Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Zarodek Drosophila nadal jest głównym modelem do badania podstawowych mechanizmów rozwoju². Ten potężny model jest wspierany przez szeroki wachlarz narzędzi genetyki molekularnej, które pozwalają na manipulację zasadniczo dowolnym genem w dowolnym momencie i w obrębie każdego rozwijającego się narządu. Niewielki rozmiar, szybki rozwój i obszerna charakterystyka morfogenezy zarodka Drosophila sprawiają, że jest to model z wyboru dla genetycznych badań przesiewowych, z których wiele odkryło podstawowe ścieżki rozwojowe^3,4. Scharakteryzowano liczne fenotypy w zarodku Drosophila, które są łatwe do interpretacji, często dostarczając środków do identyfikacji podstawowych molekularnych mechanizmów genetycznych odpowiedzialnych za nieprawidłową cechę.

Historycznie rzecz biorąc, wadą modelu embrionalnego muchy była trudność we wprowadzaniu małych cząsteczek do tkanek embrionalnych. Ta przeszkoda stworzyła ograniczenia w zakresie: 1) wykorzystania znanych bioaktywnych małych cząsteczek jako sond do badania mechanizmów rozwojowych oraz 2) wykorzystania tego ustalonego modelu do oceny aktywności teratogennej lub farmakologicznej niescharakteryzowanych małych cząsteczek. W związku z tym potencjał przesiewowy zarodka muchy nie został w pełni wykorzystany w charakterystyce aktywności małych cząsteczek.

Dostarczanie małych cząsteczek do zarodka muchy można osiągnąć za pomocą dwóch metod: 1) przenikania skorupki jaja i 2) mikroiniekcji. W artykule przedstawiono postępy w metodzie przenikania, które są łatwe do wykonania w warunkach konwencjonalnego laboratorium Drosophila. Należy zauważyć, że ostatnie postępy w metodach mikroiniekcji z wykorzystaniem technologii mikrofluidycznej również przyczyniają się do rozwoju metod wprowadzania związków do zarodka^5,6. Wprowadzaniu cząsteczek do zarodka zapobiega woskowa warstwa skorupki jaja⁷. Skorupka jaja Drosophila składa się z pięciu warstw. Od wewnątrz na zewnątrz są to: błona witelinowa, warstwa woskowa, wewnętrzna warstwa kosmówkowa, endochorion i egzochorion⁸. Trzy zewnętrzne warstwy kosmówkowe można usunąć przez krótkie zanurzenie zarodka w rozcieńczonym wybielaczu, etap określany jako dechorionacja. Odsłonięta warstwa woskowa może być następnie naruszona przez wystawienie na działanie rozpuszczalników organicznych, takich jak heptan i^{oktan 7,9}, co sprawia, że zdekorionowany zarodek staje się przepuszczalny, podczas gdy pozostaje zamknięty w leżącej poniżej błonie witelinowej. Jednak stosowanie tych rozpuszczalników powoduje komplikacje ze względu na ich toksyczność i trudności w regulacji ich silnego działania przepuszczalnego, które mają wyraźny negatywny wpływ na żywotność zarodka^9,10.

Metoda przenikania przy użyciu kompozycji określanej jako rozpuszczalnik do przepuszczalności zarodków (EPS) została wcześniej opisana¹. Rozpuszczalnik ten składa się z d-limonenu i środków powierzchniowo czynnych pochodzenia roślinnego, które umożliwiają mieszanie rozpuszczalnika z wodnymi. Niska toksyczność d-limonenu i zdolność do rozcieńczania rozpuszczalnika do pożądanych stężeń pozwoliły na uzyskanie skutecznej metody wytwarzania przepuszczalnych zarodków o wysokiej żywotności¹. Jednak dwa czynniki endogeniczne nadal powodują ograniczenia w aplikacji. Po pierwsze, zarodki wykazują niejednorodność przepuszczalności po leczeniu EPS, nawet jeśli dba się o utrzymanie ścisłej oceny rozwoju. Po drugie, zarodki starsze niż około ośmiu godzin okazały się trudne do przepuszczalności, co jest zgodne z twardnieniem skorupki jaja, które następuje po złożeniu jaj¹¹.

