Artykuł metodologiczny

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

47.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51644

⸱

9 sierpnia 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami. Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Streszczenie

Model danio pręgowanego stał się odpowiednim systemem do badania rozwoju, regeneracji i chorób nerek. Zarówno embrionalne, jak i dorosłe nerki danio pręgowanego składają się z jednostek funkcjonalnych znanych jako nefrony, które są wysoce konserwatywne z innymi kręgowcami, w tym ssakami. Badania na danio pręgowanym wykazały niedawno, że po uszkodzeniu dorosłych nefronów zachodzą dwa charakterystyczne zjawiska: po pierwsze, w istniejących nefronach zachodzi silna regeneracja, która zastępuje zniszczone komórki nabłonka kanalików; Po drugie, całkowicie nowe nefrony są wytwarzane z komórek progenitorowych nerek w procesie znanym jako neonefrogeneza. Natomiast ludzie i inne ssaki wydają się mieć tylko ograniczoną zdolność do regeneracji nabłonka nefronu. Do tej pory mechanizmy odpowiedzialne za te zjawiska regeneracji nerek pozostają słabo poznane. Ponieważ dorosłe nerki danio pręgowanego przechodzą zarówno regenerację nabłonka nefronów, jak i neonefrogenezę, stanowią one znakomity paradygmat eksperymentalny do badania tych zdarzeń. Co więcej, w modelu danio pręgowanego dostępnych jest wiele narzędzi genetycznych i farmakologicznych, które można wykorzystać do nakreślenia mechanizmów komórkowych i molekularnych regulujących regenerację nerek. Jednym z istotnych aspektów takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje zestaw technik znakowania, które można wykorzystać do oceny składu nerkowego i badania funkcjonalności nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego. W związku z tym metody te mają szerokie zastosowanie w przyszłej charakterystyce fenotypowej paradygmatów uszkodzenia nerek dorosłego danio pręgowanego, które obejmują między innymi reżimy ekspozycji na nefrotoksyny lub genetyczne metody docelowej śmierci komórek, takie jak technika ablacji komórek za pośrednictwem nitroreduktazy. Co więcej, metody te mogą być wykorzystywane do badania zaburzeń genetycznych w tworzeniu się nerek u dorosłych, a także do oceny stanu nerek podczas modelowania chorób przewlekłych.

Wprowadzenie

Nerka to złożony organ, który spełnia wiele funkcji fizjologicznych w organizmie. Najważniejszą funkcją nerek jest wydalanie produktów przemiany materii, a zadanie to jest ściśle powiązane z utrzymaniem homeostazy płynów. Nerka wykonuje te zadania, filtrując krew i tworząc mocz, jednocześnie regulując ciśnienie krwi, poziom elektrolitów i równowagę kwasowo-zasadową. Wysoce wyspecjalizowane kanaliki nabłonkowe zwane nefronami służą jako podstawowa jednostka funkcjonalna nerki1,2. U dorosłych kręgowców nefrony są zwykle zorganizowane w ciasno zwinięty układ otaczający scentralizowany system drenażowy, co pozwala na upakowanie wielu kanalików w dość małym narządzie. Na przykład każda ludzka nerka może zawierać ponad 1 milion nefronów3. Inne ssaki, takie jak mysz, posiadają około 8-10 tysięcy nefronów na nerkę4. Stopień złożoności nerek różni się między tymi ssakami a innymi kręgowcami ze względu na różnice w całkowitej liczbie nefronów i ich układzie architektonicznym w nerce. Gatunki kręgowców tworzą podczas rozwoju aż trzy kolejne struktury nerkowe, a każda forma wykazuje coraz większą złożoność w odniesieniu do wyposażenia i rozmieszczenia nefronów: pręcze, śródnercze i śródnercze. Ostatnia struktura nerkowa, która ma zostać zachowana, służy jako dorosły narząd nerkowy - zwykle mesonephros lub metanephros2. Każda forma nerkowa ma jednak skład oparty na nefronach2.

Nefron jest koniem pociągowym nerki i jest odpowiedzialny za filtrację krwi wraz z wydzielaniem metabolitów i reabsorpcją. Nefrony są prostymi strukturami rurkowymi składającymi się z komórek nabłonkowych i mają organizację segmentową, w której dyskretne, wysoce wyspecjalizowane domeny zróżnicowanego nabłonka wykonują określone zadania. W kolejności przepływu filtratu przez nefron zazwyczaj występują trzy główne części, które składają się na każdą jednostkę: (1) ciałko nerkowe, (2) kanalik z segmentami proksymalnym, pośrednim i dystalnym oraz (3) przewód zbiorczy1. Kanalik proksymalny jest odpowiedzialny za reabsorpcję substancji rozpuszczonych organicznych, w szczególności glukozy i aminokwasów1. Kanalik pośredni (lub pętla Henlego) jest głównym miejscem regulacji soli i wody1. Wreszcie, dostrajanie soli i innych jonów zachodzi w kanaliku dystalnym i kanale zbiorczym i jest silnie regulowane przez układ hormonalny1. Stamtąd filtrat przemieszcza się przez moczowód i pęcherz moczowy, ostatecznie opuszczając organizm jako produkt odpadowy1.

Utrata funkcji nerek może wynikać z wielu przyczyn, które uniemożliwiają normalną aktywność nefronów. Przyczyny te mogą wystąpić podczas rozwoju nerek, np. wady wrodzone, które prowadzą do wad rozwojowych nefronów5 lub przyczyny wynikające z różnego rodzaju urazów (wynikających zarówno z pochodzenia genetycznego, jak i środowiskowego). Urazy nabyte są szeroko klasyfikowane jako ostre uszkodzenie nerek (AKI) lub przewlekłe uszkodzenie nerek (PChN). AKI wiąże się z nagłą utratą funkcji nerek, często wynikającą z niedokrwienia lub ekspozycji na toksyny6,7. U ssaków naprawa nabłonka nefronów jest możliwa po takich urazach8, a wiele osób wykazuje pełne przywrócenie funkcji nerek po AKI. Jednak AKI wiąże się również z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością, które zgłaszano w szerokim zakresie zachorowalności 30 - 70%6,7. Natomiast PChN wiąże się z postępującą utratą funkcji nerek, która wynika z wieloletniego długotrwałego uszkodzenia, zwykle związanego ze zwłóknieniem8,9. Co więcej, istnieje wzajemne oddziaływanie między AKI i CKD, ponieważ każdy z nich może predysponować osobę do pozostałych10-12. Na przykład ci, którzy cierpieli na AKI, są bardziej podatni na PChN, a nawet na śmierć13. Częstość występowania chorób nerek, zarówno w USA, jak i na całym świecie, osiągnęła rozmiary epidemii i przewiduje się, że będzie rosła wraz ze starzeniem się populacji – w związku z tym istnieje rosnąca potrzeba zidentyfikowania interwencji medycyny regeneracyjnej dla nerek14,15.

Pomimo wiedzy, że pacjenci z AKI mogą wyzdrowieć, od dawna uważano, że nerka jest organem bez wrodzonych zdolności regeneracyjnych. Ten tradycyjny pogląd został w ostatnich latach radykalnie zrewidowany16. Badania nad uszkodzeniem nerek u myszy i szczurów po AKI wykazały, że komórki nabłonkowe kanalików nefronowych mogą się namnażać i odbudowywać funkcjonalne nefrony17-20. Chociaż ssaki posiadają tę adaptacyjną zdolność do regeneracji nefronów, istnieją znaczące ograniczenia i mogą zostać wywołane nieprzystosowawcze reakcje, które prowadzą do zwłóknienia nerek i PChN21. Na przykład niedawne badanie wykazało, że powtarzająca się ablacja komórek nabłonka w mysich nefronach wiązała się ze zmniejszoną regeneracją i zwłóknieniem nerek – co sugeruje, że nefrony mają ograniczony próg regeneracji22. Nie ma dowodów na to, że nerka dorosłego ssaka tworzy nowe nefrony w miejsce utraconych lub uszkodzonych, a zatem ich zniszczenie prowadzi do trwałego deficytu nefronów8,9. Co ciekawe, niektóre kręgowce reagują na AKI poprzez regenerację nabłonka nefronów, a także poprzez wytwarzanie nowych nefronów, proces określany jako neonfrogeneza lub neogeneza nefronów23. Neonefrogeneza zachodzi u ryb po ekspozycji na toksyny lub częściowej resekcji, a modele urazów historycznie obejmowały złotą rybkę24,25, tilapię26, łyżwę27, medakę28, a ostatnio danio pręgowanego29,30. Spośród nich danio pręgowany stanowi realny model badań genetycznych w celu odkrycia szlaków komórkowych i molekularnych odpowiedzialnych za regenerację nerek.

W tym artykule wideo pokazujemy, jak oznaczać segmenty nefronu u dorosłego danio pręgowanego. Wiedza na temat anatomii nefronu, cech molekularnych i cech funkcjonalnych jest niezbędna do udanych przyszłych badań nerek z wykorzystaniem danio pręgowanego. Nerka dorosłego danio pręgowanego jest strukturą mesonefrost i jest z natury mniej złożona pod względem liczby nefronów i organizacji niż struktura metanephros występująca u dorosłych ssaków, ptaków i31. Jednak organizacja segmentów nefronów danio pręgowanego jest analogiczna do ssaków i została po raz pierwszy udokumentowana w embrionalnej nerce na podstawie badań ekspresji genów31-35. Nefrony zarodkowe danio pręgowanego zawierają liniowe segmenty kanalików, które obejmują proksymalny kanalik kręty (PCT), proksymalny kanalik prosty (PST), dystalny wczesny (DE) i dystalny późny (DL) 31-35 (ryc. 1). Dorosłe nefrony danio pręgowanego mają podobne segmenty rurkowe30,31,36,37 (ryc. 1). PCT można również zidentyfikować na podstawie funkcjonalnego fenotypu: komórki nabłonkowe w PCT będą zawierać znakowane fluorescencyjnie związki dekstranu (o wielkości 10-70 kDA) obecne w krążeniu, które zostały wykorzystane zarówno w embrionalnej, jak i dorosłej nerce danio pręgowanego do oceny wychwytu endocytarnego przez te proksymalne komórki kanalików38-41 (Figura 1). Jedną z różnic w segmentach nefronów między danio pręgowanym a ssakami jest to, że danio pręgowany nie ma kanalika pośredniego lub pętli Henle30-37; Ponieważ ten segment funkcjonuje u ssaków w celu oszczędzania wody, a danio pręgowany jest gatunkiem słodkowodnym, który nie ma pilnej potrzeby koncentracji moczu, nie jest zaskakujące, że danio pręgowany nie ma tego segmentu32,33. Tak więc ogólny skład nefronów jest w dużej mierze zachowany między nerką danio pręgowanego a nerką ssaków32,33. Te podobieństwa sprawiły, że danio pręgowany stał się skutecznym narzędziem badawczym do badania funkcji genów wyrażających nerki podczas nefrostenezy rozwojowej32-35,42 oraz do modelowania licznych chorób nerek43,44, dodając w ten sposób do pokaźnej listy schorzeń ludzkich, które można badać za pomocą danio pręgowanego45,46.

