Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51643

⸱

9 lipca 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Paediatrics, Université de Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Streszczenie

Wirus ospy wietrznej i półpaśca (VZV) jest istotną przyczyną zachorowalności i śmiertelności po przeszczepie krwi pępowinowej (UCBT). Z tego powodu profilaktyka przeciwopryszczkowa jest systematycznie stosowana u dzieci biorców UCBT, aby zapobiec powikłaniom związanym z zakażeniem VZV, ale nie ma silnego, opartego na dowodach konsensusu, który określałby jej optymalny czas trwania. Ponieważ odporność zależna od limfocytów T jest odpowiedzialna za kontrolę zakażenia VZV, ocena odtworzenia odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla VZV po UCBT może dostarczyć wskazówek, czy profilaktyka powinna być utrzymana, czy też może zostać przerwana. W tym celu opracowano test immunopunktowy sprzężony z enzymem (ELISpot) swoistego interferonu gamma (IFN-γ) VZV, aby scharakteryzować wytwarzanie IFN-γ przez limfocyty T w odpowiedzi na stymulację in vitro napromieniowaną żywą atenuowaną szczepionką VZV. Test ten zapewnia szybki, powtarzalny i czuły pomiar odporności komórkowej swoistej dla VZV, odpowiedni do monitorowania rekonstytucji swoistej odporności VZV w warunkach klinicznych i oceny odpowiedzi immunologicznej na antygeny VZV.  

Wprowadzenie

Po raz pierwszy wykonany w 1989 roku, UCBT jest coraz częściej stosowany jako część leczenia różnych nowotworowych i nienowotworowych chorób krwi u dzieci1. VZV jest cytopatycznym ludzkim alfaherpeswirusem, który powoduje dwie różne choroby, ospę wietrzną (po pierwotnym zakażeniu) i półpasiec (po reaktywacji). Po pierwotnym zakażeniu VZV utrzymuje się przez całe życie żywiciela, chroniony w nerwach czuciowych zwojów korzenia grzbietowego. Jedno z najgroźniejszych powikłań infekcyjnych po UCBT jest związane z VZV2-4. W naszym ośrodku klinicznym, przy braku profilaktyki VZV, skumulowana częstość występowania choroby VZV VZV po 3 latach od UCBT wyniosła 46%2. U tych pacjentów zakażenie de novo lub reaktywacja VZV jest często związana z trzewnym rozsiewem do ośrodkowego układu nerwowego, płuc i wątroby5-7. W związku z tym profilaktyka acyklowiru, walacyklowiru lub famcyklowiru jest powszechnie stosowana u biorców UBCT8,9. Jednak ta strategia leczenia nie uwzględnia potencjału ochronnego limfocytów T specyficznych dla VZV ani kinetyki odtwarzania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla VZV. Potencjalne problemy związane z coraz powszechniejszym stosowaniem długoterminowej profilaktyki przeciwopryszczkowej obejmują: a) nadmierne leczenie pacjentów; b) rozwój oporności na leki przeciwwirusowe10,11; oraz c) upośledzenie swoistej rekonstytucji immunologicznej VZV12,13. Ponieważ wykrycie funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla VZV koreluje z obecnością długoterminowej ochrony przed zakażeniem VZV i poprawą wyników klinicznych4,14,15, monitorowanie odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek skierowanej przeciwko VZV w okresie po przeszczepieniu może skutkować bardziej racjonalnym stosowaniem leczenia przeciwwirusowego, umożliwiając lekarzom odróżnienie pacjentów, którzy odnieśliby korzyści z profilaktyki VZV od tych, których układ odpornościowy jest w stanie kontrolować VZV Replikacja4,13.