Opisane tutaj są postępy w metodzie EPS, które: 1) pomagają w identyfikacji i analizie prawie identycznie permeabilizowanych zarodków, nawet po wykonaniu etapów fiksacji i barwienia immunologicznego oraz 2) umożliwiają przenikanie zarodków w późnych punktach rozwojowych (>8 godzin, stadium 12 i starsze). W szczególności opisano zastosowanie barwnika dalekiej czerwieni, kwasu karboksylowego CY5, który służy jako wskaźnik przepuszczalności, który utrzymuje się w zarodku podczas rozwoju i po utrwaleniu formaldehydu. Ponadto wykazano, że hodowla zarodków w temperaturze 18 °C utrzymuje skorupkę jaja w stanie wrażliwym na EPS, umożliwiając przenikanie zarodków w późnym stadium (stadia 12-16).

Te postępy przezwyciężają wcześniej wspomniane ograniczenia metodologii EPS. Aplikacja ta zapewni zatem badaczom środki do wprowadzania małych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania do zarodka w różnych punktach rozwojowych przy jednoczesnym zachowaniu żywotności.

1. Przygotowanie kultur much, roztworów i urządzeń do obsługi zarodków

1. Przygotuj hodowlę klatkową Drosophila. Umieść 500+ much godowych pożądanego szczepu w klatce populacyjnej wyposażonej w 10 cm talerz do winogron i plamkę pasty drożdżowej. Utrzymuj kulturę w inkubatorze o kontrolowanej wilgotności 25 °C. UWAGA: Hodowle klatkowe wymagają dnia lub dwóch kondycjonowania, aby uzyskać spójne wzorce składania zarodków. Talerze winogronowe z pastą drożdżową wymienia się raz rano i raz wieczorem podczas kondycjonowania.
2. Przygotuj styropian. Ciepłe roztwory środków powierzchniowo czynnych (kokamid DEA i etoksylowany alkohol) w temperaturze 37 °C. Odpipetować 18 ml d-limonenu do szklanej fiolki scyntylacyjnej wyposażonej w mały mieszadło. Odmierzyć pipetą po 1 ml każdego z dwóch środków powierzchniowo czynnych (5% końcowego stężenia każdego z nich) do d-limonenu. Dokładnie wymieszaj i usuń mieszadło. UWAGA: Ten podstawowy roztwór EPS jest dobry przez około 2 miesiące w temperaturze pokojowej. Roztwór należy podgrzać w temperaturze 37 °C i zawirować w celu pełnego rozpuszczenia środków powierzchniowo czynnych przed użyciem. EPS i d-limonen należy przechowywać w szklanym pojemniku, ponieważ z czasem rozpuszczą niektóre tworzywa sztuczne.
3. Przygotować roztwór do dechorionacji zarodków, pożywki inkubacyjne, roztwory barwników i leków. Wymieszaj 25 ml wybielacza z 25 ml H₂O i umieść w płytkim naczyniu. Przygotować zmodyfikowaną zasadową pożywkę inkubacyjną (MBIM) i MBIM-T zgodnie z wcześniejszą recepturą^1,12. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych Shields i Sang M3 oraz PBS zgodnie z protokołem producenta (patrz Lista Materiałów). Przygotować roztwór podstawowy barwnika permeabilacyjnego o stężeniu 10 mM w DMSO.
4. Skompletować urządzenia i materiały do obsługi zarodków:
   1. Przygotować kosz do leczenia dechorionacji i EPS (patrz rysunek 1A). Odetnij 3-centymetrowy odcinek jednorazowej probówki wirówkowej/hodowlanej z polipropylenu o pojemności 50 ml za pomocą piły o drobnych zębach. Spraw, aby powierzchnia spawania była płaska, pocierając odcinek rury papierem ściernym przyklejonym do powierzchni blatu. Przyspawaj odcinek rury do siatki nylonowej Nitex, topiąc krawędź odcinka rury nad płomieniem i dociskając do siatki na szklanej płycie. Ostudź i odetnij dodatkową siatkę. UWAGA: Przezroczyste boki i spód pozwalają na szybkie i całkowite spłukanie resztek wybielacza i EPS na odpowiednich etapach. Etapy spawania należy wykonywać pod wyciągiem.
   2. Przygotuj kosz rozwojowy. Odciąć górną część probówki wirówkowej/hodowlanej o pojemności 50 ml równo z brzegiem nakrętki. Zdejmij i zmodyfikuj nasadkę, wycinając centralny otwór i nacięcia wzdłuż obręczy, jak pokazano na rysunku 1B. Przykręć nakrętkę na siatkę i na gwintach odciętego odcinka rury i przytnij dodatkową siatkę. UWAGA: Nasadka zawiera nacięcia w obrzeżu, które umożliwiają dyfuzję do podłoża masowego po umieszczeniu w misce zbiornika 60 mm (Rysunek 1B').
   3. Przygotuj elementy komory szkiełkowej. Wytnij kwadrat membrany tlenu rozpuszczonego, który jest większy niż otwór komory suwaka. Nałóż bardzo cienką warstwę smaru próżniowego na wewnętrzną krawędź otworu. Przymocować membranę DO do otworu, uszczelniając ją przed smarem za pomocą pierścienia ustalającego. Przyciąć nadmiar membrany DO, odcinając ją z powrotem w pobliżu pierścienia ustalającego. UWAGA: Specyfikacje komory suwaka można znaleźć w Kiehart i wsp. ¹³. Ta komora nie jest dostępna na rynku i wymaga niestandardowej produkcji w warsztacie mechanicznym.

