Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Summary

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami. Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Abstract

Model danio pręgowanego stał się odpowiednim systemem do badania rozwoju, regeneracji i chorób nerek. Zarówno embrionalne, jak i dorosłe nerki danio pręgowanego składają się z jednostek funkcjonalnych znanych jako nefrony, które są wysoce konserwatywne z innymi kręgowcami, w tym ssakami. Badania na danio pręgowanym wykazały niedawno, że po uszkodzeniu dorosłych nefronów zachodzą dwa charakterystyczne zjawiska: po pierwsze, w istniejących nefronach zachodzi silna regeneracja, która zastępuje zniszczone komórki nabłonka kanalików; Po drugie, całkowicie nowe nefrony są wytwarzane z komórek progenitorowych nerek w procesie znanym jako neonefrogeneza. Natomiast ludzie i inne ssaki wydają się mieć tylko ograniczoną zdolność do regeneracji nabłonka nefronu. Do tej pory mechanizmy odpowiedzialne za te zjawiska regeneracji nerek pozostają słabo poznane. Ponieważ dorosłe nerki danio pręgowanego przechodzą zarówno regenerację nabłonka nefronów, jak i neonefrogenezę, stanowią one znakomity paradygmat eksperymentalny do badania tych zdarzeń. Co więcej, w modelu danio pręgowanego dostępnych jest wiele narzędzi genetycznych i farmakologicznych, które można wykorzystać do nakreślenia mechanizmów komórkowych i molekularnych regulujących regenerację nerek. Jednym z istotnych aspektów takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje zestaw technik znakowania, które można wykorzystać do oceny składu nerkowego i badania funkcjonalności nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego. W związku z tym metody te mają szerokie zastosowanie w przyszłej charakterystyce fenotypowej paradygmatów uszkodzenia nerek dorosłego danio pręgowanego, które obejmują między innymi reżimy ekspozycji na nefrotoksyny lub genetyczne metody docelowej śmierci komórek, takie jak technika ablacji komórek za pośrednictwem nitroreduktazy. Co więcej, metody te mogą być wykorzystywane do badania zaburzeń genetycznych w tworzeniu się nerek u dorosłych, a także do oceny stanu nerek podczas modelowania chorób przewlekłych.

Introduction

Nerka to złożony organ, który spełnia wiele funkcji fizjologicznych w organizmie. Najważniejszą funkcją nerek jest wydalanie produktów przemiany materii, a zadanie to jest ściśle powiązane z utrzymaniem homeostazy płynów. Nerka wykonuje te zadania, filtrując krew i tworząc mocz, jednocześnie regulując ciśnienie krwi, poziom elektrolitów i równowagę kwasowo-zasadową. Wysoce wyspecjalizowane kanaliki nabłonkowe zwane nefronami służą jako podstawowa jednostka funkcjonalna nerki^1,2. U dorosłych kręgowców nefrony są zwykle zorganizowane w ciasno zwinięty układ otaczający scentralizowany system drenażowy, co pozwala na upakowanie wielu kanalików w dość małym narządzie. Na przykład każda ludzka nerka może zawierać ponad 1 milion nefronów³. Inne ssaki, takie jak mysz, posiadają około 8-10 tysięcy nefronów na nerkę⁴. Stopień złożoności nerek różni się między tymi ssakami a innymi kręgowcami ze względu na różnice w całkowitej liczbie nefronów i ich układzie architektonicznym w nerce. Gatunki kręgowców tworzą podczas rozwoju aż trzy kolejne struktury nerkowe, a każda forma wykazuje coraz większą złożoność w odniesieniu do wyposażenia i rozmieszczenia nefronów: pręcze, śródnercze i śródnercze. Ostatnia struktura nerkowa, która ma zostać zachowana, służy jako dorosły narząd nerkowy - zwykle mesonephros lub metanephros². Każda forma nerkowa ma jednak skład oparty na nefronach².

Nefron jest koniem pociągowym nerki i jest odpowiedzialny za filtrację krwi wraz z wydzielaniem metabolitów i reabsorpcją. Nefrony są prostymi strukturami rurkowymi składającymi się z komórek nabłonkowych i mają organizację segmentową, w której dyskretne, wysoce wyspecjalizowane domeny zróżnicowanego nabłonka wykonują określone zadania. W kolejności przepływu filtratu przez nefron zazwyczaj występują trzy główne części, które składają się na każdą jednostkę: (1) ciałko nerkowe, (2) kanalik z segmentami proksymalnym, pośrednim i dystalnym oraz (3) przewód zbiorczy¹. Kanalik proksymalny jest odpowiedzialny za reabsorpcję substancji rozpuszczonych organicznych, w szczególności glukozy i aminokwasów¹. Kanalik pośredni (lub pętla Henlego) jest głównym miejscem regulacji soli i wody¹. Wreszcie, dostrajanie soli i innych jonów zachodzi w kanaliku dystalnym i kanale zbiorczym i jest silnie regulowane przez układ hormonalny¹. Stamtąd filtrat przemieszcza się przez moczowód i pęcherz moczowy, ostatecznie opuszczając organizm jako produkt odpadowy¹.

