każdym razem, gdy pracujesz z materiałami, które będą używane do RNA-FISH, używaj sterylnych końcówek filtrujących, wolnych od RNAzyH2Oi pracuj w czystym środowisku.

  1. Pobrać 1 μg DNA i rozcieńczyć wH2Ow całkowitej objętości 16 μl. Dodać 4 μl digoksygeniny lub roztworu do znakowania biotyny (patrz odczynniki), wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze 16 °C przez 90 min. UWAGA: Nukleotydy znakowane biotyną lub digoksygeniną zostaną teraz włączone przez translację nick-translacji.
  2. W międzyczasie przygotuj kolumny G50 w celu usunięcia niezintegrowanych nukleotydów. Weź strzykawkę o pojemności 2 ml, wyjmij stempel i dodaj do strzykawki wysterylizowaną bawełnę. Dodać kulki G50 do roztworu, aby napełnić strzykawkę, umieścić strzykawkę w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 642 x g przez 1 min. UWAGA: Około 80% strzykawki powinno być teraz wypełnione G50. Powtórz tę czynność, gdy obecna jest mniejsza ilość G50.
  3. Po 90 minutach dodać 40 μlH2Odo mieszaniny reakcyjnej z zagłębieniem i dodać reakcję do kolumny G50. Dodać pustą probówkę pod kolumnę i odwirować przy 642 x g przez 2 minuty. Zebrać przepływ w probówce reakcyjnej.
  4. Zmierzyć objętość przepływającego przepływu za pomocą pipety i dodaćH2O, aby uzyskać całkowitą objętość 200 μl. Wytrącić przepływ, dodając 13,3 μl DNA plemników łososia (10 mg/ml), 13,3 μl tRNA drożdży (10 mg/ml), 26,7 μl mysiego DNA Cot-1 (1 mg/ml) i 28 μl 2 M NaAc, Odczyn pH 5,6. Wymieszaj przez wirowanie i dodaj 533 μl lodowatego 100% etanolu. Wstrząsnąć probówką i odwirować przy 16 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć osad 70% etanolem. Wirować przy 16 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i wysuszyć osad na powietrzu. Dodać 50 μl roztworu hybrydyzacyjnego 50+ i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby ułatwić rozpuszczenie. UWAGA: Oznakowana sonda może być przechowywana przez kilka lat w temperaturze -20 °C. UWAGA: Roztwór hybrydyzacyjny 50+ zawiera formamid, który jest toksyczny, może podrażniać skórę, oczy i układ oddechowy, a także jest teratogenem.

4. Permeabilizacja, obróbka wstępna i hybrydyzacja stałych komórek dla połączonych ryb DNA-RNA

  1. Utrwalone komórki na szkiełkach nakrywkowych należy ponownie uwodnić, usuwając 70% etanolu i dodając PBS z hodowli komórkowych do płytek 6-dołkowych. Inkubować przez 5 minut. Powtórz w sumie trzy razy.
  2. Usuń PBS z hodowli komórkowej i dodaj 0,2% pepsyny do płytek 6-dołkowych, aby przepuszczalność komórek. Inkubować płytki 6-dołkowe w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 4 minuty. Usuń pepsynę i dezaktywuj za pomocą H2O wolnego od RNA.
  3. Komórki po utrwaleniu przez inkubację z 4% PFA/PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przemyć dwukrotnie hodowlą komórkową PBS przez 5 minut.
  4. Odwodnić komórki, inkubując z 70% etanolem przez 3 minuty, 90% etanolem przez 3 minuty i 100% etanolem przez 3 minuty. Przenieś szkiełka nakrywkowe z płytek 6-dołkowych i susz szkiełka nakrywkowe na powietrzu przez kilka minut.
  5. Starzenie komórek poprzez inkubację szkiełek nakrywkowych w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę na płycie grzewczej.
  6. Wstępnie zhybrydyzuj sondę FISH z mysim DNA Cot-1, dodając do każdego analizowanego szkiełka nakrywkowego 25 μl roztworu hybrydyzacyjnego 50+, 0,5 μl mysiego DNA Cot-1, 1 μl sondy Xist znakowanej biotyną i 1 μl sondy BAC znakowanej digoksygeniną wykrywającej chromosom X. Mieszać przez wirowanie i denaturować w temperaturze 99 °C przez 5 minut. Natychmiast inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, aby umożliwić hybrydyzację DNA Cot-1 w celu powtórzenia sekwencji obecnych w sondach.
  7. Po leżakowaniu nanieść 50 μl buforu denaturacyjnego (składającego się z 70% formamidu/2x SSC/10 mM buforu fosforanowego) na szkiełku podstawowym i położyć szkiełka nakrywkowe na wierzchu z komórkami skierowanymi w stronę buforu denaturacji. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 minuty.
  8. Dodaj szkiełka nakrywkowe z powrotem do płytek 6-dołkowych i post-fix komórki, inkubując w lodowatym 70% etanolu przez 5 minut.
  9. Odwodnić komórki, a następnie inkubować w 70% etanolu przez 3 minuty, 90% etanolu przez 3 minuty i 100% etanolu przez 3 minuty. Usuń szkiełka nakrywkowe z płytek 6-dołkowych i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut.
  10. Umieść wstępnie zhybrydyzowaną sondę na szklanym szkiełku i inkubuj szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Umieścić szkiełka w wilgotnej komorze wypełnionej 50 ml 50% formamidu/2x SSC i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