Dzisiaj, dorosła nerka danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badań porównawczych regeneracji nerek ze względu na jej genetyczną wykonalność i poszerzające się podniebienie zasobów technologicznych dostępnych do badania funkcji genów i szlaków sygnałowych u tego gatunku. W kilku badaniach wykorzystano mesonephros danio pręgowanego do zbadania mechanizmów regeneracji po AKI29,30,37. Aby kontynuować badania AKI z wykorzystaniem nerki dorosłego danio pręgowanego, niezbędne jest posiadanie doskonałych metod oznaczania różnych regionów nefronu oraz metod badania funkcjonalności nefronów. Kilka metod analizy nerek dorosłych zostało zaadaptowanych z protokołów dotyczących nerek embrionalnych. Dootrzewnowe wstrzyknięcie znakowanego fluorescencyjnie dekstranu u dorosłego danio pręgowanego znakuje nabłonek PCT w nefronach mesonephros poprzez endocytozę30, jak w zarodkach danio pręgowanego38-41 (ryc. 1). Metoda ta została wykorzystana do wizualizacji, kiedy kanaliki proksymalne odzyskują swoje właściwości reabsorbujące po AKI, co umożliwia ocenę przywróconej funkcji fizjologicznej30 (ryc. 1). Inną cechą kanalika proksymalnego nefronu jest to, że komórki nabłonkowe w tym segmencie posiadają obwódkę szczotkową37, która wykazuje wysoki poziom endogennej fosfatazy alkalicznej. W ten sposób nabłonek proksymalny może być zlokalizowany wizualnie w nerce dorosłego danio pręgowanego przy użyciu techniki opartej na fluorescencji, znanej jako ELF-(Enzyme-Labeled Fluorescence)-9747.

Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić testy wychwytu dekstranu fluorescencyjnego30,48 w nerce dorosłego danio pręgowanego, aby uzyskać funkcjonalną ocenę kanalika proksymalnego oraz zmapować rozmiar i kontury tego segmentu kanalika. Następnie opisujemy techniki znakowania proksymalnych obszarów kanalików dorosłego nefronu za pomocą fluorescencyjnej fosfatazy alkalicznej. Po trzecie, po raz pierwszy pokazujemy, że znakowana rodaminą lektyna Dolichos biflorus aglutynina (DBA), która została użyta jako ogólny marker przewodów zbiorczych w nerce ssaków49, oznacza dystalne kanaliki nerki dorosłego danio pręgowanego. Ponieważ DBA wzajemnie wyklucza się z barwieniem fosfatazą alkaliczną, etykiety te umożliwiają szerokie rozróżnienie rozciągnięć pan-proksymalnych i pan-dystalnych dorosłego nefronu danio pręgowanego. Podczas wdrażania tych fluorescencyjnych barwień zarówno w całych sekcjach histologicznych góry, jak i kriostatu, korelujemy te etykiety z domenami ekspresyjnymi genów transportera substancji rozpuszczonej, które jednoznacznie identyfikują każdy segment nefronu. W związku z tym protokół ten zawiera również przewodnik po zmodyfikowanych procedurach przetwarzania tkanek dla analizy hybrydyzacji in situ całych tkanek dorosłych (WISH) w oparciu o nasz protokół WISH50 dla zarodków. Procedury te mogą być stosowane w różnych kombinacjach (ryc. 2) w celu udokumentowania morfologicznych i funkcjonalnych atrybutów nefronów nerkowych dorosłego danio pręgowanego. W związku z tym protokoły te mogą być stosowane w badaniach nad regeneracją, charakterystyką fenotypową innych modeli chorób nerek, a nawet wykorzystywane do badania tworzenia się dorosłej nerki.

Protokół

Procedury pracy z danio pręgowanym opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame. Uwaga: Dostępny jest przewodnik po anatomii nerek i nefronów u danio pręgowanego (ryc. 1). Przegląd metodologii opisanych w niniejszym protokole przedstawiono w postaci schematu blokowego (rysunek 2) w celu zilustrowania, w jaki sposób można przeprowadzić wiele procedur znakowania na tej samej próbce nerki. W części 7 dotyczącej przygotowania WISH do badań nad nerkami u dorosłych, przedstawione tutaj kroki wskazują, jak zmodyfikować przetwarzanie zarodków danio pręgowanego, jak opublikowanoniedawno 50, aby zapewnić techniczny przewodnik dla udanej analizy narządu nerkowego w ramach WISH.

1. Dootrzewnowe wstrzyknięcie dorosłego danio pręgowanego z interesującym dekstranem

  1. Przygotować żądany(-e) substan(-y) dekstranu znakowanego(-e) fluorescencyjnie, rozpuszczając proszek dekstranu w wodzie destylowanej o stężeniu 50 mg/ml, a następnie przechowywać porcje w probówkach do mikrowirówek w temperaturze -20 °C w ciemności. Uwaga: W handlu dostępne są różne dekstransy znakowane fluorescencyjnie. Wybierz dekstran do użycia w oparciu o kombinację innych pożądanych etykiet i upewnij się, że odpowiednie filtry fluorescencyjne są dostępne z mikroskopami, które będą używane. Utrwalany lizyną dextrans wykazuje fluorescencję bez żadnych dalszych etapów znakowania w żywych próbkach, nieutrwalonych próbkach tkanek z próbek poddanych eutanazji i próbkach utrwalonych.
  2. Rozmrozić żądany zapas dekstranu i przechowywać na lodzie w ciemności, wykonując kroki 1,3-1,5. Owiń probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem podczas obsługi.
  3. Znieczulić dorosłego danio pręgowanego w wieku 5-7 miesięcy, umieszczając rybę w naczyniu zawierającym 0,02% trikainy lub 0,001% 2-fenoksyetanolu na około 1-2 minuty. Uwaga: Zaleca się stosowanie dorosłych ryb danio pręgowanego w tym przedziale wiekowym, ponieważ młodsze ryby mogą mieć małe nerki, które są trudne do wycięcia, a próbki nerek starych ryb mogą zawierać masy tkanki bliznowatej, której nie można przeanalizować. Po odpowiednim znieczuleniu dorosły danio pręgowany nie będzie wykazywał reakcji na stymulację dotykową, którą można przetestować za pomocą łyżki lub sondy, aby delikatnie dotknąć płetwy ogonowej ryby.
  4. Za pomocą plastikowej łyżki wyjmij rybę z naczynia, zdekantuj roztwór i ostrożnie umieść zwierzę na mokrej foremce z gąbki, brzuszną stroną do góry.
  5. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 31 g i pojemności 1,0 ml wstrzyknąć 20 μl rozmrożonego roztworu podstawowego dekstranu do przestrzeni dootrzewnowej. Ustawić igłę tak, aby wprowadzenie nastąpiło pod płytkim kątem w brzusznej linii środkowej brzucha. Aby uniknąć nakłucia narządów, należy wprowadzić igłę, a następnie lekko ją podnieść, tak aby unieść ścianę ciała ryby i stworzyć przestrzeń, w którą można wstrzyknąć roztwór dekstranu48. Uwaga: Alternatywnie, dekstran podstawowy może być rozcieńczany, np. w stosunku 1:2 lub 2:1 (dekstran: woda destylowana), w celu zmniejszenia fluorescencji tła w próbce.
  6. Delikatnie włóż rybę z powrotem do zbiornika, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu. Uwaga: Wychwyt dekstranu przez segment kanalików proksymalnych następuje w ciągu 8 - 12 godzin i może być wykryty przez co najmniej do 3 dni po wstrzyknięciu (dpi). Analiza w rozdzielczości 3 dpi zapewnia silny sygnał kanalików o niskiej fluorescencji tła w populacjach zrębu nerkowego. Przejdź do części 2 w celu przeprowadzenia całościowego badania wchłaniania dekstranu w monoterapii, jeśli dodatkowe oznakowanie nie jest pożądane. W przypadku znakowania skojarzonego należy przejść do części 3, aby przygotować tkankę do badania wychwytu dekstranu w całości, a następnie do części 4 do podwójnego znakowania fosfatazą alkaliczną i/lub do części 5, aby przeprowadzić podwójne lub potrójne znakowanie DBA. W przypadku badań z wykorzystaniem skrawków histologicznych przejdź do części 6, aby uzyskać instrukcje dotyczące wykonywania drobnych skrawków nerki za pomocą kriostatu i barwienia ich różnymi znacznikami i/lub immunohistochemią za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych.

2. Sekcja i płaskie przygotowanie nerki dorosłego osobnika danio pręgowanego z nieutrwalonej próbki zwierzęcej w celu wizualizacji fluorescencyjnego znakowania dekstranem kanalika proksymalnego

  1. Poddaj eutanazji dorosłego danio pręgowanego, któremu wstrzyknięto dekstran, umieszczając go w naczyniu o 0,2% pH trikainy 7,0 na 4 - 5 minut. Uwaga: Upewnij się, że ryba została poddana eutanazji przed kontynuowaniem, uważnie monitorując, czy skrzela przestały się poruszać, a serce przestało bić36.
  2. Za pomocą plastikowej łyżki wyjmij rybę z roztworu Trikainy, zdekantuj roztwór i połóż zwierzę na chusteczce lub ręczniku papierowym.
  3. Użyj ostrych nożyczek do preparacji, aby wykonać cięcie za wieczkiem skrzelowym i usunąć głowę.
  4. Natychmiast otwórz ciało ryby nożyczkami preparacyjnymi, wykonując długie brzuszne nacięcie od głowy do podstawy płetwy ogonowej.
  5. Usuń narządy wewnętrzne ryby za pomocą cienkich kleszczy.
  6. Użyj bardzo cienkich igieł do preparowania, aby rozciąć ściany ciała, aby umożliwić wizualizację narządu nerkowego, który przylega do ściany grzbietowej zwierzęcia.
  7. Użyj cienkich kleszczy, aby odłączyć nerkę od ściany grzbietowej.
  8. Delikatnie umieść nerkę w 5 ml szklanej fiolce zawierającej 1X PBS i przemyj 3 razy 3 - 5 ml świeżego 1X PBS przez 5 minut każda. Uwaga: Użycie szklanej fiolki do manipulowania próbkami nerek dorosłych ułatwia wizualizację tkanki i pozwala na przemywanie dużymi objętościami (w stosunku do masy tkanki) wynoszącymi około 3 - 5 ml. Alternatywnie można użyć 12-dołkowego naczynia do hodowli komórkowych. Podczas gdy można użyć plastikowej probówki do mikrowirówki, probówki o standardowym rozmiarze (1,5 ml) mogą ograniczać mycie.
  9. Usunąć nerkę za pomocą pipety transferowej i umieścić na czystym szkiełku podstawowym z 1-2 kroplami 1X PBS .
  10. Użyj cienkich kleszczy, aby spłaszczyć nerkę na szkiełku, upewniając się, że żadna tkanka nie zwinęła się ani w inny sposób nie przewróciła się na siebie. Uwaga: Alternatywnie można użyć narzędzia z drutu wolframowego do wykonania małych nacięć w tkance łącznej, aby ułatwić płaskie ustawienie nerki.
  11. Umieść małe kawałki plasteliny na każdym rogu szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm i powoli umieść szkiełko nakrywkowe na nerce. Uwaga: Podczas umieszczania szkiełka nakrywkowego należy lekko pochylić, aby zminimalizować uwięzienie pęcherzyków powietrza w roztworze50. Wgłębienia z plasteliny mają średnicę około 2 mm (ryc. 2A). Alternatywnie, zamiast plasteliny można zastąpić wgłębienia smaru próżniowego. Dodaj dodatkową kroplę 1X PBS, aby w razie potrzeby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym.
  12. Obserwuj i/lub zobrazuj nerkę, umieszczając szkiełko w polu view na mikroskopie stereoskopowym lub mikroskopie złożonym z odpowiednim filtrem. Uwaga: Patrz rysunek 2A, aby zapoznać się z makroskopowym wyglądem tego preparatu do szkiełek.