Test ELISpot IFN-γ jest szeroko stosowany do monitorowania odpowiedzi immunologicznych za pośrednictwem komórek w różnych systemach eksperymentalnych i warunkach klinicznych. Plamki powstają po rozszczepieniu podłoża chromogenicznego, generując widoczny i stabilny osad w miejscu reakcji. Każda pojedyncza plamka reprezentuje zatem ślad pojedynczej komórki produkującej cytokiny. IFN-γ ELISpot nie tylko mierzy zdolność poszczególnych komórek ex vivo do wytwarzania IFN-γ w odpowiedzi na stymulację in vitro pokrewnym antygenem, ale także zapewnia oszacowanie częstości odpowiedzi komórek w danej populacji komórek16,17. Oprócz wysokiej czułości, IFN-γ ELISpot jest prosty do wykonania, dzięki czemu możliwe jest jego zastosowanie w kontekście spersonalizowanych protokołów klinicznych mających na celu kierowanie rozpoczęciem lub zaprzestaniem leczenia przeciwwirusowego. Procedura opisana poniżej opisuje test ELISpot, który jest specjalnie zaprojektowany do wykrywania i pomiaru wytwarzania IFN-γ przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej po stymulacji in vitro antygenami pochodzącymi z VZV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół badawczy został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Oceny Etyki CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, gdzie przeprowadzono badanie. Zwrócono się o świadomą zgodę i uzyskano ją od wszystkich uczestników badania, ich rodziców lub opiekunów prawnych. Wszystkie zabiegi wykonywane w dniu 1 i 2 muszą być przeprowadzane w warunkach sterylnych (tj. pod okapem z przepływem laminarnym). Należy ściśle przestrzegać standardowych procedur bezpieczeństwa dotyczących obchodzenia się z krwią ludzką.

1. Powlekanie płyt

  1. Przepuszczalność membran z polifluorku winylidenu (PVDF) na dnie 96-dołkowych białych płytek ELISpot MultiScreen IP poprzez dodanie do każdej studzienki 20 μl 35% etanolu przez 1 min. Membrany powinny stać się lekko przezroczyste.
  2. Natychmiast przemyć studzienki 3 razy 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) za pomocą pipety wielokanałowej lub podobnego urządzenia. Ten etap ma kluczowe znaczenie, biorąc pod uwagę, że pozostałości etanolu mogą wpływać na żywotność komórek i wiązanie przeciwciał wychwytujących. Płytki ELISpot są delikatne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie: nie zaleca się używania automatycznej myjki do płyt.
  3. Pokryć studzienki 10 μl oczyszczonego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego IFN-γ rozcieńczonego w 1x PBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przykryć płytki zwykłą folią spożywczą i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Płyty blokujące

  1. Opróżnij studzienki, stukając je do sucha i umyj płytki 5 razy 200 μl 1x PBS.
  2. Napełnić studzienki 200 μl kompletnej pożywki RPMI 1640 i inkubować płytki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (etap blokowania).
  3. Umyj płytki 5x 200 μl 1x PBS i utrzymuj studzienki pełne 1x PBS, aż komórki będą gotowe do platerowania.