Utrata funkcji nerek może wynikać z wielu przyczyn, które uniemożliwiają normalną aktywność nefronów. Przyczyny te mogą wystąpić podczas rozwoju nerek, np. wady wrodzone, które prowadzą do wad rozwojowych nefronów5 lub przyczyny wynikające z różnego rodzaju urazów (wynikających zarówno z pochodzenia genetycznego, jak i środowiskowego). Urazy nabyte są szeroko klasyfikowane jako ostre uszkodzenie nerek (AKI) lub przewlekłe uszkodzenie nerek (PChN). AKI wiąże się z nagłą utratą funkcji nerek, często wynikającą z niedokrwienia lub ekspozycji na toksyny^6,7. U ssaków naprawa nabłonka nefronów jest możliwa po takich urazach⁸, a wiele osób wykazuje pełne przywrócenie funkcji nerek po AKI. Jednak AKI wiąże się również z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością, które zgłaszano w szerokim zakresie zachorowalności 30 - 70%^6,7. Natomiast PChN wiąże się z postępującą utratą funkcji nerek, która wynika z wieloletniego długotrwałego uszkodzenia, zwykle związanego ze zwłóknieniem^8,9. Co więcej, istnieje wzajemne oddziaływanie między AKI i CKD, ponieważ każdy z nich może predysponować osobę do pozostałych^10-12. Na przykład ci, którzy cierpieli na AKI, są bardziej podatni na PChN, a nawet na śmierć¹³. Częstość występowania chorób nerek, zarówno w USA, jak i na całym świecie, osiągnęła rozmiary epidemii i przewiduje się, że będzie rosła wraz ze starzeniem się populacji – w związku z tym istnieje rosnąca potrzeba zidentyfikowania interwencji medycyny regeneracyjnej dla nerek^14,15.

Pomimo wiedzy, że pacjenci z AKI mogą wyzdrowieć, od dawna uważano, że nerka jest organem bez wrodzonych zdolności regeneracyjnych. Ten tradycyjny pogląd został w ostatnich latach radykalnie zrewidowany¹⁶. Badania nad uszkodzeniem nerek u myszy i szczurów po AKI wykazały, że komórki nabłonkowe kanalików nefronowych mogą się namnażać i odbudowywać funkcjonalne nefrony^17-20. Chociaż ssaki posiadają tę adaptacyjną zdolność do regeneracji nefronów, istnieją znaczące ograniczenia i mogą zostać wywołane nieprzystosowawcze reakcje, które prowadzą do zwłóknienia nerek i PChN²¹. Na przykład niedawne badanie wykazało, że powtarzająca się ablacja komórek nabłonka w mysich nefronach wiązała się ze zmniejszoną regeneracją i zwłóknieniem nerek – co sugeruje, że nefrony mają ograniczony próg regeneracji²². Nie ma dowodów na to, że nerka dorosłego ssaka tworzy nowe nefrony w miejsce utraconych lub uszkodzonych, a zatem ich zniszczenie prowadzi do trwałego deficytu nefronów^8,9. Co ciekawe, niektóre kręgowce reagują na AKI poprzez regenerację nabłonka nefronów, a także poprzez wytwarzanie nowych nefronów, proces określany jako neonfrogeneza lub neogeneza nefronów²³. Neonefrogeneza zachodzi u ryb po ekspozycji na toksyny lub częściowej resekcji, a modele urazów historycznie obejmowały złotą rybkę^24,25, tilapię²⁶, łyżwę²⁷, medakę²⁸, a ostatnio danio pręgowanego^29,30. Spośród nich danio pręgowany stanowi realny model badań genetycznych w celu odkrycia szlaków komórkowych i molekularnych odpowiedzialnych za regenerację nerek.