3. Utrwalenie, rozwarstwienie, przepuszczalność i usuwanie pigmentacji nerki dorosłego danio pręgowanego

  1. Przygotować świeży roztwór utrwalający 4% paraformaldehydu (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO lub rozmrozić zamrożoną porcję 4% PFA/1 X PBS i dodać 0,1% DMSO. Ostrzeżenie: PFA jest toksyczny, a roztwory PFA należy obchodzić się z kapturem chemicznym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic i fartucha laboratoryjnego. Ponadto z proszkiem PFA należy obchodzić się ostrożnie podczas przygotowywania roztworu podstawowego.
  2. Napełnij tacę sekcyjną roztworem utrwalającym w ilości wystarczającej do zanurzenia całego zwierzęcia.
  3. Poddaj eutanazji wybranego danio pręgowanego i umieść go w roztworze utrwalającym (patrz kroki 2.2-2.6). Uwaga: Wybrana ryba może być nieleczoną próbką nerki danio pręgowanego lub nerką wyizolowaną od danio pręgowanego, która wcześniej otrzymała dootrzewnowe wstrzyknięcie dekstranu (część 1).
  4. Ustalić próbkę O/N (12–16 godzin) w temperaturze 4 °C.
  5. Następnego dnia za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie odłącz nerkę od grzbietowej ściany ciała i umieść narząd w szklanej fiolce za pomocą pipety transferowej. Uwaga: Alternatywnie można użyć 12-dołkowego lub 24-dołkowego naczynia do hodowli. Podczas gdy można użyć plastikowej probówki do mikrowirówki, probówki o standardowym rozmiarze (1,5 ml) mogą ograniczać mycie.
  6. Umyj wypreparowaną nerkę 3 razy za pomocą 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy.
  7. Usunąć 1X PBS za pomocą 0,05% Tween i płukać nerkę 3 ml 5% roztworu sacharozy (w 1X PBS) przez 30 minut.
  8. Zastąp 3 ml 30% roztworu sacharozy (w 1X PBS) i przechowuj O/N (12 - 16 godzin) w temperaturze 4 oC. Uwaga: Roztwory sacharozy przenikają przez błony komórkowe, umożliwiając następnie specyficzne znakowanie odczynników podczas ich wnikania do tkanki.
  9. Następnego dnia usuń 30% roztwór sacharozy i przemyj nerkę 2 razy 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy.
  10. Zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3 - 5 ml roztworu wybielającego, aby usunąć pigmentację melanocytów obecną na narządzie nerkowym.
  11. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i uważnie obserwuj, jak pigmentacja znika. Uwaga: Depigmentacja trwa zazwyczaj około 20 minut, gdy jest wykonywana po leczeniu sacharozą, ale czasami może trwać nawet 60 minut. Jeśli roztwór wybielający pozostanie na nerce zbyt długo, może dojść do rozpadu narządu; Zaleca się monitorowanie próbki co 10-15 minut w celu sprawdzenia integralności tkanek.
  12. Po usunięciu pigmentacji z nerki przemyć dwukrotnie 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween.
  13. Zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3 - 5 ml 4% roztworu PFA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  14. Usuń 4% roztwór PFA i przemyj nerkę 3 razy 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy. Uwaga: Po zakończeniu fiksacji, nerkę można również zamontować na szklanym szkiełku i ocenić pod kątem wychwytu dekstranu bez pigmentacji melanocytów, wykonując kroki 2.8-2.12.
  15. Usunąć 1X PBS z 0,05% Tween i zastąpić 3 - 5 ml roztworu blokującego, a następnie inkubować nerkę w temperaturze RT w bloku przez 2 godziny.
  16. Po zakończeniu blokowania przejdź bezpośrednio do wybranego protokołu barwienia. Uwaga: Nerka może być teraz przetworzona przez jedną lub więcej innych procedur w celu przeprowadzenia badań znakowania z różnymi odczynnikami. W celu znakowania całego mocowania kanalika proksymalnego tylko fosfatazą alkaliczną, przejdź do sekcji 4. Aby oznaczyć całe mocowanie tylko dystalnego kanalika, przejdź do sekcji 5. Alternatywnie, sekcje 4 i 5 mogą być wykonywane w kolejności liniowej w celu podwójnej detekcji w całym mocowaniu.

4. Oznaczanie segmentów kanalików proksymalnych dorosłej nerki za pomocą wykrywania fosfatazy alkalicznej

  1. Usuń blok i umyj nerkę 3 razy 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy, a następnie zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3 - 5 ml 1X PBS. Pozwól nerce moczyć się przez co najmniej 10 minut. Uwaga: W tym czasie przenieś nerkę do 12-dołkowego lub 24-dołkowego naczynia hodowlanego, jeśli tkanka była przechowywana w szklanej fiolce do poprzednich etapów przetwarzania.
  2. Zastąp 1X PBS wystarczającą ilością roboczego roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (patrz zestaw detekcyjny znajdujący się w Tabeli materiałów), aby pokryć próbkę, a następnie umieść próbkę na rotatorze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Utrzymuj próbkę przed światłem.
  3. Zatrzymaj reakcję, przemywając nerkę w roztworze buforowym do przemywania fosfatazy alkalicznej.
  4. Przepłukać nerkę 3 podmianami roztworu buforowego do przemywania przez 10 - 15 minut. Uwaga: Po tym kroku przejdź bezpośrednio do części 5, kroku 5.1 (tymczasowo pomijając kroki 4.5-4.6), jeśli pożądane jest również etykietowanie za pomocą DBA. Opcjonalny krok: Aby oznaczyć i uwidocznić jądra komórkowe w narządzie, namocz nerkę w roztworze jodku propidyny. Przygotować wywar z jodku propydyny, rozpuszczając proszek w stężeniu 1 mg/ml (1,5 mM) w wodzie destylowanej. Rozcieńczyć materiał do 500 nM w 2X SSC i inkubować nerkę w tym roztworze przez 30 minut. Spłucz 1X PBS i przejdź do kroku 4.5.
  5. Usunąć roztwór buforowy do przemywania i zamontować nerkę na czystym szkiełku podstawowym w podłożu montażowym fosfatazy dołączonym do zestawu do etykietowania (patrz kroki 2.9-2.12). Uwaga: Nośnik montażowy zastąpił 1X PBS z kroku 2.9.
  6. Wizualizacja nerki wybarwionej fosfatazą alkaliczną za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu złożonego z zestawem filtrów Hoechst/DAPI. Uwaga: Opcjonalny krok: Wizualizuj jodek propidyny za pomocą filtra tetrametylo-rodaminy (TRITC) lub czerwonego filtra Texas.

5. Wyznaczanie segmentów dystalnych kanalików nerkowych dorosłych za pomocą rodaminy DBA

  1. Przygotować 200 μl roboczego roztworu DBA, rozcieńczając DBA (2 mg/ml) w stosunku 1:100 w 1X PBS.
  2. Zastąp 1X PBS roztworem Tween 0,05% roztworem 200 μl DBA.
  3. Umieść na rotatorze na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń roztwór DBA i przemyj nerkę 3 razy 3 - 5 ml 1X PBS przez 5 minut każdy. Uwaga: Opcjonalny krok: Aby oznaczyć i uwidocznić jądra komórkowe w narządzie wraz z etykietą DBA, namocz nerkę w roztworze DAPI w celu wykrycia za pomocą filtra Hoechst / DAPI (barwienie rodaminą DBA można wykryć za pomocą czerwonego filtra TRITC lub Texas). Przygotować wywar DAPI, rozpuszczając proszek w stężeniu 5 mg/ml (14,3 mM). Rozcieńczyć materiał do 300 nM w 2X SSC i inkubować nerkę w tym roztworze przez 20 minut. Spłucz 1X PBS i przejdź do kroku 5.5. Jeśli przeprowadzono przetwarzanie części 4, należy pamiętać, że zarówno DAPI, jak i fosfataza alkaliczna są wykrywane za pomocą filtra Hoechst/DAPI.
  5. Wyjmij 1X PBS i zamontuj nerkę na czystym szklanym szkiełku podstawowym (patrz kroki 2.9-2.12).
  6. Wizualizuj dystalne segmenty nerki barwione przez DBA za pomocą standardowego filtra TRITC lub czerwonego filtra Texas ustawionego na fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym lub mikroskopie złożonym. Uwaga: Opcjonalny krok: Wizualizacja DAPI za pomocą filtra Hoechst/DAPI.