2. Klasyfikacja, dechorionacja i leczenie EPS zarodków

1. Klasyfikacja zarodków według pobierania w określonym czasie. Umieść talerz świeżych winogron/drożdży w klatce do hodowli much w godzinach porannych. Pozostawić zarodki do składania przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C. Odrzucić tę płytkę i zastąpić ją świeżą płytką winogron/drożdży w celu późniejszego składania zarodków przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Zebrać tę płytkę i umieścić w inkubatorze o temperaturze 18 °C w celu dalszego etapu rozwoju. UWAGA: 1 godzina wywoływania w temperaturze 25 °C jest równa 2 godzinie wywoływania w temperaturze 18 °C. Wpływ starzenia w temperaturze 18 °C w porównaniu z 25 °C na utrzymanie przepuszczalności EPS w zarodkach w późnym stadium rozwoju można zobaczyć na rycinie 2.
2. Dechorionacja. Delikatnie spłucz zarodki z talerza winogronowego do siatkowego kosza za pomocą wody z kranu o temperaturze 25 °C i pędzla. Nadmiar drożdży z zarodków spłucz w koszu pod delikatnym strumieniem wody z kranu. Zanurz kosz w 50% wybielaczu na 2 minuty. Dokładnie umyj zarodki pod strumieniem wody z kranu. UWAGA: Delikatnie spryskuj zarodki roztworem wybielacza z przerwami za pomocą plastikowej pipety. Podczas gdy 2 minuty są zwykle wystarczające do całkowitej dechorionacji, ten czas inkubacji powinien być sprawdzony przez bezpośrednie badanie i odpowiednio dostosowany. Utrzymuj zdekorionowane zarodki w koszu zanurzonym w wodzie z kranu i natychmiast przejdź do etapu EPS.
3. Obróbka EPS
   1. Przygotuj sześć naczyń o średnicy 60 mm, z których każda zawiera około 10 ml PBS. Przygotować rozcieńczenie EPS, rozpuszczając 75 μl EPS w 2,925 ml MBIM (1:40) w szklanej zlewce o pojemności 50 ml z wirowaniem. Uwaga: Z tej mieszaniny tworzy się biała emulsja.
   2. Zetrzyj nadmiar wody z dna siatkowego kosza chusteczką laboratoryjną. Zanurzyć kosz w rozcieńczonym styropianie w zlewce i natychmiast zamieszać, aby rozproszyć zarodki w roztworze EPS na dnie kosza. Kontynuuj ruch wirowy przez 30 sekund. UWAGA: Rozcieńczenia EPS i czasy ekspozycji można zmieniać, aby kontrolować przepuszczalność. Zaleca się, aby optymalne rozcieńczenia EPS i czasy zabiegu zostały ustalone empirycznie na podstawie stosowanych szczepów much. Wydłużenie czasu ekspozycji do 60-90 sekund jest korzystne dla zarodków w stadium 12 i starszych.
   3. Wyjmij kosz, zetrzyj nadmiar EPS chusteczką laboratoryjną. Wykonaj sześć sekwencyjnych myć w 10 ml PBS w naczyniach o średnicy 60 mm. Użyj plastikowej pipety, aby delikatnie wstrzyknąć zarodki z PBS w każdym z sześciu prań. Przejdź do etapów farbowania i leczenia farmakologicznego. UWAGA: EPS można wyrzucić do zlewu.