W tym artykule wideo pokazujemy, jak oznaczać segmenty nefronu u dorosłego danio pręgowanego. Wiedza na temat anatomii nefronu, cech molekularnych i cech funkcjonalnych jest niezbędna do udanych przyszłych badań nerek z wykorzystaniem danio pręgowanego. Nerka dorosłego danio pręgowanego jest strukturą mesonefrost i jest z natury mniej złożona pod względem liczby nefronów i organizacji niż struktura metanephros występująca u dorosłych ssaków, ptaków i³¹. Jednak organizacja segmentów nefronów danio pręgowanego jest analogiczna do ssaków i została po raz pierwszy udokumentowana w embrionalnej nerce na podstawie badań ekspresji genów^31-35. Nefrony zarodkowe danio pręgowanego zawierają liniowe segmenty kanalików, które obejmują proksymalny kanalik kręty (PCT), proksymalny kanalik prosty (PST), dystalny wczesny (DE) i dystalny późny (DL) ^31-35 (ryc. 1). Dorosłe nefrony danio pręgowanego mają podobne segmenty rurkowe^30,31,36,37 (ryc. 1). PCT można również zidentyfikować na podstawie funkcjonalnego fenotypu: komórki nabłonkowe w PCT będą zawierać znakowane fluorescencyjnie związki dekstranu (o wielkości 10-70 kDA) obecne w krążeniu, które zostały wykorzystane zarówno w embrionalnej, jak i dorosłej nerce danio pręgowanego do oceny wychwytu endocytarnego przez te proksymalne komórki kanalików^38-41 (Figura 1). Jedną z różnic w segmentach nefronów między danio pręgowanym a ssakami jest to, że danio pręgowany nie ma kanalika pośredniego lub pętli Henle^30-37; Ponieważ ten segment funkcjonuje u ssaków w celu oszczędzania wody, a danio pręgowany jest gatunkiem słodkowodnym, który nie ma pilnej potrzeby koncentracji moczu, nie jest zaskakujące, że danio pręgowany nie ma tego segmentu^32,33. Tak więc ogólny skład nefronów jest w dużej mierze zachowany między nerką danio pręgowanego a nerką ssaków^32,33. Te podobieństwa sprawiły, że danio pręgowany stał się skutecznym narzędziem badawczym do badania funkcji genów wyrażających nerki podczas nefrostenezy rozwojowej^32-35,42 oraz do modelowania licznych chorób nerek^43,44, dodając w ten sposób do pokaźnej listy schorzeń ludzkich, które można badać za pomocą danio pręgowanego^45,46.

Dzisiaj, dorosła nerka danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badań porównawczych regeneracji nerek ze względu na jej genetyczną wykonalność i poszerzające się podniebienie zasobów technologicznych dostępnych do badania funkcji genów i szlaków sygnałowych u tego gatunku. W kilku badaniach wykorzystano mesonephros danio pręgowanego do zbadania mechanizmów regeneracji po AKI^29,30,37. Aby kontynuować badania AKI z wykorzystaniem nerki dorosłego danio pręgowanego, niezbędne jest posiadanie doskonałych metod oznaczania różnych regionów nefronu oraz metod badania funkcjonalności nefronów. Kilka metod analizy nerek dorosłych zostało zaadaptowanych z protokołów dotyczących nerek embrionalnych. Dootrzewnowe wstrzyknięcie znakowanego fluorescencyjnie dekstranu u dorosłego danio pręgowanego znakuje nabłonek PCT w nefronach mesonephros poprzez endocytozę³⁰, jak w zarodkach danio pręgowanego^38-41 (ryc. 1). Metoda ta została wykorzystana do wizualizacji, kiedy kanaliki proksymalne odzyskują swoje właściwości reabsorbujące po AKI, co umożliwia ocenę przywróconej funkcji fizjologicznej³⁰ (ryc. 1). Inną cechą kanalika proksymalnego nefronu jest to, że komórki nabłonkowe w tym segmencie posiadają obwódkę szczotkową³⁷, która wykazuje wysoki poziom endogennej fosfatazy alkalicznej. W ten sposób nabłonek proksymalny może być zlokalizowany wizualnie w nerce dorosłego danio pręgowanego przy użyciu techniki opartej na fluorescencji, znanej jako ELF-(Enzyme-Labeled Fluorescence)-97⁴⁷.

Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić testy wychwytu dekstranu fluorescencyjnego^30,48 w nerce dorosłego danio pręgowanego, aby uzyskać funkcjonalną ocenę kanalika proksymalnego oraz zmapować rozmiar i kontury tego segmentu kanalika. Następnie opisujemy techniki znakowania proksymalnych obszarów kanalików dorosłego nefronu za pomocą fluorescencyjnej fosfatazy alkalicznej. Po trzecie, po raz pierwszy pokazujemy, że znakowana rodaminą lektyna Dolichos biflorus aglutynina (DBA), która została użyta jako ogólny marker przewodów zbiorczych w nerce ssaków⁴⁹, oznacza dystalne kanaliki nerki dorosłego danio pręgowanego. Ponieważ DBA wzajemnie wyklucza się z barwieniem fosfatazą alkaliczną, etykiety te umożliwiają szerokie rozróżnienie rozciągnięć pan-proksymalnych i pan-dystalnych dorosłego nefronu danio pręgowanego. Podczas wdrażania tych fluorescencyjnych barwień zarówno w całych sekcjach histologicznych góry, jak i kriostatu, korelujemy te etykiety z domenami ekspresyjnymi genów transportera substancji rozpuszczonej, które jednoznacznie identyfikują każdy segment nefronu. W związku z tym protokół ten zawiera również przewodnik po zmodyfikowanych procedurach przetwarzania tkanek dla analizy hybrydyzacji in situ całych tkanek dorosłych (WISH) w oparciu o nasz protokół WISH⁵⁰ dla zarodków. Procedury te mogą być stosowane w różnych kombinacjach (ryc. 2) w celu udokumentowania morfologicznych i funkcjonalnych atrybutów nefronów nerkowych dorosłego danio pręgowanego. W związku z tym protokoły te mogą być stosowane w badaniach nad regeneracją, charakterystyką fenotypową innych modeli chorób nerek, a nawet wykorzystywane do badania tworzenia się dorosłej nerki.