6. Osadzanie, kriosekcja i barwienie (barwniki życiowe i znakowanie immunohistochemiczne) tkanki nerkowej dorosłego danio pręgowanego

  1. Wybierz ryby do analizy, a następnie poddaj je eutanazji, utrwaleniu i przepuszczalności zgodnie z opisem (kroki 3.2-3.8). Uwaga: Utrwal dorosłe ryby w 9:1 etanolu: formaldehyd / 0,1% DMSO zamiast 4% paraformaldehydu / 1X PBS / 0,1% DMSO do procedury kriosekcji w celu wytworzenia skrawków dla dekstranu, fosfatazy alkalicznej i wizualizacji DBA. Należy jednak pamiętać, że utrwalenia na bazie paraformaldehydu mogą być kompatybilne z niektórymi procedurami immunohistochemicznymi. Co więcej, wybielanie dorosłej nerki nie jest potrzebne do analizy kriosekcji, ponieważ melanocyty są powierzchowne i nie wpływają na wizualizację komórek nefronowych, które stanowią "wnętrze" narządu nerkowego.
  2. Następnego dnia usuń 30% roztwór sacharozy i zastąp go pożywką do zamrażania tkanek w stosunku 1:1: 30% sacharozy przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć roztwór w stosunku 1:1 i zanurzyć próbki nerek w 100% pożywce do zamrażania tkanek w krioformach i umieścić w temperaturze -80 oC na co najmniej 1 godzinę.
  4. Poprzecznie przecięte odcinki szeregowe o grubości około 12 μm przez całą dorosłą nerkę.
  5. Zamrożone kriosekcje zamontować na samoprzylepnych szkiełkach mikroskopowych i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze 50 oC.
  6. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 oC do czasu użycia.
  7. Gdy kriosekcje są gotowe do znakowania, wyjmij szkiełka mikroskopowe z -80 oC i umieść na szkiełku podstawowym w temperaturze 50 oC na 45 minut.
  8. Za pomocą pisaka blokującego płyn narysuj okrąg wokół kriosekcji i pozostaw do wyschnięcia na 15 minut na szkiełku podstawowym w temperaturze 50 oC.
  9. Wyjmij szkiełka z podgrzewacza do szkiełek i umieść je płasko w komorze wilgotnościowej o temperaturze pokojowej.
  10. Ponownie uwodnić kriosekcje, dodając 1X PBS z 0,05% Tween do zakreślonej części szkiełek przez 20 minut. Uwaga: Potrzeba około 200 - 300 μl, aby pokryć każdą zakreśloną część na szkiełku.
  11. Zastąp 1X PBS 0,05% roztworem Tween na świeży 1X PBS i inkubuj przez 10 minut.
  12. Usuń 1X PBS i inkubuj kriosekcje w roztworze blokującym przez 2 godziny. Uwaga: Aby uzyskać 10 ml roztworu blokującego, połącz 8 ml 1X PBS z 0,05% Tween, 2 ml płodowej surowicy cielęcej i 150 μl DMSO. Aby przeprowadzić immunohistochemię po etapie blokowania, inkubować szkiełko z pożądanym przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w świeżym bloku O/N w temperaturze 4 oC, przemyć raz przy użyciu 1X PBS z 0,05% Tween, inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z drugorzędowym roztworem przeciwciała rozcieńczonym w 1X PBS z 0,05% Tween, przemyć raz przy użyciu 1X PBS z 0,05% Tween, i zamontować szkiełko nakrywkowe na szkiełku z medium montażowym. Wymagane rozcieńczenia przeciwciał będą się różnić i należy przeprowadzić próby w celu wyboru optymalnych rozcieńczeń. Pobieranie antygenu może również ułatwić znakowanie immunologiczne i jest wykonywane przed zablokowaniem. Natychmiast po rozmrożeniu szkiełek w temperaturze 50 oC (krok 6.8) inkubować kriosekcje w temperaturze 95 oC -100 oC przez 40 minut w podgrzanym 10 mM buforze cytrynianu sodu. Schłodzić szkiełka przez 30 minut, a następnie umyć dwukrotnie w 1X PBS z 0,05% Tween i przejść do kroku 6.11.
  13. Usuń roztwór blokujący i przemyj kriosekcje 3 razy 1X PBS przez 5 minut każda.
  14. Zastąp 1X PBS roztworem barwiącym DBA i inkubuj przez 1 godzinę. Uwaga: Rozcieńczyć 1 μl DBA w 99 μl 1X PBS, aby uzyskać 100 μl roztworu barwiącego.
  15. Usuń roztwór barwiący DBA i przemyj kriosekcje 3 razy 1X PBS przez 5 minut każda.
  16. Nałożyć etykietę fosfatazy alkalicznej i inkubować na kriosekcji przez 10 minut.
  17. Zmyć fosfatazę alkaliczną z kriosekcji serią 3 płukań buforem do przemywania przez 10 minut każde. Uwaga: Aby uzyskać 100 ml roztworu buforu do mycia, połączyć 5 ml 0,5 M EDTA i 120 mg lewamizolu w 95 ml 1X PBS. Aby oznaczyć jądra, należy inkubować skrawki z jodkiem propidyny lub DAPI w poprzednio zanotowanych rozcieńczeniach (odpowiednio kroki 4.4, 5.4) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wybrać barwnik jądrowy zgodny z kombinacją innych wybranych barwników fluorescencyjnych.
  18. Usuń cały płyn z kriosekcji i umieść 2 krople podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym.
  19. Ostrożnie umieść mikro szkło nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym. Kriosekcje są teraz gotowe do obrazowania z odpowiednimi filtrami.

7. Przetwarzanie WISH dla próbek nerek dorosłych danio pręgowanego

  1. Wybierz żądaną okazę (próbki) danio pręgowanego, poddaj eutanazji, naprawij i wypreparuj nerkę zgodnie z opisem (kroki 3.1-3.5). Uwaga: Konieczne jest użycie roztworu utrwalającego 4% paraformaldehydu (PFA) / 1X PBS z 0,1% DMSO w celu przepuszczalności nerek. Umieść nerkę w szklanej fiolce, aby ułatwić wizualizację podczas kolejnych etapów przetwarzania.
  2. Usunąć utrwalacz i dwukrotnie przemyć nerkę 5 ml 1X PBST.
  3. Usunąć 1X PBS i dwukrotnie umyć nerkę 100% metanolem, a następnie inkubować nerkę w temperaturze -20 oC przez co najmniej 20 minut, aby uzyskać przepuszczalność. Uwaga: Wypreparowane nerki mogą być przechowywane w nieskończoność -20 oC.
  4. Nawodnij nerki, wykonując serię 5-minutowych płukań 3 - 5 ml 50% metanolu/1X PBST, 30% metanolu/1X PBST i dwukrotnie 1X PBST.
  5. Wybielaj nerkę, aby usunąć pigmentację zgodnie z opisem (kroki 3.10-3.14).
  6. Potraktować nerkę 10 μg/ml proteinazy K/1X PBST 0,1% DMSO przez 20 minut, następnie przepłukać dwukrotnie 1X PBST i po utrwaleniu w 4% PFA/1X PBST przez 20 minut do O/N. Uwaga: Zawsze przygotowywać roztwór roboczy proteinazy K bezpośrednio przed trawieniem próbki, łącząc 50 μl świeżo rozmrożonej proteinazy K (10 mg/ml), 50 ml 1X PBST i 50 μl DMSO.
  7. Przetwarzaj nerkę pod kątem pojedynczego lub podwójnego WISH, postępując zgodnie z etapami syntezy rybosondy, prehybrydyzacji, hybrydyzacji, inkubacji i wykrywania przeciwciał anty-digoksygeninowych/anty-fluorosceinowych, jak opisano niedawno49. Uwaga: Obrazowanie całego mocowania plam nerkowych powinno być wykonane w ciągu kilku dni od przeprowadzenia reakcji barwienia. Plamy nefronu mają tendencję do bardzo szybkiego blaknięcia, zwłaszcza czerwone etykiety podłoża. W przypadku fotografii nefronowej należy zamontować próbkę nerki na płasko, jak opisano powyżej w krokach od 2.10 do 2.12, a następnie wykonać zdjęcie za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego. Różnicowe interferencyjne filtry kontrastowe mogą być stosowane do lepszej wizualizacji konturów komórkowych nefronów w celu ułatwienia analizy próbki.

Wyniki

Każdy z protokołów został przeprowadzony na danio pręgowanym typu dzikiego. Przykłady uzyskanych danych dokumentują prawidłowy skład strukturalny i właściwości nefronów w zdrowej nerce dorosłego osobnika danio pręgowanego. Dorosły danio pręgowany posiada mezonefros, czyli drugą formę nerki, która znajduje się na grzbietowej ścianie ciała (Rycina 1A). Nerka dorosłego osobnika jest stosunkowo płaska i składa się z tzw. obszaru głowy, tułowia i ogona, z rozproszonymi w tych regionach powierzchownymi melanocytami (Rycina 1A). Tkanka nerkowa zawiera rozgałęzione układy nefronów, które łączą się i odprowadzają mocz do centralnych cewek zbiorczych (Rycina 1A). Każdy nefron jest spolaryzowany wzdłuż swojej długości, z filtrem krwi (lub ciałkiem nerkowym) na jednym końcu, po którym następuje seria segmentów kanalikowych, a na końcu cewka zbierająca roztwór przeznaczony do wydalenia (Rycina 1A). Każdy kanalik nefronu u dorosłego osobnika zawiera proksymalne i dystalne segmenty komórek, wyznaczone przez ekspresję specyficznych transporterów substancji rozpuszczalnych30,31,36,37, co jest zgodne z wzorcem segmentacji występującym w nefronach embrionalnych31-35 (Rycina 1B). Na przykład transkrypty cubilin znakują kanalik proksymalny39 (PCT i PST), a transkrypty clcnk znakują kanalik dystalny32 (DE i DL) (Rycina 1B). Ponadto segment PCT wyróżnia ekspresja slc20a1a, segment PST wyróżnia ekspresja slc13a1, segment DE wyróżnia ekspresja slc12a1, a segment DL wyróżnia ekspresja slc12a332 (Rycina 1B). Różnice między kanalikami nefronów dorosłych a embrionalnymi polegają na tym, że segmenty dystalne wykazują sfałdowania (DE, DL), a segment DL u dorosłych osobników silnie się rozgałęzia, co odróżnia go od liniowej, nierozgałęzionej anatomii tych obszarów w embrionie30,31,36,37 (Rycina 1A). Zarówno w kanalikach nefronów dorosłych30, jak i embrionalnych38-41 , nabłonek PCT można rozpoznać dzięki jego właściwościom endocytarnym; można go wizualizować i oceniać pod kątem funkcji reabsorpcyjnej na podstawie zdolności do wychwytu koniugatów dekstranu fluorescencyjnego (Rycina 1B). Ponadto, jak pokazano na kolejnych rysunkach, dorosły kanalik proksymalny (PCT i PST, czyli obszar pan-proksymalny) jest znakowany fosfatazą alkaliczną, podczas gdy kanalik dystalny (DE i DL, czyli obszar pan-dystalny) jest znakowany DBA (Rycina 1B). Metody wykorzystane w niniejszej pracy do znakowania segmentów nefronów dorosłego danio pręgowanego z użyciem wychwytu dekstranu, fosfatazy alkalicznej, DBA, immunohistochemii lub WISH mogą być wykonywane w różnych kombinacjach, w preparatach całych (whole mount) lub na przekrojach histologicznych tkanki nerkowej (Rycina 2). Pozwala to na dużą elastyczność i różnorodność podczas oceny składu nefronów (Rycina 2).

Dorosłą nerkę można zamocować płasko na szkiełku przedmiotowym w celu analizy, używając wgłębień w plastelinie (lub alternatywnie smarze próżniowym), aby zawiesić szkiełko nakrywkowe nad tkanką (Rysunek 3A). Ponieważ typowa długość nerki wynosi około 5-7 mm, posiada ona rozmiar sprzyjający obrazowaniu za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego (Rysunek 3A). W oświetleniu w polu jasnym można zaobserwować powierzchowną populację melanocytów z czarnym pigmentem w obrębie tkanki nerek, a także naczynia krwionośne, takie jak aorta, ze względu na czerwony odcień krążących erytrocytów (Rysunek 3B). Po domięśniowym wstrzyknięciu dextranu-FITC, domeny PCT zlokalizowane w całym mezonefrosie były nadal znakowane po 3 dniach i obrazowane przy użyciu filtra FITC w mikroskopie fluorescencyjnym (Rysunek 3C). Chociaż melanocyty częściowo utrudniają wizualizację poszczególnych kanalików nerkowych (Rysunek 3C’), nie uniemożliwiają one ilościowego określenia liczby nefronów ani oceny średnicy i długości kanalików. Po domięśniowym wstrzyknięciu fluoro-ruby dextranu, wybielanie utrwalonej próbki usunęło pigmentację melanocytów, a segmenty PCT zaobserwowano przy użyciu samego oświetlenia w polu jasnym (Rysunek 3D). Krople lipidów z jamy brzusznej mogą być czasem widoczne w preparatach całych organów nerek (Rysunek 3A). Pojedyncze segmenty PCT wykazują sploty i zwoje (Rysunek 3D’), ale mogą być również charakteryzowane przez stosunkowo liniowe odcinki (Rysunek 3D”).