5. Mycie po hybrydyzacji i wykrywanie sondy za pośrednictwem przeciwciał

  1. Napełnić płytki 6-dołkowe 2x SSC i wstępnie ogrzać do 42 °C. Po całonocnej inkubacji dodać szkiełka nakrywkowe i inkubować w temperaturze 42 °C przez 5 minut.
  2. Usunąć 2x SSC i inkubować szkiełka nakrywkowe z 50% formamidem/2x SSC przez 10 minut w temperaturze 42 °C. Powtórzyć w sumie 3 razy (łącznie 30 minut mycia).
  3. Usuń 50% formamidu/2x SSC i myj szkiełka za pomocą Tris-saline-Tween (TST) przez 2 x 5 min w temperaturze pokojowej.
  4. Umieścić 50 μl Tris-saline-BSA (TSBSA) na szkiełku nakrywkowym na nowych szkiełkach podstawowych i inkubować szkiełka nakrywkowe do góry nogami w celu zablokowania przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze nawilżanej TST.
  5. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytki 6-dołkowe i przemyć 2 x 5 minut za pomocą TST.
  6. Umieścić 50 μl przeciwciała zapobiegającego kopaniu owiec (1:500 w TSBSA) na szkiełko nakrywkowe na nowych szkiełkach podstawowych i inkubować szkiełka nakrywkowe do góry nogami na pierwszym etapie inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze nawilżanej przez TST.
  7. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytki 6-dołkowe i przemyć 2 x 5 minut za pomocą TST.
  8. Umieścić 50 μl przeciwciała przeciwko owcom królika sprzężonego z FITC (1:250 w TSBSA) na szkiełko nakrywkowe na nowych szkiełkach podstawowych i inkubować szkiełka nakrywkowe do góry nogami na drugim etapie inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze nawilżanej przez TST.
  9. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytki 6-dołkowe i przemyć 2 x 5 minut za pomocą TST.
  10. Umieścić 50 μl koziego przeciwciała anty-królika sprzężonego z FITC (1:250 w TSBSA) na szkiełko nakrywkowe na nowych szkiełkach podstawowych i inkubować szkiełka nakrywkowe do góry nogami na trzecim etapie inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze nawilżanej przez TST.
  11. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytki 6-dołkowe i przemyć 2 x 5 minut za pomocą TST.
  12. Umieścić 50 μl mysiego przeciwciała anty-biotyny (1:200 w TSBSA) na szkiełko nakrywkowe na nowych szkiełkach podstawowych i inkubować szkiełka nakrywkowe do góry nogami na czwartym etapie inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze nawilżanej TST.
  13. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytki 6-dołkowe i przemyć 2 x 5 minut za pomocą TST.
  14. Umieścić 50 μl przeciwciała przeciwko myszom osła sprzężonego z rodaminą (1:250 w TSBSA) na szkiełko nakrywkowe na nowych szkiełkach podstawowych i inkubować szkiełka nakrywkowe do góry nogami na piątym etapie inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze nawilżanej TST.
  15. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytki 6-dołkowe i przemyć 2 x 5 minut za pomocą TST.
  16. Umieścić 50 μl koziego przeciwciała przeciwko koniom sprzężonego z rodaminą (1:250 w TSBSA) na szkiełko nakrywkowe na nowych szkiełkach podstawowych i inkubować szkiełka nakrywkowe do góry nogami na szóstym etapie inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze nawilżanej przez TST. UWAGA: przeciwciało przeciwko kozom rozpozna przeciwciało przeciwko osłu przeciwko myszy; Gdy jest dostępne dla badacza, przeciwciało przeciwko kozom również będzie działać.