3. Barwnik i leczenie farmakologiczne permeabilizowanych zarodków

1. Obróbka barwników
   1. Dodać 5 μl 10 mM barwnika kwasu karboksylowego CY5* do 1 ml MBIM-T (50 μM stężenie końcowe) w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i przemieszać wirowo. UWAGA: *Wybór barwnika zależy od dalszej analizy. Kwas karboksylowy CY5 jest skuteczny w kolejnych analizach z wykorzystaniem utrwalania i barwienia immunologicznego. Rodamina B jest przydatna do analizy żywych zarodków. Czerwona emisja rodaminy B i zielona emisja jej metabolitów¹ mogą powodować pewne komplikacje w dalszych zastosowaniach wykorzystujących fluorescencję. Lek lub toksyna mogą być dodane do roztworu barwnika, aby rozpocząć leczenie na tym etapie lub ograniczyć leczenie lekiem/toksyną do impulsu na tym etapie. Należy zachować ostrożność przy obchodzeniu się z lekami i toksynami oraz ich usuwaniu zgodnie z MSDS i normami bezpieczeństwa środowiskowego.
   2. Przenieś zarodki z kosza siatkowego do roztworu barwnika za pomocą pędzla. Zakryj probówkę i kilkakrotnie odwracaj, aby upewnić się, że zarodki swobodnie unoszą się w zawiesinie w roztworze barwnika. Umieść rurkę na kołysce nutującej na 15 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Wyjmij probówkę z nutatora i pozwól zarodkom się uspokoić. Usunąć roztwór barwnika za pomocą cienkiej pipety i zastąpić 1 ml MBIM-T do umycia. Odwróć rurkę, aby całkowicie zawiesić zarodki. Pozwól zarodkom się uspokoić i powtórz trzy kolejne płukania MBIM-T. Usuń cały MBIM-T z płukania końcowego i przejdź do etapu inkubacji.
2. Inkubacja do rozwoju zarodka
   1. Przenieś zarodki do jednej z dwóch komór: kosza rozwojowego lub komory szkiełkowej. UWAGA: Koszyk rozwojowy jest preferowany w przypadku dłuższych okresów rozwojowych i jest wymagany, jeśli mają być wykonane kolejne etapy utrwalania i barwienia immunologicznego. Komora szkiełkowa jest optymalna do obrazowania poklatkowego o wyższej rozdzielczości i jest najbardziej skuteczna w przypadku krótkich okresów rozwojowych (np. wczesnych zdarzeń embrionalnych). Lek lub toksyna mogą być dodawane do pożywki w różnych stężeniach, a rozwój zarodka może być monitorowany w czasie rzeczywistym na żywych zarodkach lub w punkcie końcowym przy użyciu standardowych protokołów utrwalania i barwienia immunologicznego.
   2. Rozwój w koszykach
      1. Wyczyść kosz rozwojowy, spryskując go 70% etanolem, dokładnie spłucz wodą dejonizowaną i osusz chusteczką laboratoryjną. Przygotować 6 ml pożywki inkubacyjnej o pożądanym stężeniu leku lub toksyny. Umieść kosz rozwojowy w naczyniu o średnicy 60 mm, uważając, aby pęcherzyki powietrza nie utknęły pod podstawą siatki. UWAGA: Powszechnie stosowane są dwa podłoża: sam MBIM lub MBIM/M3 w mieszaninie 50:50, przy czym te ostatnie są bardziej skuteczne w przypadku dłuższych okresów rozwoju.
      2. Przenieść przepuszczalne zarodki na powierzchnię siatki w podstawie kosza za pomocą pędzla. Delikatnie spryskaj zarodki pożywką z otaczającego zbiornika. Rozprowadź zarodki pędzlem tak, aby znajdowały się w jednej warstwie na siatce. UWAGA: Przystąp do obrazowania mikroskopowego i oceń charakterystykę przepuszczalności i żywotności preparatu (patrz krok 4).
   3. Rozwój w komorze ślizgowej
      1. Odwróć komorę suwaka i nałóż małą kroplę smaru próżniowego na obwód otworu. Umieścić 150 μl pożywki z żądaną ilością leku lub toksyny na powierzchni membrany DO w otworze. UWAGA: Powszechnie stosowane są dwa podłoża: sam MBIM lub MBIM/M3 w mieszaninie 50:50, przy czym te ostatnie są bardziej skuteczne w przypadku dłuższych okresów rozwoju.
      2. Przenieś przepuszczalne zarodki do kropli pożywki za pomocą pędzla. Rozproszyć zarodki, sprawiając, że osiądą na błonie w kropli.
      3. Ostrożnie nałożyć okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm na otwór, spłaszczając w ten sposób podłoże. Delikatnie dociśnij wzdłuż obwodu szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć uszczelkę ze smarem. UWAGA: Przejdź do obrazowania mikroskopowego, aby ocenić charakterystykę przepuszczalności i żywotności preparatu (patrz krok 4).