Protocol

Procedury pracy z danio pręgowanym opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame. Uwaga: Dostępny jest przewodnik po anatomii nerek i nefronów u danio pręgowanego (ryc. 1). Przegląd metodologii opisanych w niniejszym protokole przedstawiono w postaci schematu blokowego (rysunek 2) w celu zilustrowania, w jaki sposób można przeprowadzić wiele procedur znakowania na tej samej próbce nerki. W części 7 dotyczącej przygotowania WISH do badań nad nerkami u dorosłych, przedstawione tutaj kroki wskazują, jak zmodyfikować przetwarzanie zarodków danio pręgowanego, jak opublikowano^{niedawno 50}, aby zapewnić techniczny przewodnik dla udanej analizy narządu nerkowego w ramach WISH.

1. Dootrzewnowe wstrzyknięcie dorosłego danio pręgowanego z interesującym dekstranem

1. Przygotować żądany(-e) substan(-y) dekstranu znakowanego(-e) fluorescencyjnie, rozpuszczając proszek dekstranu w wodzie destylowanej o stężeniu 50 mg/ml, a następnie przechowywać porcje w probówkach do mikrowirówek w temperaturze -20 °C w ciemności. Uwaga: W handlu dostępne są różne dekstransy znakowane fluorescencyjnie. Wybierz dekstran do użycia w oparciu o kombinację innych pożądanych etykiet i upewnij się, że odpowiednie filtry fluorescencyjne są dostępne z mikroskopami, które będą używane. Utrwalany lizyną dextrans wykazuje fluorescencję bez żadnych dalszych etapów znakowania w żywych próbkach, nieutrwalonych próbkach tkanek z próbek poddanych eutanazji i próbkach utrwalonych.
2. Rozmrozić żądany zapas dekstranu i przechowywać na lodzie w ciemności, wykonując kroki 1,3-1,5. Owiń probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem podczas obsługi.
3. Znieczulić dorosłego danio pręgowanego w wieku 5-7 miesięcy, umieszczając rybę w naczyniu zawierającym 0,02% trikainy lub 0,001% 2-fenoksyetanolu na około 1-2 minuty. Uwaga: Zaleca się stosowanie dorosłych ryb danio pręgowanego w tym przedziale wiekowym, ponieważ młodsze ryby mogą mieć małe nerki, które są trudne do wycięcia, a próbki nerek starych ryb mogą zawierać masy tkanki bliznowatej, której nie można przeanalizować. Po odpowiednim znieczuleniu dorosły danio pręgowany nie będzie wykazywał reakcji na stymulację dotykową, którą można przetestować za pomocą łyżki lub sondy, aby delikatnie dotknąć płetwy ogonowej ryby.
4. Za pomocą plastikowej łyżki wyjmij rybę z naczynia, zdekantuj roztwór i ostrożnie umieść zwierzę na mokrej foremce z gąbki, brzuszną stroną do góry.
5. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 31 g i pojemności 1,0 ml wstrzyknąć 20 μl rozmrożonego roztworu podstawowego dekstranu do przestrzeni dootrzewnowej. Ustawić igłę tak, aby wprowadzenie nastąpiło pod płytkim kątem w brzusznej linii środkowej brzucha. Aby uniknąć nakłucia narządów, należy wprowadzić igłę, a następnie lekko ją podnieść, tak aby unieść ścianę ciała ryby i stworzyć przestrzeń, w którą można wstrzyknąć roztwór dekstranu⁴⁸. Uwaga: Alternatywnie, dekstran podstawowy może być rozcieńczany, np. w stosunku 1:2 lub 2:1 (dekstran: woda destylowana), w celu zmniejszenia fluorescencji tła w próbce.
6. Delikatnie włóż rybę z powrotem do zbiornika, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu. Uwaga: Wychwyt dekstranu przez segment kanalików proksymalnych następuje w ciągu 8 - 12 godzin i może być wykryty przez co najmniej do 3 dni po wstrzyknięciu (dpi). Analiza w rozdzielczości 3 dpi zapewnia silny sygnał kanalików o niskiej fluorescencji tła w populacjach zrębu nerkowego. Przejdź do części 2 w celu przeprowadzenia całościowego badania wchłaniania dekstranu w monoterapii, jeśli dodatkowe oznakowanie nie jest pożądane. W przypadku znakowania skojarzonego należy przejść do części 3, aby przygotować tkankę do badania wychwytu dekstranu w całości, a następnie do części 4 do podwójnego znakowania fosfatazą alkaliczną i/lub do części 5, aby przeprowadzić podwójne lub potrójne znakowanie DBA. W przypadku badań z wykorzystaniem skrawków histologicznych przejdź do części 6, aby uzyskać instrukcje dotyczące wykonywania drobnych skrawków nerki za pomocą kriostatu i barwienia ich różnymi znacznikami i/lub immunohistochemią za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych.