  17. Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytki 6-dołkowe i przemyć 2 x 5 minut za pomocą TST. Umyj dodatkowe 5 minut solą fizjologiczną Tris (TS).
  18. Odwodnić komórki, a następnie inkubować w 70% etanolu przez 3 minuty, 90% etanolu przez 3 minuty i 100% etanolu przez 3 minuty. Usuń szkiełka nakrywkowe z płytek 6-dołkowych i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut.
  19. Umieść kroplę podłoża montażowego z DAPI (patrz odczynniki) na szkiełku podstawowym i dodaj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na górze. Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci i oceń wyniki FISH za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując powyższy protokół łączonej hybrydyzacji in situ DNA-RNA (FISH), byliśmy w stanie zwizualizować inaktywację chromosomu X w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych samic. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny przykład eksperymentu DNA-RNA FISH, w którym wykryliśmy zarówno Xist (widoczny jako tzw. chmura RNA Xist na nieaktywnym chromosomie X oraz punktowy sygnał transkrypcji bazalnej na aktywnym chromosomie X), jak i region chromosomu X, który jest widoczny jako sy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Połączone DNA-RNA FISH może być wyzwaniem technicznym, ponieważ warunki odpowiednie dla DNA FISH mogą być zbyt surowe dla mniej stabilnych cząsteczek RNA. Zastosowano kilka podejść do badania zarówno DNA, jak i RNA w tej samej komórce, omijając potrzebę jednoczesnej inkubacji z sondami wykrywającymi zarówno DNA, jak i RNA. Na przykład w podejściu polegającym na nałożeniu najpierw wykonuje się RNA FISH, a następnie obrazuje się komórki i pobiera współrzędne. Następnie te same szkiełka są używane do DNA FISH, podczas który...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim byłym i obecnym członkom Wydziału Reprodukcji i Rozwoju Erasmus MC za pomocne i stymulujące dyskusje w ciągu ostatnich lat. Chcemy również podziękować trzem anonimowym recenzentom za pomocne opinie. Prace w laboratorium Gribnau są finansowane przez Holenderską Radę ds. Badań Naukowych (NWO-VICI) oraz grant ERBN dla początkujących naukowców.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
żeńskie embrionalne komórkimyszy zostaną udostępnione na żądanie
fibroblastymogą pochodzić z zarodków E13,5 lub ze źródeł komercyjnych np.
Pożywkado hodowli komórek Millipore ESDMEM, 15% płodowa surowica cielęca, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, aminokwasy endogenne, 0,1 mM γ-merkaptoetanol i 1,000 U/ml LIF. Filtruj, sterylizuj i przechowuj w 4 ° C maksymalnie 2 tygodnie.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
Surowica na cielęce płoduInvitrogen10099141
Penicylina– streptomycyna (100x)Invitrogen15140-122
Aminokwasy endogenneInvitrogen11140-050
γ-merkaptoetanolSigma-AldrichM7522
ES pożywkaIMDM-Glutamax, 15% inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyna, aminokwasy endogenne, 37,8 i #956; l/L monotioglicerol i 50 μ g/ml kwas askorbinowy
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
Kwas askorbinowy (50 mg/ml)Sigma-AldrichA4403
monotioglicerolSigma-AldrichM6145