4. Identyfikacja przepuszczalnych żywotnych zarodków

1. Zidentyfikuj przepuszczalne zarodki. Obserwuj zarodki pod wpływem epifluorescencji za pomocą mikroskopu wyposażonego w kamerę cyfrową. Uzyskaj obrazy (w niebieskiej długości fali, aby określić autofluorescencję żółtka profilu) kilku pól za pomocą stałych ustawień mikroskopu i kamery.
2. Określ przepuszczalność zarodków na podstawie względnej intensywności fluorescencji. Użyj mikroskopu stereoskopowego z dużą odległością roboczą, aby pomieścić kosz i umożliwić manipulacje zarodkami. Mikroskop powinien być wyposażony w programowalny stolik X-Y-Z, oświetlenie epifluorescencyjne oraz kamerę cyfrową. Należy zobrazować zarodki, zwracając uwagę na zarejestrowanie parametrów ekspozycji i pozycji zarodka każdego obrazu zarodka, aby umożliwić ponowną ocenę tych samych zarodków w późniejszym okresie czasu (patrz reprezentatywny wynik na rysunku 3). UWAGA: Wzorce wchłaniania barwnika będą się różnić w zależności od użytego barwnika, czasu ekspozycji i wieku zarodka. Typowy jest szeroki zakres wchłaniania barwnika w pojedynczym preparacie i odzwierciedla różnice w stopniu przepuszczalności.
3. Zidentyfikuj zdolne do życia zarodki. Po zaznaczeniu pozycji przepuszczalnych zarodków kontynuuj rozwój zarodka w temperaturze pokojowej lub 25 °C. Zwróć kosz lub komorę szkiełkową do mikroskopu. Obserwować pod wpływem fluorescencji niebieskiego kanału i uzyskać obraz autofluorescencji żółtka we wcześniej zidentyfikowanych przepuszczalnych zarodkach. Oceń żywotność zgodnie z normalnym postępem dystrybucji żółtka (patrz Rand i wsp.¹ i reprezentatywny wynik na rysunku 3). UWAGA: Inne cechy morfologiczne zarodka zaobserwowane za pomocą mikroskopii jasnego pola mogą być wykorzystane do oceny żywotności. Zaleca się, aby ustalenie poziomu przepuszczalności, który jest zgodny z żywotnością, zostało określone empirycznie dla każdego użytego barwnika i szczepu muchy.
4. Oceń działanie leku lub toksyny w przepuszczalnych, żywotnych zarodkach.
5. Zarodki przetworzone zgodnie z powyższym protokołem są gotowe do przeprowadzenia szeregu konwencjonalnych analiz po ekspozycji na lek lub toksynę. W poniższym omówieniu omówiono kilka różnych typów analiz, które obejmują bezpośrednią obserwację morfogenezy w żywych zarodkach, a także analizy barwienia immunologicznego po fiksacji. Oba te podejścia są wzmocnione przez zastosowanie niezbędnych barwników (np. GFP), które ujawniają wzorce ekspresji genów oraz profile linii komórkowych i morfologii.