2. Sekcja i płaskie przygotowanie nerki dorosłego osobnika danio pręgowanego z nieutrwalonej próbki zwierzęcej w celu wizualizacji fluorescencyjnego znakowania dekstranem kanalika proksymalnego

1. Poddaj eutanazji dorosłego danio pręgowanego, któremu wstrzyknięto dekstran, umieszczając go w naczyniu o 0,2% pH trikainy 7,0 na 4 - 5 minut. Uwaga: Upewnij się, że ryba została poddana eutanazji przed kontynuowaniem, uważnie monitorując, czy skrzela przestały się poruszać, a serce przestało bić³⁶.
2. Za pomocą plastikowej łyżki wyjmij rybę z roztworu Trikainy, zdekantuj roztwór i połóż zwierzę na chusteczce lub ręczniku papierowym.
3. Użyj ostrych nożyczek do preparacji, aby wykonać cięcie za wieczkiem skrzelowym i usunąć głowę.
4. Natychmiast otwórz ciało ryby nożyczkami preparacyjnymi, wykonując długie brzuszne nacięcie od głowy do podstawy płetwy ogonowej.
5. Usuń narządy wewnętrzne ryby za pomocą cienkich kleszczy.
6. Użyj bardzo cienkich igieł do preparowania, aby rozciąć ściany ciała, aby umożliwić wizualizację narządu nerkowego, który przylega do ściany grzbietowej zwierzęcia.
7. Użyj cienkich kleszczy, aby odłączyć nerkę od ściany grzbietowej.
8. Delikatnie umieść nerkę w 5 ml szklanej fiolce zawierającej 1X PBS i przemyj 3 razy 3 - 5 ml świeżego 1X PBS przez 5 minut każda. Uwaga: Użycie szklanej fiolki do manipulowania próbkami nerek dorosłych ułatwia wizualizację tkanki i pozwala na przemywanie dużymi objętościami (w stosunku do masy tkanki) wynoszącymi około 3 - 5 ml. Alternatywnie można użyć 12-dołkowego naczynia do hodowli komórkowych. Podczas gdy można użyć plastikowej probówki do mikrowirówki, probówki o standardowym rozmiarze (1,5 ml) mogą ograniczać mycie.
9. Usunąć nerkę za pomocą pipety transferowej i umieścić na czystym szkiełku podstawowym z 1-2 kroplami 1X PBS .
10. Użyj cienkich kleszczy, aby spłaszczyć nerkę na szkiełku, upewniając się, że żadna tkanka nie zwinęła się ani w inny sposób nie przewróciła się na siebie. Uwaga: Alternatywnie można użyć narzędzia z drutu wolframowego do wykonania małych nacięć w tkance łącznej, aby ułatwić płaskie ustawienie nerki.
11. Umieść małe kawałki plasteliny na każdym rogu szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm i powoli umieść szkiełko nakrywkowe na nerce. Uwaga: Podczas umieszczania szkiełka nakrywkowego należy lekko pochylić, aby zminimalizować uwięzienie pęcherzyków powietrza w roztworze⁵⁰. Wgłębienia z plasteliny mają średnicę około 2 mm (ryc. 2A). Alternatywnie, zamiast plasteliny można zastąpić wgłębienia smaru próżniowego. Dodaj dodatkową kroplę 1X PBS, aby w razie potrzeby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym.
12. Obserwuj i/lub zobrazuj nerkę, umieszczając szkiełko w polu view na mikroskopie stereoskopowym lub mikroskopie złożonym z odpowiednim filtrem. Uwaga: Patrz rysunek 2A, aby zapoznać się z makroskopowym wyglądem tego preparatu do szkiełek.