Różne koniugaty dekstranu zapewniały różny poziom ogólnej przejrzystości znakowania kanalików bliższych. W szczególności dekstran-FITC lub dekstran fluoro-ruby prowadziły do wyraźnego znakowania nefronów przy minimalnym tle (Rysunki 3C-D). Oba koniugaty, dekstran cascade blue oraz lucifer yellow, wykazały pobieranie przez kanalik bliższy w dorosłej nerce (Rysunek 4A, 4B). Co ciekawe, nerki poddane działaniu dekstranu cascade blue wykazały stosunkowo specyficzną fluorescencję PCT z niewielkim tłem (Rysunek 4A, 4A’), podczas gdy nerki poddane działaniu dekstranu lucifer yellow miały oznakowane segmenty PCT, ale wykazywały zauważalny sygnał tła, z niespecyficznym barwieniem fluorescencyjnym obecnym w całym zrębie nerkowym, czyli przestrzeni między nefronami (Rysunek 4B, 4B’). Wreszcie, zastosowanie dekstranu-fluoro ruby zapewniło najwyższą jakość znakowania kanalików bliższych, z minimalnym lub brakiem tła, nawet przy różnych powiększeniach (Rysunek 4C, 4C’). We wszystkich przypadkach charakterystyczny wzorzec pobierania koniugatu dekstranu przez kanaliki korelował z ekspresją transkryptów kodujących slc20a1a, uznanego markera specyficznego dla PCT, wykazaną w badaniu WISH30-32 (Rysunek 4D). Segmenty PCT nefronów barwione antysensowną sondą rybo- nukleotydową slc20a1a wykazały s-kształtne sploty PCT, a także mniej wyraźnie zwinięte segmenty PCT (Rysunek 4D’), co zaobserwowano również podczas analiz z użyciem znakowanych koniugatów dekstranu (Rysunek 3D’, 3D”).

Inne preparaty nerek, takie jak wykrywanie aktywności fosfatazy alkalicznej w kanalikach krętych bliższych (Rycina 5A, 5B, 5C), wykonano w podobny sposób po usunięciu pigmentacji melanocytów. Umożliwiło to obrazowanie i analizę nefronów w obrębie kanalików krętych bliższych bez żadnych przeszkód. Endogenna reaktywność fosfatazy alkalicznej w nefronie jest jedną z głównych cech charakterystycznych kanalików krętych bliższych1,47. Barwienie na fosfatazę alkaliczną jest wysoce specyficzne dla obszarów bliższych nefronu w porównaniu do pan-proksymalnego wzorca ekspresji genu cubilin metodą WISH39 (Rycina 5D, 5D’). Reaktywność fosfatazy alkalicznej była najintensywniejsza w pierwszym odcinku kanalików krętych bliższych odpowiadającym PCT (Rycina 5B), podobnie jak wzorzec ekspresji cubilin (Rycina 5D, 5D’), który również wykazywał najwyższe względne poziomy transkrypcji w PCT. PCT wyróżniała się nieco większą średnicą, specyficzną ekspresją czynnika transkrypcyjnego mafba (Rycina 5E, 5E’) oraz specyficzną ekspresją genu transportera substancji rozpuszczonych slc20a1a (Rycina 4D, 4D’). Reaktywność fosfatazy alkalicznej znakowała również odcinek kanalików krętych bliższych o mniejszej średnicy, odpowiadający segmentowi PST (Rycina 5B), na podstawie porównania z segmentowo specyficzną ekspresją transkrypcji genu transportera substancji rozpuszczonych slc13a1 (Rycina 5F, 5F’). Domeny ekspresji WISH markera PCT slc20a1a oraz markera PST slc13a1 są wzajemnie wykluczające się (Rycina 5G), a szczegółowa analiza pojedynczych nefronów wykazała, że odpowiednie domeny te graniczą ze sobą, przy minimalnej lub żadnej przerwie między nimi, i że wspólnie odtwarzają domenę ekspresji cubilin (czarne groty strzałek na Rycina 5G’, 5G”, 5G”’).

Aby dodatkowo potwierdzić związek reaktywności fosfatazy alkalicznej z tożsamością kanalików bliższych, przeprowadzono wspólne znakowanie preparatów całych organów na obecność fosfatazy alkalicznej w nerkach ryb zebrafish, którym 3 dni wcześniej podano doprzewnowiczowy zastrzyk dekstranu fluoro-ruby (Ryc. 6A-C). Dekstran fluoro-ruby wykazał nakładanie się z fosfatazą alkaliczną jedynie w części o większej średnicy obszaru kanalików bliższych, co odpowiada PCT (przykłady na Ryc. 6D-I). Obszar pozytywny pod kątem dekstranu gwałtownie kończył się w miejscu, gdzie średnica kanalika bliższego uległa zmniejszeniu, t.j. tam, gdzie PCT i PST się łączą (białe groty strzałek na Ryc. 6), a w kolejnym segmencie PST obserwowano wyłącznie reaktywność fosfatazy alkalicznej (przykłady na Ryc. 6D-I). Fluorescencja tła z reakcji fosfatazy alkalicznej słabo obrysowywała również parę równoległych głównych dróg przewodów zbierających występujących w nerce dorosłych osobników29,30 — przewodów tych, które wyróżniają się największą średnicą spośród wszystkich cewek związanych z nerkami (asteryski na Ryc. 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). Następnie w analizie krioprzekrojów obserwowano wspólne znakowanie kanalików nefronowych na obecność fosfatazy alkalicznej oraz pobór dekstranu (Ryc. 6J, obwody kanalików obrysowane białymi kropkami). W przekroju poprzecznym reaktywność fosfatazy alkalicznej odnotowano w postaci grubego pasma na powierzchni apikalnej nabłonka kanalikowego, co jest zgodne z ultrastrukturą rąbka szczoteczkowego, podczas gdy w odpowiadającej im przestrzeni cytozolowej komórek kanalikowych stwierdzono reaktywność na dekstran fluoro-ruby (Ryc. 6J). Co istotne, barwione kanaliki były albo podwójnie pozytywne pod kątem fosfatazy alkalicznej i dekstranu, co pozwoliło na ich zidentyfikowanie jako segmenty PCT, albo pojedynczo pozytywne pod kątem fosfatazy alkalicznej (Ryc. 6J, obwód kanalika obrysowany żółtymi kropkami), co pozwoliło na identyfikację jako segment PST (uwaga: pozostałe obecne kanaliki były negatywne dla obu barwień, dane nie zostały przedstawione) (Ryc. 6J). Ponadto barwienie fosfatazą alkaliczną (Ryc. 6K) skutecznie połączono z markerem jądrowym, jodkiem propidynyum (Ryc. 6L), co ułatwiło liczenie komórek (nałożenie obrazów na Ryc. 6M).

Dalsza część kanalików nerkowych u dorosłych danio pręgowanych została oznakowana DBA sprzężonym z rodamyną (Ryc. 7). Podwójne znakowanie całych preparatów za pomocą DBA i fosfatazy alkalicznej przeprowadzono na nerkach danio pręgowanych typu dzikiego (Ryc. 7A-C). Reaktywność DBA i fosfatazy alkalicznej nie wykazała nakładania się w kanalikach nefronów (Ryc. 7D-H). Kanaliki zabarwione DBA wykazywały wyraźnie mniejszą średnicę w porównaniu z kanalikami dodatnimi pod względem fosfatazy alkalicznej, a kanaliki DBA były często rozgałęzione (białe groty strzałek, Ryc. 7G, 7H, 7J), podczas gdy rozgałęzień nigdy nie zaobserwowano w segmentach kanalików zabarwionych fosfatazą alkaliczną. Krioprzekroje nerek pobrano od danio pręgowanych typu dzikiego niosących transgen, w którym promotor enpep steruje ekspresją eGFP (Tg:enpep:eGFP), ponieważ GFP znakuje zarówno proksymalne, jak i dystalne kanaliki nefronów51 (Ryc. 7I). Przeprowadzono immunohistochemię w celu wykrycia GFP, aby oznakować wszystkie kanaliki nerkowe (zielony, Ryc. 7I), a następnie zastosowano fluorescencyjne znakowanie fosfatazą alkaliczną i DBA (odpowiednio turkusowy i czerwony, Ryc. 7I). Analiza przekrojów kanalików wykazała, że kanaliki były albo dodatnie dla fosfatazy alkalicznej, albo dla DBA, ale nie dla obu znaczników jednocześnie (Ryc. 7I). Tylko rzadkie kanaliki nie wykazywały reaktywności ani z fosfatazą alkaliczną, ani z barwieniem DBA, co prawdopodobnie wynikało z kąta cięcia kanalika (biała strzałka, Ryc. 7I). Ponadto barwienie DBA pomyślnie połączono w barwieniu całych nerek ze znacznikiem jądrowym DAPI (Ryc. 7J), co ponownie podkreśliło charakterystyczną rozgałęzioną strukturę dystalnych segmentów kanalików (białe groty strzałek, Ryc. 7J).