Urządzenia do obsługi embrionów są przedstawione na rysunku 1, aby pomóc w wizualizacji "domowej roboty" urządzeń do manipulacji w powyższych Protokołach. Wyniki przedstawione na rycinie 2 ilustrują silny wpływ hodowli zarodków w temperaturze 18 °C na ich zdolność do przenikania przez EPS w późnych stadiach rozwoju. Warunek ten jest stosowany w kroku 2.1 protokołu. Skuteczność barwnika kwasu karboksylowego CY5 w ujawnianiu różnych poziomów przepuszczalności zwykle obserwowanych w zarodkach poddanych EPS przedstawiono na rycinie 3. Dynamika rozwojowa rozkładu barwnika w żółtku jest również widoczna na rysunku 3, ujawniając kryterium stosowane do oceny żywotności, jak opisano w kroku 4.2 protokołu. Przydatność barwnika CY5 w określaniu przenikania zarodków po leczeniu toksynami, wiązaniu formaldehydu i barwieniu immunologicznym ilustruje wynik przedstawiony na rycinie 4.

Rysunek 1. Urządzenia do postępowania z zarodkami w metodzie EPS. Kosz z płaskim dnem jest używany w etapach dechorynacji i naświetlania EPS (A,A'). Koszyk rozwojowy służy do dłuższych ekspozycji rozwojowych przepuszczalnego zarodka (B,B'). Komora szkiełkowa służy do krótszych ekspozycji rozwojowych i obrazowania żywych zarodków w wyższej rozdzielczości (C,C'. Zobacz tekst, aby uzyskać więcej informacji).

Rysunek 2. Wpływ starzenia w temperaturze 18 °C na skuteczność EPS u zarodków w późnym stadium rozwoju. Zarodki pobierano przez dwie godziny, a następnie dojrzewano w temperaturze 18 °C przez 20 godzin (panele A-A, B-B) lub w temperaturze 25 °C przez 10 godzin (panel C-C). Zarodki w temperaturze 18 °C zostały następnie poddane dekorionacji i podzielone na dwie próbki. Pierwszą próbkę poddano bezpośredniej obróbce 1 mM barwnikiem rodaminy B w MBIM-T przez 5 minut, przemyto i uwidoczniono w jasnym polu oraz niebieskich i czerwonych kanałach fluorescencyjnych (Panel A-A). Drugą próbkę potraktowano EPS (1:10 w MBIM przez 1 min), przemyto, a następnie potraktowano 1 mM rodaminą B przez 5 minut i umyto przed wizualizacją (Panel B-B"). Zarodki wyhodowane w temperaturze 25 °C poddano dekorionacji i poddano bezpośredniej terapii EPS (1:10 w MBIM przez 1 min), przemyto, a następnie poddano działaniu 1 mM rodaminy B przez 5 minut przed wizualizacją (Panel C-C). Stwierdzono, że zarodki znajdują się w stadium 14 na podstawie fałdów w jelicie ujawnionych przez autofluorescencję żółtka w kanale niebieskim (Panel A', B', C'). Zarodki wyhodowane w temperaturze 18 °C są nieprzepuszczalne przed podjęciem EPS, co widać po braku wychwytu rodaminy B (panel A). Traktowanie zarodków w temperaturze 18 °C EPS zapewnia wysoki stopień przepuszczalności, co widać po wychwytywaniu rodaminy B (Panel B"). Zarodki wyhodowane w temperaturze 25 °C pozostają nieprzepuszczalne nawet po podjęciu leczenia EPS, co widać po wykluczeniu rodaminy B (panel C").