3. Powlekanie i stymulacja komórek

  1. Przygotować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z próbek ludzkiej krwi żylnej przez odwirowanie na gradientach Ficoll-Paque przy użyciu standardowych procedur. Alternatywnie, przy użyciu standardowych metod, rozmrozić podwielokrotności PBMC zamrożone w ciekłym azocie. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w końcowym stężeniu 2 x 106 komórek/ml i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w inkubatorze z płaszczem wodnym.
  2. Wyjąć PBMC z inkubatora i zawiesić je ponownie w końcowej objętości 5 ml kompletnego podłoża RPMI 1640.
  3. Inkubować PBMC w obecności 10 μl genetycznie zmodyfikowanej endonukleazy z Serratia marcescens przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć 50 μl podwielokrotności PBMC i zmieszać z 50 μl barwnika błękitu trypanowego. Policz komórki i oszacuj % żywotności za pomocą hemocytometru i badania mikroskopowego (metoda wykluczania barwnika). Można również stosować różne zautomatyzowane metody zliczania komórek i oceny ich żywotności. PBMC powinien być >95% żywotny. Odrzucić próbkę, gdy żywotność jest niższa niż 95%.
  5. Odwirować PBMC przy 700 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce AIM-V uzupełnionej 2% (v/v) inaktywowaną surowicą ludzką (HIS) o końcowym stężeniu 2 x 106 komórek/ml. Przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu dodania mieszanin stymulujących do płytki.
  6. Dodawać do studzienek, po jednej kropli na raz, 100 μl odpowiedniej mieszanki stymulującej. Należy zastosować trzy mieszaniny stymulacyjne, jak opisano poniżej:
    1. Stosować pożywkę AIM-V uzupełnioną 2% (v/v) inaktywowaną surowicą ludzką (IHS) jako kontrolę ujemną.
    2. Jako kontrolę pozytywną należy zastosować przeciwciało monoklonalne anty-CD3 (klon OKT3) rozcieńczone w pożywce AIM-V uzupełnionej 2% (v/v) IHS do końcowego stężenia 0,5 μg/ml).
    3. Użyć antygenu VZV w postaci napromieniowanej γ (10 000 Gy; 30 min czasu ekspozycji) żywej atenuowanej szczepionki VZV (1 350 jednostek tworzących blaszki [PFU]/ml) rozcieńczonej w stosunku 1:200 w pożywce AIM-V uzupełnionej 2% (v / v) IHS) lub 1 μg równomolowej mieszaniny 67 peptydów (15 reszt aminokwasowych) zsyntetyzowanych na podstawie sekwencji fosfoproteiny VZV (IE63). Kontrolować skuteczność napromieniania poprzez monitorowanie braku widocznych oznak działania cytopatycznego po 4 dniach w hodowlach PBMC.
    4. Przygotuj wszystkie studzienki w dwóch egzemplarzach.
  7. Dodać do studzienek, kropla po kropli, 100 μl komórek przygotowanych w kroku 5.4 do odpowiednich studzienek. Dwie studzienki należy pozostawić bez komórek (kontrola ujemna). Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w inkubatorze z płaszczem wodnym. Nie potrząsać, nie przesuwać ani nie układać płytek jedna na drugiej podczas inkubacji.