Następnie, aby dalej porównać wzorce pobierania dekstranu-FITC, fosfatazy alkalicznej i DBA, przeprowadzono badanie potrójnego znakowania poprzez wstrzyknięcie dorosłym danio pręgowanym dekstranu-FITC drogą dostępu dootrzewnowego, a następnie izolację nerek po 3 dniach, po której nastąpiło kriosekcjonowanie i barwienie na fosfatazę alkaliczną oraz DBA (przykłady przedstawiono na Ryc. 8A-E). Kanaliki nerkowe wykazały trzy kategorie kombinacji znaczników: kanaliki podwójnie dodatnie dla fosfatazy alkalicznej i dekstranu oznaczały segmenty PCT (białe linie przerywane), kanaliki dodatnie tylko dla fosfatazy alkalicznej oznaczały segmenty PST (żółte linie przerywane), a kanaliki dalsze były znakowane wyłącznie przez DBA (czerwone kontury przerywane Ryc. 8A-E). Ponadto tylko kanaliki dodatnie dla DBA wykazywały punkty rozgałęzień (Ryc. 8E). W analizie WISH ten charakterystyczny wzorzec rozgałęzień dystalnych, DBA-dodatnich kanalików korelował z wzorcami ekspresji genów transkryptów transporterów substancji rozpuszczonych specyficznych dla segmentów kanalików dalszych (Ryc. 8F-I). Transkrypty kodujące clcnk, który znakuje cały kanalik dalszy (DE i DL), miały małą średnicę, były liczne w nerce i zawierały punkty rozgałęzień (czarna grot arrowhead Ryc. 8F, 8F’). W porównaniu z nimi, segmenty kanalików wykazujące ekspresję slc12a1 lub slc12a3, będące odpowiednio markerami DE i DL, były ogólnie mniej liczne w próbkach nerek w porównaniu z ekspresją clcnk (porównać Ryc. 8G i 8F, 8H). Co więcej, segmenty kanalików wykazujące ekspresję slc12a1 rzadko, jeśli w ogóle, były rozgałęzione (Ryc. 8G, 8G’), podczas gdy regiony kanalików wykazujące ekspresję slc12a3 były często rozgałęzione w charakterystycznych układach przypominających młyńskie koło (Ryc. 8H, 8H’, 8H”, 8H”’, czarne groty arrowhead). Na koniec, podwójny WISH dla markera PCT slc20a1a i markera dystalnego clcnk wykazał, że barwienia te nie nakładają się na siebie (Ryc. 8I). Co istotne, odcinki segmentów PCT wykazujące ekspresję slc20a1a nie były połączone z kanalikami wykazującymi ekspresję clcnk, co było spodziewane, ponieważ PST znajduje się pomiędzy tymi regionami (Ryc. 8I). Podsumowując, testy znakowania kanalików nerkowych za pomocą pobierania dekstranu, reaktywności fosfatazy alkalicznej, DBA oraz WISH dla specyficznych transkryptów genów umożliwiają rozróżnienie segmentów proksymalnych od dystalnych.

Anatomia nerki danio pręgowanego; struktura nefronu; wykres ekspresji genów; porównanie kanalików proksymalnych i dystalnych.
Rysunek 1. Anatomia nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego. Rysunki schematyczne (A) nerki dorosłego danio pręgowanego oraz (B) tabeli porównawczej charakterystyk molekularnych segmentów występujących w nefronach dorosłych i embrionalnych ryb danio. (A) (Góra po lewej) Nerka dorosłego osobnika jest płaskim organem zlokalizowanym na grzbietowej ścianie ciała. (Góra po prawej) W widoku brzuchnym nerka wykazuje charakterystyczną zakrzywioną morfologię, składającą się z regionów głowy, tułowia i ogona, a także posiada powierzchniową populację związanych z nią melanocytów. Powiększenie (dół po lewej) przedstawia schemat typowego drzewa nefronowego w nerce dorosłego danio pręgowanego, w którym każdy pojedynczy nefron posiada filtr krwi (ciałko nerkowe) na jednym końcu, za którym następują kanalik proksymalny, kanalik dystalny i przewód. Kolorowy schemat (dół po prawej) przedstawia liniowy diagram jednego drzewa nefronowego dorosłego osobnika w celu porównania charakterystyk segmentów z nefronami embrionalnymi (B). Nefrony embrionu danio zawierają segmenty kanalikowe obejmujące proksymalny kanalik kręty (PCT), proksymalny kanalik prosty (PST), wczesny kanalik dystalny (DE) i późny kanalik dystalny (DL), z odpowiednimi domenami ekspresji genów wymienionymi poniżej. Nefrony u dorosłego danio pręgowanego mają podobny skład segmentowy i analogiczną sygnaturę molekularną opartą na domenach ekspresji genów kodujących transportery substancji rozpuszczalnych, choć istotną różnicą w porównaniu z embrionem jest fakt, że kilka nefronów może być zjednoczonych poprzez rozgałęziony segment DL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat znakowania nefronów, przygotowanie nerki rybki danio-ostrolepis, immunohistochemia, DBA, proces WISH.
Rysunek 2. Schemat przedstawiający zależności między metodami opisanymi w niniejszym protokole, wskazujący, w jaki sposób metody te mogą być wykonywane pojedynczo lub w różnych kombinacjach. Po wstrzyknięciu do jamy otrzewnej dorosłej rybki danio-ostrolepis znakowanego dekstranu wiążącego się z lizyną, nerkę można wizualizować w preparacie całego narządu, samodzielnie lub w połączeniu z barwieniem na fosfatazę alkaliczną i/lub DBA. Alternatywnie, wybraną nerkę rybki danio-ostrolepis można badać po wykonaniu histologicznych przekrojów tkanki za pomocą kriostatu. Przekroje można barwić w celu znakowania licznych kombinacji cech, wykorzystując immunohistochemię, barwienie jąder komórkowych, barwienie DBA i/lub reaktywność fosfatazy alkalicznej. Ponadto w przekrojach nerek można bezpośrednio wizualizować obecność pobranego dekstranu wiążącego się z lizyną w segmentach PCT. Na koniec, wybrane nerki można poddać analizie w celu oznaczenia czasowo-przestrzennej ekspresji genów za pomocą metody WISH. Liczby w nawiasach odnoszą się do odpowiednich części protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Preparat płaski nerki na szkiełku; obrazy mikroskopowe w świetle widzialnym, z dekstranem FITC i dekstranem fluoro-ruby.
Rysunek 3. Przygotowanie preparatu płaskiego nerki dorosłego zebrafisha i jego zastosowanie w wizualizacji poboru koniugowanego dekstranu w odcinku PCT nefronów nerkowych. (A) Obraz w świetle widzialnym preparatu płaskiego próbki nerki, w którym narząd został rozłożone płasko na szkiełku przedmiotowym, z nakrywem położonym na tkance spoczywającej na czterech punktach z plasteliny (kolor intensywnie różowy). Tutaj preparat nerkowy przedstawiono obok linijki w celu zapewnienia porównania w odpowiedniej skali. Typowa nerka dorosłego osobnika ma około 5-7 milimetrów (mm) od strony głowy do ogona. (B) Obraz w świetle widzialnym nieodbarwionej nerki. Czarna pigmentacja odpowiada rozproszonej populacji melanocytów występujących w obrębie nerki, a aorta przebiega wzdłuż linii środkowej narządu. (C) Wizualizacja odcinków PCT nefronów 3 dni po domięśniowej iniekcji dekstranu-fluoresceiny (FITC) 40 kDa, bez odbarwiania nerki dorosłego osobnika. Odcinki PCT są widoczne w całej nerce, lecz są częściowo przesłonięte przez melanocyty. (C’) Cyfrowe powiększenie pojedynczego nefronu z widocznymi melanocytami (biała strzałka). (D) Obraz nerki dorosłego osobnika 3 dni po domięśniowej iniekcji dekstranu fluoro-ruby 10 kDa, utrwaleniu nerki i odbarwieniu. Usunięto pigmentację melanocytów, a obszary PCT zwizualizowano w świetle widzialnym na podstawie endocytarnego poboru dekstranu. Krople lipidów (strzałka) z jamy brzusznej mogą czasami występować w sąsiedztwie próbek tkanki nerkowej. (D’, D”) Reprezentatywne obrazy przedstawiają niewielkie różnice morfologiczne między odcinkami PCT. Podczas gdy wiele PCT nefronów jest ściśle zwiniętych (D’), inne nefrony zawierają obszary PCT o minimalnym stopniu zwinięcia (D”). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Test pobierania dekstranu; mikroskopia fluorescencyjna PCT; barwniki: cascade blue, lucifer yellow, fluoro-ruby.
Rycina 4. Oznakowanie segmentu PCT nefronu w nerkach dorosłego osobnika. Zebrafish typu dzikiego poddano pojedynczej iniekcji doprzewnowej koniugatu fluorescencyjnego dekstranu; następnie, 3 dni po iniekcji, badano ich nerki w celu wizualizacji PCT. (A, A’) Dekstran cascade blue, 10 kDa (B, B’) dekstran lucifer yellow, 10 kDA oraz (C, C’) dekstran fluoro-ruby, 10 kDa preferencyjnie znakują segmenty PCT w nefronach nerkowych. Zarówno dekstran cascade blue, jak i lucifer yellow wykazują pewne niespecyficzne znakowanie populacji komórek zrębowych zlokalizowanych pomiędzy nefronami, przy czym znacznie wyższe tło zaobserwowano w nerkach traktowanych lucifer yellow. W przeciwieństwie do nich, dekstran fluoro-ruby wykazał radykalnie zredukowane tło przy intensywnym znakowaniu PCT. (D, D’) Nerka dorosłego osobnika barwiona metodą WISH w celu wykrycia lokalizacji transkrypty kodujących slc20a1a, specyficzny marker typu komórek transporterowych PCT. Domena ekspresji slc20a1a odpowiada charakterystycznemu wzorowi pobierania dekstranu obserwowanemu w nerce, z rozkładem różnych ciasno zwiniętych/zapętlonych domen PCT, a także bardziej wydłużonych odcinków PCT wykazujących stałą szeroką średnicę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ekspresja fosfatazy alkalicznej w cewkach bliższych nerki; obraz mikroskopowy; analiza PCT, PST.
Rysunek 5. Reprezentatywny wynik barwienia na fosfatazę alkaliczną, marker ogólny cewek bliższych, w nerce dorosłego danio pręgowanego w porównaniu z innymi markerami cewek bliższych ocenianymi za pomocą WISH. (A-C) Barwienie na fosfatazę alkaliczną (turkusowe) obrazuje cewkę bliższą nefronu, uwidaczniając zarówno PCT, jak i PST. (D-F’) Pojedynczy WISH dla wymienionych genów (każdy z barwieniem fioletowym). (D, D’) Wzorzec ekspresji cubilin, markera ogólnego cewek bliższych (PCT-PST), koreluje z fosfatazą alkaliczną (D, D’). W porównaniu, WISH dla mafba znakuje PCT (E, E’), a slc13a1 znakuje PST (F, F’). W (G-G”’) podwójny WISH dla markera PCT slc20a1a (czerwony) i markera PST slc13a1 (fioletowy) pokazuje, że segmenty znakowane przez te markery nie nakładają się, lecz ich domeny ekspresji zajmują sąsiadujące pozycje przy dokładnej analizie pojedynczych nefronów (G’-G”’). Czarne groty strzałek wskazują miejsce połączenia segmentów PCT i PST, które zazwyczaj wiąże się ze zmianą średnicy cewki z dużej na małą, odpowiednio. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat barwienia fosfatazą alkaliczną i dekstranem w preparacie całego organu; dane wizualne z mikroskopii i sekcji mrożonych.
Rycina 6. Pochłanianie fosfatazy alkalicznej i dekstranu wykazuje nakładanie się w segmencie PCT nefronów dorosłej nerki, a barwienie fosfatazą alkaliczną jest zgodne z ko-znakowaniem jąder komórkowych jodkiem propidyny. (A-I) Preparaty całego organu z barwieniem fosfatazą alkaliczną wykonane na nerkach dorosłych ryb zebrafish, które wcześniej otrzymały domięśniowy wtrysk dekstranu fluoro-ruby. Fosfataza alkaliczna (turkusowy) i dekstran fluoro-ruby (czerwony) wykazują nakładanie się w PCT, ale nie w PST, który jest dodatni tylko dla fosfatazy alkalicznej. Tła fosfatazy alkalicznej doświetla para głównych przewodów zbiorczych w każdej nerce (gwiazdki, *), które są charakterystyczne ze względu na swoją dużą średnicę. (A-C) Obraz złożony oraz oddzielne obrazy regionu siodłowatego pojedynczej nerki. (D-F) oraz (G-I) Dwa zestawy obrazów złożonych i oddzielnych obrazów przykładowych nefronów. (I) Analiza sekcji mrożonych potwierdza ko-znakowanie fosfatazy alkalicznej i dekstranu fluoro-ruby w segmentach PCT (obrysowane białymi kropkami), podczas gdy sama fosfataza alkaliczna znakuje segment PST (obrysowany żółtymi kropkami). (K-M) Nerkę znakowano (K) fosfatazą alkaliczną (turkusowy) oraz (L) jodkiem propidyny (fioletowy), co umożliwiło (M) złożoną wizualizację komórek kanalików proksymalnych i ich jąder, odpowiednio. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat mikroskopii fluorescencyjnej z barwieniem na fosfatazę alkaliczną i DBA; preparat całego narządu, skrawek mrożony.
Rycina 7. Fosfataza alkaliczna i DBA są wzajemnie wykluczającymi się znacznikami segmentowymi, które odpowiednio znakują regiony pan-proksymalne i pan-dystalne obecne w nefronach nerek dorosłych danio pręgowanych. (A-H) Preparaty całych nerek danio pręgowanego barwione na fosfatazę alkaliczną i rhodamine-DBA. Fosfataza alkaliczna (turkusowy) i DBA (czerwony) nie wykazują nakładania się w nerce. Tło fosfatazy alkalicznej uwidacznia parę głównych przewodów zbiorczych w każdej nerce (gwiazdki, *), które wyróżniają się szeroką średnicą. Kanaliki dodatnie dla DBA mają mniejszą średnicę i często charakteryzują się obecnością punktów rozgałęzień (białe groty strzałek). (A-C) Obraz złożony oraz obrazy oddzielne regionu siodłowatego pojedynczej nerki. (D-F) Zestaw obrazów złożonych i oddzielnych dla przykładowych nefronów. (G, H) Dodatkowe przykłady z rozgałęzionymi kanalikami DBA obok kanalików dodatnich dla fosfatazy alkalicznej, obrazy złożone. (I) Analiza skrawków mrożonych potwierdza, że fosfataza alkaliczna i DBA znakują odrębne sekcje kanalików, a tylko nieliczne kanaliki nie wykazują żadnego z znaczników (biała strzałka), co prawdopodobnie wynika z kąta cięcia danego kanalika. Do tej analizy wykorzystano ryby transgeniczne typu dzikiego, Tg:enpep:eGFP, a wszystkie kanaliki nerkowe w tej nerce zostały oznakowane immunochemicznie przeciwciałem pierwszorzędowym do detekcji GFP. (J) Barwienie całej nerki na DBA (czerwony) i DAPI (niebieski) (obraz złożony), ponownie pokazujące rozgałęzione segmenty kanalików dystalnych w dorosłych nefronach (biały grot strzałki). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat krioprzecięć wykazujący wychwyt dekstranu FITC, fosfatazę alkaliczną i DBA w kanalikach nerkowych.
Rycina 8. Potrójne znakowanie krioprzecięć nerek dorosłych osobników pod kątem wychwytu dekstranu, fosfatazy alkalicznej i DBA w porównaniu z analizą WISH segmentów dystalnych. (A-E) Do jam brzusznych nerek dorosłych osobników wstrzyknięto dekstran-FITC (zielony), a nerki pobrano 3 dni później w celu zatopienia i wykonania krioprzecięć. Barwienie na fosfatazę alkaliczną (turkusowy) i DBA (czerwony) ujawniło trzy populacje kanalików: segmenty PCT dodatnie pod kątem reaktywności z fosfatazą alkaliczną i dekstranem (obrysowane białymi kropkami), segmenty PST dodatnie tylko pod kątem reaktywności z fosfatazą alkaliczną (obrysowane żółtymi kropkami) oraz segmenty kanalików dystalnych dodatnie tylko dla DBA (obrysowane czerwonymi kropkami), które wykazywały również charakterystyczne punkty rozgałęzień dystalnych. (A-D) Obraz scalony i osobne obrazy jednego przykładowego przekroju. (E) Obraz scalony innego przykładowego przekroju. (F-I) Porównanie wzorców ekspresji genów kanalików dystalnych za pomocą pojedynczego (F-H'”) oraz podwójnego (I) WISH. (F-H’) Pojedynczy WISH dla wymienionych genów (każdy z barwieniem fioletowym). (F,F’) Wzorzec ekspresji clcnk, markera pan-dystalnego (DE-DL), wykryto w cienkich kanalikach zawierających punkty rozgałęzień (czarna grot arrowhead). (G,G’) W porównaniu z tym, WISH dla slc12a1 znakuje DE, w którym nie wykryto punktów rozgałęzień, a (H-H'”) slc12a3 znakuje DL, segment charakteryzujący się licznymi punktami rozgałęzień w całym narządzie nerki (czarne groty arrowhead). (I) Podwójny WISH dla markera PCT slc20a1a (czerwony) i pan-dystalnego clcnk (fioletowy). Segmenty znakowane tymi markerami nie nakładają się, a ich domeny ekspresji zajmują nieprzylegające do siebie pozycje, tak że poszczególne sploty PCT (prawy dolny róg) nie przylegają do kanalików dystalnych, a te ostatnie zajmują odrębne miejsca i posiadają charakterystyczne punkty rozgałęzień (czarna grot arrowhead). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy metody, które umożliwiają wizualizację składowych segmentów nefronu u dorosłego danio pręgowanego. Wstrzyknięcie fluorescencyjnych koniugatów dekstranu umożliwia preferencyjne znakowanie PCT ze względu na właściwości endocytarne tych bliższych komórek kanalików30,38. Metoda ta może być wykonywana z dużą elastycznością ze względu na istnienie dektransu, który można uzyskać za pomocą szeregu różnych koniugatów fluorescencyjnych. Ponadto stosowanie dektransu utrwalanego lizyną jest szczególnie wygodnym sposobem znakowania segmentów PCT, ponieważ nie są wymagane procedury etykietowania wtórnego. Umożliwia to stosunkowo proste wykrywanie sygnału i jest kompatybilne z wieloma innymi znacznikami fluorescencyjnymi, znakowaniem immunologicznym i wykorzystaniem transgenicznych linii reporterowych. Znakowanie fosfatazą alkaliczną oznacza również kanaliki proksymalne, z silną reaktywnością w PCT i nieco słabszą reaktywnością w PST. Wreszcie, barwienie DBA umożliwia znakowanie dystalnych segmentów kanalików, które wykazują charakterystyczną rozgałęzioną morfologię. Różne cząsteczki lektyny, które są białkami wiążącymi cukier pochodzenia nieimmunologicznego, były szeroko stosowane do rozróżniania segmentów nefronu ssaków47. Interesujące jest to, że DBA u danio pręgowanego koreluje z dystalnymi segmentami kanalików, ponieważ jest wykorzystywany do oznaczania przewodów zbiorczych w nerkach ssaków47.