3. Utrwalenie, rozwarstwienie, przepuszczalność i usuwanie pigmentacji nerki dorosłego danio pręgowanego

1. Przygotować świeży roztwór utrwalający 4% paraformaldehydu (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO lub rozmrozić zamrożoną porcję 4% PFA/1 X PBS i dodać 0,1% DMSO. Ostrzeżenie: PFA jest toksyczny, a roztwory PFA należy obchodzić się z kapturem chemicznym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic i fartucha laboratoryjnego. Ponadto z proszkiem PFA należy obchodzić się ostrożnie podczas przygotowywania roztworu podstawowego.
2. Napełnij tacę sekcyjną roztworem utrwalającym w ilości wystarczającej do zanurzenia całego zwierzęcia.
3. Poddaj eutanazji wybranego danio pręgowanego i umieść go w roztworze utrwalającym (patrz kroki 2.2-2.6). Uwaga: Wybrana ryba może być nieleczoną próbką nerki danio pręgowanego lub nerką wyizolowaną od danio pręgowanego, która wcześniej otrzymała dootrzewnowe wstrzyknięcie dekstranu (część 1).
4. Ustalić próbkę O/N (12–16 godzin) w temperaturze 4 ^°C.
5. Następnego dnia za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie odłącz nerkę od grzbietowej ściany ciała i umieść narząd w szklanej fiolce za pomocą pipety transferowej. Uwaga: Alternatywnie można użyć 12-dołkowego lub 24-dołkowego naczynia do hodowli. Podczas gdy można użyć plastikowej probówki do mikrowirówki, probówki o standardowym rozmiarze (1,5 ml) mogą ograniczać mycie.
6. Umyj wypreparowaną nerkę 3 razy za pomocą 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy.
7. Usunąć 1X PBS za pomocą 0,05% Tween i płukać nerkę 3 ml 5% roztworu sacharozy (w 1X PBS) przez 30 minut.
8. Zastąp 3 ml 30% roztworu sacharozy (w 1X PBS) i przechowuj O/N (12 - 16 godzin) w temperaturze 4 ^oC. Uwaga: Roztwory sacharozy przenikają przez błony komórkowe, umożliwiając następnie specyficzne znakowanie odczynników podczas ich wnikania do tkanki.
9. Następnego dnia usuń 30% roztwór sacharozy i przemyj nerkę 2 razy 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy.
10. Zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3 - 5 ml roztworu wybielającego, aby usunąć pigmentację melanocytów obecną na narządzie nerkowym.
11. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i uważnie obserwuj, jak pigmentacja znika. Uwaga: Depigmentacja trwa zazwyczaj około 20 minut, gdy jest wykonywana po leczeniu sacharozą, ale czasami może trwać nawet 60 minut. Jeśli roztwór wybielający pozostanie na nerce zbyt długo, może dojść do rozpadu narządu; Zaleca się monitorowanie próbki co 10-15 minut w celu sprawdzenia integralności tkanek.
12. Po usunięciu pigmentacji z nerki przemyć dwukrotnie 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween.
13. Zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3 - 5 ml 4% roztworu PFA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
14. Usuń 4% roztwór PFA i przemyj nerkę 3 razy 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy. Uwaga: Po zakończeniu fiksacji, nerkę można również zamontować na szklanym szkiełku i ocenić pod kątem wychwytu dekstranu bez pigmentacji melanocytów, wykonując kroki 2.8-2.12.
15. Usunąć 1X PBS z 0,05% Tween i zastąpić 3 - 5 ml roztworu blokującego, a następnie inkubować nerkę w temperaturze RT w bloku przez 2 godziny.
16. Po zakończeniu blokowania przejdź bezpośrednio do wybranego protokołu barwienia. Uwaga: Nerka może być teraz przetworzona przez jedną lub więcej innych procedur w celu przeprowadzenia badań znakowania z różnymi odczynnikami. W celu znakowania całego mocowania kanalika proksymalnego tylko fosfatazą alkaliczną, przejdź do sekcji 4. Aby oznaczyć całe mocowanie tylko dystalnego kanalika, przejdź do sekcji 5. Alternatywnie, sekcje 4 i 5 mogą być wykonywane w kolejności liniowej w celu podwójnej detekcji w całym mocowaniu.

4. Oznaczanie segmentów kanalików proksymalnych dorosłej nerki za pomocą wykrywania fosfatazy alkalicznej

1. Usuń blok i umyj nerkę 3 razy 3 - 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy, a następnie zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3 - 5 ml 1X PBS. Pozwól nerce moczyć się przez co najmniej 10 minut. Uwaga: W tym czasie przenieś nerkę do 12-dołkowego lub 24-dołkowego naczynia hodowlanego, jeśli tkanka była przechowywana w szklanej fiolce do poprzednich etapów przetwarzania.
2. Zastąp 1X PBS wystarczającą ilością roboczego roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (patrz zestaw detekcyjny znajdujący się w Tabeli materiałów), aby pokryć próbkę, a następnie umieść próbkę na rotatorze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Utrzymuj próbkę przed światłem.
3. Zatrzymaj reakcję, przemywając nerkę w roztworze buforowym do przemywania fosfatazy alkalicznej.
4. Przepłukać nerkę 3 podmianami roztworu buforowego do przemywania przez 10 - 15 minut. Uwaga: Po tym kroku przejdź bezpośrednio do części 5, kroku 5.1 (tymczasowo pomijając kroki 4.5-4.6), jeśli pożądane jest również etykietowanie za pomocą DBA. Opcjonalny krok: Aby oznaczyć i uwidocznić jądra komórkowe w narządzie, namocz nerkę w roztworze jodku propidyny. Przygotować wywar z jodku propydyny, rozpuszczając proszek w stężeniu 1 mg/ml (1,5 mM) w wodzie destylowanej. Rozcieńczyć materiał do 500 nM w 2X SSC i inkubować nerkę w tym roztworze przez 30 minut. Spłucz 1X PBS i przejdź do kroku 4.5.
5. Usunąć roztwór buforowy do przemywania i zamontować nerkę na czystym szkiełku podstawowym w podłożu montażowym fosfatazy dołączonym do zestawu do etykietowania (patrz kroki 2.9-2.12). Uwaga: Nośnik montażowy zastąpił 1X PBS z kroku 2.9.
6. Wizualizacja nerki wybarwionej fosfatazą alkaliczną za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu złożonego z zestawem filtrów Hoechst/DAPI. Uwaga: Opcjonalny krok: Wizualizuj jodek propidyny za pomocą filtra tetrametylo-rodaminy (TRITC) lub czerwonego filtra Texas.