Rycina 3. Włączenie CY5 do przepuszczalnych i zdolnych do życia zarodków. Zarodki pobierano w temperaturze 25 °C przez 2 godziny i dojrzewano przez 14 godzin w temperaturze 18 °C (co odpowiada 7-9 godzinom zarodków w temperaturze 25 °C, stadium 12). Po dechorynacji wykonano obróbkę EPS (1:40 w MBIM przez 1 min), a następnie inkubację w barwniku CY5 (50 μM w MBIM-T przez 15 min). Zarodki przemyto trzykrotnie w MBIM-T i przeniesiono do koszyka rozwojowego z MBIM w zbiorniku. Rozwój pozostawiono na 8 godzin w temperaturze pokojowej. Wychwyt CY5 (czerwony) jest obrazowany w kanale dalekiej czerwieni natychmiast po obróbce barwnikiem i umyciu (Panel A) oraz po 8 godzinach rozwoju (Panel B). Rozkład żółtka jest widoczny przez autofluorescencję w kanale niebieskim. Uważa się, że wchłanianie barwnika, a tym samym przepuszczalność, różni się w zależności od zarodka. Barwnik CY5 (czerwony) lokalizuje się w żółtku (niebieskim), które koncentruje się w świetle jelita na etapie 16 (fioletowy, panel B).

Rysunek 4. Oznaczanie wpływu przepuszczalności i metylortęci w zarodkach utrwalonych i wybarwionych immunologicznie. Zarodki pobierano w temperaturze 25 °C przez 2 godziny i dojrzewano przez 14 godzin w temperaturze 18 °C (co odpowiada 7-9 godzinom zarodków w temperaturze 25 °C, stadium 12). Po dechorynacji przeprowadzono obróbkę EPS (1:40 w MBIM przez 1 min), a następnie inkubację w barwniku CY5 (50 μM w MBIM-T przez 15 min) wraz z metylortęcią (50 μM MeHg, Panel B) lub kontrolą rozpuszczalnika DMSO (0,1% stężenie końcowe, Panel A). Zarodki przemyto MBIM-T i umieszczono w koszu rozwojowym z pożywką MBIM:M3 w zbiorniku i leżakowano przez dodatkowe 8 godzin w temperaturze pokojowej. Zarodki zostały następnie utrwalone w dwufazowym preparacie 4% paraformaldehyd-heptan według standardowego protokołu14. Barwienie przeprowadzono za pomocą anty-fasciclin II (zielony w A,B i biały w A',B') w celu znakowania neuronów ruchowych i przeciwciał anty-elav (czerwony w A, B) w celu znakowania wszystkich ciał komórek neuronalnych. Barwnik CY5 objawia się przez bezpośrednią fluorescencję, która wymaga przedłużonej ekspozycji ze względu na zmniejszoną intensywność fluorescencji spowodowaną utrwaleniem (CY5 jest pseudo-zabarwiony na niebiesko we wszystkich panelach). Efekty MeHg są widoczne w nieregularnym układzie i grupowaniu bocznych ciał komórek neuronów kosmówkowych (elav-dodatnich, oznaczonych na czerwono i oznaczonych białymi strzałkami w B i A). Ponadto charakterystyczne rozgałęzienie segmentowe (SN) (stałe zielone strzałki w A') jest postrzegane jako wysoce zmienne z ekspozycją na MeHg (stałe zielone strzałki w B") zgodnie z wcześniej opisanym wpływem MeHg na zarodek15. Projekcja nerwów międzysegmentowych i segmentowych u ich nasady jest przemieszczona do tyłu wraz z ekspozycją na MeHg (otwarta zielona strzałka w B'). Uwaga: Metylortęć jest silną neurotoksyną. Podczas obchodzenia się z produktem należy zachować ostrożność i nosić rękawice ochronne i okulary ochronne. Utylizacja powinna odbywać się za pośrednictwem instytucjonalnego zakładu i służby bezpieczeństwa środowiskowego.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.