Podsumowując, metody te mogą być wykorzystywane w różnych kombinacjach do dokumentowania składu i funkcji nerek. Ponieważ wszystkie te metody mogą być stosowane w preparatach nerkowych, dostarczają one narzędzi do oceny struktury i funkcji nefronu w całym narządzie bez całkowitego polegania na bardziej czasochłonnych, żmudnych metodach, np. kriosekcji i znakowaniu immunologicznym. Jednak plamy opisane w tym artykule o metodach są żywotne w kriosekcji. Analiza kriosekcji generuje próbki (w porównaniu z całym wierzchem), które lepiej nadają się do immunohistochemii w celu wykrycia określonych peptydów, choć oczywiście ten rodzaj analizy wymaga dostępności odpowiednich przeciwciał pierwotnych. Niestety, jednym z głównych ograniczeń w pracy z modelem zwierzęcym danio pręgowanego pozostaje słaba dostępność przeciwciał. W związku z tym WISH pozostaje najpowszechniej stosowaną procedurą analizy ekspresji genów. WISH wykorzystujący reakcje substratowe BCIP, NBT i/lub INT w celu wytworzenia fioletowych lub czerwonych osadów nie jest kompatybilny z barwieniem fluorescencyjnym na kriosekcjach. Jedną z opcji byłoby zastosowanie fluorescencyjnej detekcji WISH, procedury, która została zoptymalizowana dla próbek embrionalnych danio pręgowanego i może być dostosowana do użytku z dorosłą nerką. Opis metod w tym artykule wideo powinien pozwolić na dalsze eksperymentowanie z technikami takimi jak fluorescencyjny WISH w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, w których poszczególne segmenty są znakowane za pomocą reportera, takiego jak eGFP lub mCherry. Alternatywnie, opisane tutaj metody mogą być testowane w połączeniu z innymi ważnymi barwnikami, np. innymi lektynami. W związku z tym można by odwołać się do dalszej adaptacji i rozszerzenia opisanych tu metod, aby dostosować je do potrzeb badacza w zakresie preparatów i analizy całej nerki wierzchowca.

W związku z tym metody te mają duży potencjał do zastosowania w modelu danio pręgowanego w trwających badaniach nad regeneracją, a także w modelowaniu chorób genetycznych. Istnieje pilna potrzeba innowacyjnych badań i metod leczenia chorób nerek. Każdego roku miliony ludzi cierpią na jakąś formę choroby nerek, która wynika z przyczyn wrodzonych, ostrych i/lub przewlekłych. Co więcej, częstość występowania chorób nerek stale rośnie na całym świecie, co sprawia, że choroby te stanowią globalny problem zdrowia publicznego14,15. Dostępne są metody leczenia, takie jak hemodializa, w których zewnętrzna maszyna do dializy służy do usuwania odpadów metabolicznych z krwi pacjenta, jeśli jego nerki nie są w stanie pełnić tej roli. Niestety, interwencja ta ma ograniczenia, ponieważ do przeżycia konieczne jest ciągłe leczenie. Co więcej, pacjenci w końcu będą wymagać przeszczepu nerki, który może trwać latami po umieszczeniu pacjenta na liście oczekujących. Nawet po uzyskaniu przeszczepu nerki wielu pacjentów odczuwa działania niepożądane w wyniku zabiegu i musi walczyć z tymi skutkami do końca życia. Trudności te wskazują na poważną potrzebę opracowania nowych metod leczenia, które pomogą zapobiec chorobom nerek lub być może wspomóc regenerację tkanek8,16,52,53. Biorąc pod uwagę oczywiste ograniczenia etyczne związane z wykorzystywaniem ludzi w laboratoriach biomedycznych, modele zwierzęce są niezbędne do badania patogenezy chorób u ludzi oraz do testowania nowych metod leczenia. Ze względu na podobieństwo anatomiczne i bliskość ewolucyjną, mysz stała się najczęściej stosowanym modelem choroby człowieka45. Istnieją jednak pewne ograniczenia związane z tym zwierzęciem, w tym niemożność wizualizacji rozwoju narządów in vivo i praktyczność wykonywania badań genetycznych na dużą skalę. Danio pręgowany jest istotnym i użytecznym organizmem modelowym do badań nad rozwojem narządów i modelowaniem chorób człowieka45,46. Jeśli chodzi o choroby ludzkie, homologi funkcjonalne u danio pręgowanego istnieją dla prawie 70% wszystkich ludzkich genów54,55.