5. Wyznaczanie segmentów dystalnych kanalików nerkowych dorosłych za pomocą rodaminy DBA

1. Przygotować 200 μl roboczego roztworu DBA, rozcieńczając DBA (2 mg/ml) w stosunku 1:100 w 1X PBS.
2. Zastąp 1X PBS roztworem Tween 0,05% roztworem 200 μl DBA.
3. Umieść na rotatorze na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Usuń roztwór DBA i przemyj nerkę 3 razy 3 - 5 ml 1X PBS przez 5 minut każdy. Uwaga: Opcjonalny krok: Aby oznaczyć i uwidocznić jądra komórkowe w narządzie wraz z etykietą DBA, namocz nerkę w roztworze DAPI w celu wykrycia za pomocą filtra Hoechst / DAPI (barwienie rodaminą DBA można wykryć za pomocą czerwonego filtra TRITC lub Texas). Przygotować wywar DAPI, rozpuszczając proszek w stężeniu 5 mg/ml (14,3 mM). Rozcieńczyć materiał do 300 nM w 2X SSC i inkubować nerkę w tym roztworze przez 20 minut. Spłucz 1X PBS i przejdź do kroku 5.5. Jeśli przeprowadzono przetwarzanie części 4, należy pamiętać, że zarówno DAPI, jak i fosfataza alkaliczna są wykrywane za pomocą filtra Hoechst/DAPI.
5. Wyjmij 1X PBS i zamontuj nerkę na czystym szklanym szkiełku podstawowym (patrz kroki 2.9-2.12).
6. Wizualizuj dystalne segmenty nerki barwione przez DBA za pomocą standardowego filtra TRITC lub czerwonego filtra Texas ustawionego na fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym lub mikroskopie złożonym. Uwaga: Opcjonalny krok: Wizualizacja DAPI za pomocą filtra Hoechst/DAPI.

6. Osadzanie, kriosekcja i barwienie (barwniki życiowe i znakowanie immunohistochemiczne) tkanki nerkowej dorosłego danio pręgowanego

1. Wybierz ryby do analizy, a następnie poddaj je eutanazji, utrwaleniu i przepuszczalności zgodnie z opisem (kroki 3.2-3.8). Uwaga: Utrwal dorosłe ryby w 9:1 etanolu: formaldehyd / 0,1% DMSO zamiast 4% paraformaldehydu / 1X PBS / 0,1% DMSO do procedury kriosekcji w celu wytworzenia skrawków dla dekstranu, fosfatazy alkalicznej i wizualizacji DBA. Należy jednak pamiętać, że utrwalenia na bazie paraformaldehydu mogą być kompatybilne z niektórymi procedurami immunohistochemicznymi. Co więcej, wybielanie dorosłej nerki nie jest potrzebne do analizy kriosekcji, ponieważ melanocyty są powierzchowne i nie wpływają na wizualizację komórek nefronowych, które stanowią "wnętrze" narządu nerkowego.
2. Następnego dnia usuń 30% roztwór sacharozy i zastąp go pożywką do zamrażania tkanek w stosunku 1:1: 30% sacharozy przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć roztwór w stosunku 1:1 i zanurzyć próbki nerek w 100% pożywce do zamrażania tkanek w krioformach i umieścić w temperaturze -80 ^oC na co najmniej 1 godzinę.
4. Poprzecznie przecięte odcinki szeregowe o grubości około 12 μm przez całą dorosłą nerkę.
5. Zamrożone kriosekcje zamontować na samoprzylepnych szkiełkach mikroskopowych i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze 50 ^oC.
6. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 ^oC do czasu użycia.
7. Gdy kriosekcje są gotowe do znakowania, wyjmij szkiełka mikroskopowe z -80 ^oC i umieść na szkiełku podstawowym w temperaturze 50 ^oC na 45 minut.
8. Za pomocą pisaka blokującego płyn narysuj okrąg wokół kriosekcji i pozostaw do wyschnięcia na 15 minut na szkiełku podstawowym w temperaturze 50 ^oC.
9. Wyjmij szkiełka z podgrzewacza do szkiełek i umieść je płasko w komorze wilgotnościowej o temperaturze pokojowej.
10. Ponownie uwodnić kriosekcje, dodając 1X PBS z 0,05% Tween do zakreślonej części szkiełek przez 20 minut. Uwaga: Potrzeba około 200 - 300 μl, aby pokryć każdą zakreśloną część na szkiełku.
11. Zastąp 1X PBS 0,05% roztworem Tween na świeży 1X PBS i inkubuj przez 10 minut.
12. Usuń 1X PBS i inkubuj kriosekcje w roztworze blokującym przez 2 godziny. Uwaga: Aby uzyskać 10 ml roztworu blokującego, połącz 8 ml 1X PBS z 0,05% Tween, 2 ml płodowej surowicy cielęcej i 150 μl DMSO. Aby przeprowadzić immunohistochemię po etapie blokowania, inkubować szkiełko z pożądanym przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w świeżym bloku O/N w temperaturze 4 ^oC, przemyć raz przy użyciu 1X PBS z 0,05% Tween, inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z drugorzędowym roztworem przeciwciała rozcieńczonym w 1X PBS z 0,05% Tween, przemyć raz przy użyciu 1X PBS z 0,05% Tween, i zamontować szkiełko nakrywkowe na szkiełku z medium montażowym. Wymagane rozcieńczenia przeciwciał będą się różnić i należy przeprowadzić próby w celu wyboru optymalnych rozcieńczeń. Pobieranie antygenu może również ułatwić znakowanie immunologiczne i jest wykonywane przed zablokowaniem. Natychmiast po rozmrożeniu szkiełek w temperaturze 50 ^oC (krok 6.8) inkubować kriosekcje w temperaturze 95 ^oC -100 ^oC przez 40 minut w podgrzanym 10 mM buforze cytrynianu sodu. Schłodzić szkiełka przez 30 minut, a następnie umyć dwukrotnie w 1X PBS z 0,05% Tween i przejść do kroku 6.11.
13. Usuń roztwór blokujący i przemyj kriosekcje 3 razy 1X PBS przez 5 minut każda.
14. Zastąp 1X PBS roztworem barwiącym DBA i inkubuj przez 1 godzinę. Uwaga: Rozcieńczyć 1 μl DBA w 99 μl 1X PBS, aby uzyskać 100 μl roztworu barwiącego.
15. Usuń roztwór barwiący DBA i przemyj kriosekcje 3 razy 1X PBS przez 5 minut każda.
16. Nałożyć etykietę fosfatazy alkalicznej i inkubować na kriosekcji przez 10 minut.
17. Zmyć fosfatazę alkaliczną z kriosekcji serią 3 płukań buforem do przemywania przez 10 minut każde. Uwaga: Aby uzyskać 100 ml roztworu buforu do mycia, połączyć 5 ml 0,5 M EDTA i 120 mg lewamizolu w 95 ml 1X PBS. Aby oznaczyć jądra, należy inkubować skrawki z jodkiem propidyny lub DAPI w poprzednio zanotowanych rozcieńczeniach (odpowiednio kroki 4.4, 5.4) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wybrać barwnik jądrowy zgodny z kombinacją innych wybranych barwników fluorescencyjnych.
18. Usuń cały płyn z kriosekcji i umieść 2 krople podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym.
19. Ostrożnie umieść mikro szkło nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym. Kriosekcje są teraz gotowe do obrazowania z odpowiednimi filtrami.