4. Rozwój i wykrywanie spotów

  1. Wyrzuć komórki i umyj płytki 10x 1x PBS uzupełnionym 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST). Tween 20 pomaga odłączyć komórki, które przylgnęły do membrany PVDF po całonocnej inkubacji.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl 0,5 mg/ml sprzężonego z biotyną przeciwciała monoklonalnego anty-IFN-γ (4S. B3) rozcieńczony w 1x PBS zawierającym 0,5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować płytki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Przemyć studzienki 6x PBST i dodać do każdej studzienki 100 μl streptawidyny sprzężonej z fosfatazą alkaliczną rozcieńczoną 1:1,000 w 1x PBS zawierającym 0,5% (w/v) BSA. Przykryj płytki i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj płytki 3x PBST i 3x 1x PBS. Dodać 100 μl roztworu substratu 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP)/nitro niebieskiego chlorku tetrazolu (NBT) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj talerze pod bieżącą wodą destylowaną. Zdejmij dolną część płytki ELISpot i umyj obie strony membrany wodą destylowaną. Wysuszyć talerze na powietrzu.
  6. Zbadaj studzienki i zlicz plamy za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego lub zeskanuj płytki za pomocą automatycznego licznika punktowego. Płytki należy trzymać z dala od światła, jeśli nie można ich zbadać tego samego dnia.
    1. Uśrednić liczbę plamek zliczonych w odpowiednich zduplikowanych studzienkach i odjąć liczbę plamek zliczonych w studzienkach kontroli ujemnej (bez komórek) od liczby plamek zliczonych w studzienkach badawczych.
    2. Produkcja IFN-γ wyrażona jest jako liczba jednostek formowania plam (SFU) na 106 PBMC.
    3. Uznać, że badane próbki są dodatnie, jeśli liczba SFU wynosi >50 na 10,6 PBMC i 2 odchylenia standardowe (SD) powyżej kontroli ujemnej (komórki + pożywka AIM-V uzupełniona 2% (v/v) IHS).
    4. Użyj wartości 400 SFU na studzienkę, gdy plam jest zbyt wiele, aby można je było policzyć.
  7. Sprawdź, czy dane ELISpot mają rozkład normalny, czy nie, za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. Gdy dane mają rozkład normalny, należy przeprowadzić porównania statystyczne za pomocą testu t Studenta (2 grupy) lub ANOVA i testu końcowego Bonferroniego (porównania wielokrotne). Jeśli dane nie mają rozkładu normalnego, należy użyć testu U Manna-Whitneya (2 grupy) lub testu Kruskala-Wallisa i testu końcowego Dunna (wielokrotne porównania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany powyżej protokół ELISpot dla IFN-γ został opracowany i zoptymalizowany w naszym laboratorium w celu pomiaru nasilenia i jakości komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko VZV4. W etapie stymulacji można zastosować różnorodne źródła antygenu VZV. Należą do nich: a) dostępne komercyjnie ekstrakty z komórek Vero zakażonych VZV, inaktywowane detergentem18; b) pule nakładających się syntetycznych peptydów z określonych białek kodowanych przez VZV, w tym IE6315 i ORF...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów: Testy IFN-γ ELISpot zostały wykorzystane do zbadania komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko różnym patogenom drobnoustrojów, w tym ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności typu 1 (HIV-1)24,25, wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV)26,27 i Mycobacterium tuberculosis28,29, żeby wymienić tylko kilka. Tutaj opisaliśmy rozwój testu IFN-γ ELISpot do pomiaru odporności komórkowej przeciwko, z nadzieją na zdefiniowanie korela...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować uczestnikom badania i ich rodzicom. Chcielibyśmy również podziękować dr Réjeanowi Lapointe'owi (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) za dostęp do czytnika ELISpot, dr Lubo Alexandrovowi za analizę statystyczną oraz Denisowi Blaisowi, Sandrze Caron, Silvie Valois i Martine Caty za fachową pomoc techniczną. Wspierane przez granty z le Fonds d'opération pour les projets de recherche clinique et d'évalution des technologies (CHU Sainte-Justine) dla H.S. i P.O., przez la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau oraz przez Leukemia & Lymphoma Society of Canada. I.S.F. było wspierane przez stypendia La Fondation CHU Sainte-Justine i le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). A.J.G. był stypendystą Wydziału Mikrobiologii, Zakaźności i Immunologii Université de Montréal (stypendium Gabriel-Marquis), FRQS oraz Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR). N.M. był wspierany przez la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Foundation i FRQS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka LeucocepVWR89048-936/89048-932W zależności od objętości krwi można stosować probówki o pojemności 12 ml lub 50 ml.
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02Chronić przed światłem.
Nukleaza benzonazowaNovagen70746-3Przechowywać w temperaturze -20 °C.
MultiScreenPłytka filtracyjna HTS-IPMilliporeMSIPS4W10sterylna o wielkości porów 0,45 &mikro;m. 
Mysie przeciwciało anty-ludzkie IFN-γ wychwytująceBD Biosciences551221klon NIB42.
Pepmix VZV IE63 JPT Peptide TechnologiesPM-VZV-IE63Rozpuścić zawartość jednej fiolki w 40 i #956; l DMSO. Zużyć w ciągu 6 miesięcy.
Przeciwciało monoklonalne anty-IFN-γ sprzężone z biotynąBD Biosciences554550Klon 4SB3.
Streptawidyna sprzężona z fosfatazą alkaliczną Bio-Rad Life Science170-3554Rozcieńczyć do użycia tego samego dnia.
BCIP/NBTBio-Rad Life Science170-6432Chronić przed światłem.

Bibliografia

  1. Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
  2. Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
  3. Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
  4. Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
  5. Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
  6. Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
  7. Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
  8. Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
  9. Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
  10. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  11. Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
  12. Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
  13. Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
  14. Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
  15. Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
  16. Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
  17. Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
  18. De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
  19. Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
  20. Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
  21. Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
  22. Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
  23. Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
  24. Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
  25. Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
  26. Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
  27. Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
  28. Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
  29. Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
  30. Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
  31. Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
  32. Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  33. Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
  34. Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
  35. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
  36. Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
  37. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  38. Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
  39. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  40. Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
  41. Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
  42. Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
  43. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  44. Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
  45. Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
  46. Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
  47. Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
  48. Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Test ELISpot dla IFN-gammaodpowiedź limfocytów Tstymulacja antygenem VZVdetekcja IFN-gammaizolacja PBMCzliczanie plameklimfocyty T CD4+
Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.