Ostatnie prace podkreśliły przydatność danio pręgowanego w wielu obszarach badań nad nerkami31,37,56. Badania nad regeneracją i naprawą u danio pręgowanego po AKI sugerują, że regeneracja nabłonka kanalików i neonefrygeneza to dwa procesy, które zachodzą i nakładają się na siebie w całym okresie regeneracji30,37. Stosowanie antybiotyku aminoglikozydowego zwanego gentamycyną zostało wykorzystane jako paradygmat urazów, za pomocą którego badano wyniki AKI u dorosłych danio pręgowanego29,30,37. W ciągu około dwóch tygodni po uszkodzeniu przez gentamycynę kanaliki proksymalne regenerują się, a tymczasem w całym narządzie tworzą się nowe nefrony29,30,37. Ogólnie rzecz biorąc, mechanizmy regulujące regenerację nabłonka pozostają wysoce kontrowersyjne. Jednym z proponowanych mechanizmów procesu naprawy jest początkowy ostry uraz, po którym następuje złuszczenie martwych komórek do światła. Następnie następuje seria zdarzeń deróżnicowania, proliferacji i migracji, po których nowe komórki różnicują się, ponownie zasiedlając uszkodzoną błonę podstawną i przywracając funkcję w uszkodzonym miejscu. Alternatywnie, inne badania sugerują, że komórki zastępcze powstają z komórek macierzystych / progenitorowych, które znajdują się w kanalikach nefronowych. Jeśli chodzi o proces neonefrogenezy u zebry pręgowanego, zaobserwowano agregaty komórkowe po AKI przez wstrzyknięcie gentamycyny29,30. Agregaty te dojrzewają później do nowych nefronów, które zagłębiają się w już istniejące kanaliki29,30. Wspólnym mianownikiem łączącym regenerację nabłonka nefronów i neonfrogenezę jest ich tajemniczy czynnik: obecnie istnieje wykładniczo więcej pytań o to, jak zachodzą te wyczyny regeneracyjne, niż dostępnych informacji.

Do tej pory jednak kilka ekscytujących linii dowodów potwierdza pogląd, że badania nad regeneracją nerek z wykorzystaniem danio pręgowanego mogą rzeczywiście dostarczyć istotnych informacji porównawczych na temat ludzkiego AKI, które mogą mieć również bezpośredni potencjał translacyjny56-58. Chemiczne badania przesiewowe mające na celu identyfikację małych cząsteczek, które zwiększają proliferację komórek progenitorowych nerek w zarodku danio pręgowanego, doprowadziły niedawno do zidentyfikowania inhibitora deacetylazy histonowej metylo-4-(fenylotio)-butanianu (m4PTB)56,57. Podanie tego związku larwom danio pręgowanego z AKI indukowanym gentamycyną wykazało, że przeżywalność larw wzrosła i zwiększono proliferację kanalików nerkowych56,58. Kiedy myszy z umiarkowanym AKI wywołanym niedokrwieniem były leczone m4PTB, ich powrót do zdrowia został przyspieszony w związku ze zmniejszeniem zarówno atrofii kanalików, jak i zatrzymaniem cyklu komórkowego proliferujących komórek kanalików nerkowych58. Odkrycia te sugerują, że szlaki odpowiedzialne za prawidłowy rozwój nerek danio pręgowanego i/lub odpowiedź regeneracyjną na AKI zostaną zachowane u ssaków56.

Tak więc, chociaż potrzebne są dalsze badania, aby wyodrębnić mechanizmy regeneracji – a mianowicie zidentyfikować zaangażowane szlaki sygnałowe i zrozumieć ich interakcje – danio pręgowany stanowi jedną obiecującą drogę do osiągnięcia tego ważnego celu w dziedzinie nefrologii. Narzędzia takie jak znaczniki komórek nefronowych opisane w tym protokole reprezentują jedną grupę testów, które można wykorzystać do oceny składu i funkcjonalności nerek w modelach AKI. Co więcej, mogą być stosowane do charakteryzowania transgenicznych modeli chorób nerek i mogą dostarczyć sposobów identyfikacji chemicznych środków terapeutycznych zdolnych do promowania odbudowy struktury nefronu po uszkodzeniu nerek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta funduszami dla RAW z następujących źródeł: National Institutes of Health przyznaje K01 DK083512, DP2 OD008470 i R01 DK100237; Nagroda grantowa March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar #5-FY12-75; pozyskanie funduszy z University of Notre Dame College of Science i Wydziału Nauk Biologicznych; oraz hojny dar dla Uniwersytetu Notre Dame od Elizabeth i Michaela Gallagherów w imieniu rodziny Gallagherów na wspieranie badań nad komórkami macierzystymi. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych za ich wsparcie oraz Centrum Badań nad Danio Pręgowanym w Notre Dame za ich wyjątkowe poświęcenie w opiece i dobrostanie naszej kolonii danio pręgowanego. Na koniec dziękujemy członkom naszego laboratorium badawczego za ich komentarze, dyskusje i spostrzeżenia na temat tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X PBSWykonany przez rozcieńczenie 10 X PBS w wodzie destylowanej.
1X detergent PBST0,1% Tween-20 w 1 X PBS.
1X PBS z 0,05% detergentem Tween0,05% Tween-20 w 1 X PBS.
Tween 20American BioanalyticalAB02038
4% PFA/1X PBSRozpuścić 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) w 1 X PBS, doprowadzić do wrzenia na płycie grzejnej w dygestorium. Schłodzić i zamrozić porcje do przechowywania w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C. Rozmrozić tuż przed użyciem i nie zamrażać ponownie zapasów.
Cienkie kleszczeRobozRS-1050Dumont Pęseta Wzór #55 
Szkiełko szklaneThermo-Fisher4445White Frost 
Szkiełko nakrywkoweszklane Thermo-Fisher12-540A18 x 18 mm
PlastelinaHasbroPlaydohInne plasteliny można zastąpić i działać podobnie
Uchwyt do szkiełekThermo-Fisher12-587Opcjonalnie: taca kartonowa do przechowywania preparatów na płasko
RoztwórwybielającyFormuła mieszanki wybielacza (na 20 ml roztworu):
1,6 ml 10% roztworu wodorotlenku potasu
0,6 ml 30% roztworu nadtlenku wodoru
100 μ l 20% Tween
Napełnij do 20 ml wodą destylowaną
Wodorotlenek potasuSigma221473
Nadtlenek wodoruSigmaH1009
Roztwórblokujący Roztwór blokujący (dla 10 ml roztworu):
8 ml 1X PBS z 0,05% Tween
2 ml płodu surowicy cielęcej
150 μ l wykrywania
aktywności fosfatazy alkalicznejInvitrogenE6601Używamy zestawu do wykrywania endogennej fosfatazy ELF 97.  Aby przygotować roztwór substratu roboczego, należy rozcieńczyć substrat 20-krotnie w buforze detekcyjnym, zgodnie z instrukcją producenta.
do płukania fosfatazy alkalicznejPrzepis na roztwór buforowy do przemywania (na 100 ml roztworu):
5 ml 0,5 M EDTA
120 mg lewamizolu
95 ml 1X PBS
Dextran, fluoresceina, 40 000 MWInvitrogenD1844Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml, i przechowywać porcje w zamrażarce w temperaturze -20°C.
Dekstran, błękit kaskadowy, 10 000 MWInvitrogenD1976Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml, a podwielokrotności przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C.
Dekstran, lucyfer żółty, 10 000 MWInvitrogenD1825Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C.
Dekstran, tetrametylorodamina (fluoro-rubin), 10 000 MWInvitrogenD1817Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C.
Dolichos biflorus aglutynina (DBA)-rodaminaVector laboratoriesRL-10-32DBA Roztwór do barwienia (dla 100 μ l roztwór):
1 Μ l z DBA
99 μ l z 1X PBS
Jodek propidynyInvitrogenE6601
DAPIInvitrogenP1304MP
Vectashield twardy zestaw podłoża montażowegoLaboratoria wektoroweH-1400
Szkło z mikro pokrywąVWR48393081
Dimetylosulfotlenek, DMSOAmerican Bioanalytical67-68-5
SacharozaSigmaS0289
EDTA, 0,5 M roztwór, pH 8,0AB00502Bioanalityczna
LewamizolSigmaL-9756
Podłoże do zamrażania tkanekTriangle Biomedical Sciences, Inc.TFM-C
Tissue-Tek Biopsja Cryomold, 10 x 10x 5 mmSakura Finetek4565
TruBond 380Scientific0380W
Liquid blocker – super PAPpen Mikroskopia elektronowa Sciences71312
Komora wilgotnościowa na plamy immunologiczneEvergreen Scientific240-9020-Z10
KriostatThermMicrom&handel; HM 525 Kriostat
StereoskopNikonSMZ645; SMZ1000; 83455 P-niebieski GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 Używany zestaw filtrów P-TRITCbył następujący: Filtr Hoechst/DAPI był używany do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, dekstranu lucyfera i anty-GFP. Filtr TRITC został użyty do wykrywania dektran-fluoro-rubinu, PI i DBA. 
Mikroskop złożonyNikon96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas RedZestaw filtrów był następujący: Filtr Hoechst/DAPI był używany do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, dekstranu lucyfera i anty-GFP. Filtr Texas Red został użyty do wykrywania dektran-fluoro-rubinu, PI i DBA.   
DMSO Roztwór Amerykańska Szkiełka mikroskopowe samoprzylepne Tru

Bibliografia

  1. Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier , Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
  2. Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
  4. Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
  5. Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
  6. Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
  7. Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
  8. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11(2013).
  9. Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
  10. Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
  11. Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
  12. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  13. Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
  14. Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
  15. El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
  16. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
  17. Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
  18. Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
  19. Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
  20. Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3(2009).
  21. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  22. Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
  23. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  24. Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
  25. Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
  26. Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
  27. Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
  28. Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
  29. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  30. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  31. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  32. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189(2007).
  33. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  34. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  35. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  36. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
  37. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  38. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
  39. Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
  40. Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
  41. Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
  42. Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
  43. Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
  44. Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
  45. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  46. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  47. Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
  48. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  49. Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
  50. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604(2014).
  51. Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
  52. Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
  53. Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  54. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  55. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  56. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1 (3), (2013).
  57. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
  58. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fluorescencyjna dekstrynabarwienie immunofluorescencyjnefosfataza alkalicznaznakowanie DBAwybielanie nerekutrwalanie tkanekobrazowanie mikroskopoweregeneracja nerek
Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.