T25 naczynia do hodowli komórkowychGreiner Bio-one690160
6-dołkowe naczynia do hodowli komórkowychGreiner Bio-one662160
klasa hodowli komórkowej PBSSigma-AldrichD8537
Trypsyna-EDTA 0,25% (v/v) trypsyna/0,2% (w/v) EDTA w PBSGibco25200-056
Probówki FalconFalcon352196
24 x 24 mm Szkiełka nakrywkoweMenzle780882
żelatynaSigma-AldrichG1890-100Gprzygotować 0,2% roztwór żelatyny/hodowli komórkowej PBS i autoklaw
PepsynaSigma-AldrichP7000Rozcieńczony do 0,2% w 0,01 M HCl (pH 2,0)
absolutny 100% etanolSigma-Aldrich32221-2,5Lwykorzystuje absolutną 100% wodę wolną od etanolu i RNAzy do produkcji 70% i 90% roztworów etanolu
Sterylne końcówki filtraBaxter Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
Zestaw do etykietowania digoksygeniny (tłumaczenie DIG-Nick)Zestaw
(tłumaczenie Biotyny Nick)Roche
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
Strzykawka 2 mlBD Plastipak300013
probówki Eppendorf z bawełnianej sterylizowanej bawełny
Eppendorf
drożdże tRNA 10 mg/mlInvitrogen15401-029
DNA plemników łososia 10 mg/mlInvitrogen15632-011
mysie cot-1 DNA 1 mg/mlInvitrogen18440-016
Mikrowirówka stołowa EppendorfModel 5417R
Eppendorf wirówka z chłodzeniem EppendorfModel 5810R
2 M NaAc, pH 5,6Sigma-AldrichS7670
50+ roztwór50% formamidu, 2x SSC, 50 mM bufor fosforanowy pH 7, 10% siarczan dekstranu pH 7
formamidAcros organics3272350000
siarczan dekstranuFluka31403
10 mM bufor fosforanowy, pH 7dodać 57,7 ml 1 M Na2HPO4 i 42,3 ml 1 M NaH2PO4; użyć uzdatnionej wody DEPC i autoklawu
denaturacyjny70% formamidu/2x SSC/10 mM bufor fosforanowy pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7,5 roztwór
Tris-saline-Tween roztwór myjący (TST)100 ml 10x sól fizjologiczna, 50 ml 2M Tris, 500 μ l Tween-20, dodaj wodę wolną od RNAzy do 1 L
10x roztwórrozpuść 85 g NaCl w 1 L Wolne od RNA>2<O i autoklaw
Tris-saline-BSA (TSBSA)500 i #956; l 10x sól fizjologiczna, 250 μ l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml wolne od RNAzy H2O
BSA, oczyszczone, 100xNew England BiolabsB9001S
owce przeciwciało anty-digDiagnostyka1:500 rozcieńczone w TSBSA
przeciwciało przeciwko owcom skoniugowane z FITCJackson labsstosować 1:250 rozcieńczone w TSBSA
kozie przeciwciało anty-królikowe skoniugowane z FITCJackson laboratoriaużywają 1:250 rozcieńczone w TSBSA
mysie przeciwciało anty-biotynoweDiagnostykazastosowanie 1:200 rozcieńczone w TSBSA przeciwciało
osła-anty-myszy skoniugowane z RhodaminąJackson laboratoriaużywają 1:250 rozcieńczone w TSBSA
kozie przeciwciało anty-końskie sprzężone z RhodamineJackson laborsużywają 1:250 rozcieńczone w TSBSA
Tris-roztwór myjący soli fizjologicznej (TS)10 ml 10 x sól fizjologiczna, 5 ml 2 M Tris, 85 ml wolne od RNA H2O
Podłoże montażowe Vectashield z lakierem
fluorescencyjny miscroscope
macierzyste , embrionalne myszy różnicowania komórek Baxter TKF7114 do etykietowania biotyny 11745816910 Roche 11745824910 30120086 hybrydyzacyjny bufor soli Roche Roche do paznokci DAPI Vectorlabs H-1200

Bibliografia

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kombinowana metoda DNA-RNA FISHdetekcja RNA Xistznakowanie sond DNAtranslacja nacięćmikroskopia immunofluorescencyjnafiksacja paraformaldehydembufor do hybrydyzacjiprzeciwciała fluorescencyjne
Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.