7. Przetwarzanie WISH dla próbek nerek dorosłych danio pręgowanego

1. Wybierz żądaną okazę (próbki) danio pręgowanego, poddaj eutanazji, naprawij i wypreparuj nerkę zgodnie z opisem (kroki 3.1-3.5). Uwaga: Konieczne jest użycie roztworu utrwalającego 4% paraformaldehydu (PFA) / 1X PBS z 0,1% DMSO w celu przepuszczalności nerek. Umieść nerkę w szklanej fiolce, aby ułatwić wizualizację podczas kolejnych etapów przetwarzania.
2. Usunąć utrwalacz i dwukrotnie przemyć nerkę 5 ml 1X PBST.
3. Usunąć 1X PBS i dwukrotnie umyć nerkę 100% metanolem, a następnie inkubować nerkę w temperaturze -20 ^oC przez co najmniej 20 minut, aby uzyskać przepuszczalność. Uwaga: Wypreparowane nerki mogą być przechowywane w nieskończoność -20 ^oC.
4. Nawodnij nerki, wykonując serię 5-minutowych płukań 3 - 5 ml 50% metanolu/1X PBST, 30% metanolu/1X PBST i dwukrotnie 1X PBST.
5. Wybielaj nerkę, aby usunąć pigmentację zgodnie z opisem (kroki 3.10-3.14).
6. Potraktować nerkę 10 μg/ml proteinazy K/1X PBST 0,1% DMSO przez 20 minut, następnie przepłukać dwukrotnie 1X PBST i po utrwaleniu w 4% PFA/1X PBST przez 20 minut do O/N. Uwaga: Zawsze przygotowywać roztwór roboczy proteinazy K bezpośrednio przed trawieniem próbki, łącząc 50 μl świeżo rozmrożonej proteinazy K (10 mg/ml), 50 ml 1X PBST i 50 μl DMSO.
7. Przetwarzaj nerkę pod kątem pojedynczego lub podwójnego WISH, postępując zgodnie z etapami syntezy rybosondy, prehybrydyzacji, hybrydyzacji, inkubacji i wykrywania przeciwciał anty-digoksygeninowych/anty-fluorosceinowych, jak opisano niedawno⁴⁹. Uwaga: Obrazowanie całego mocowania plam nerkowych powinno być wykonane w ciągu kilku dni od przeprowadzenia reakcji barwienia. Plamy nefronu mają tendencję do bardzo szybkiego blaknięcia, zwłaszcza czerwone etykiety podłoża. W przypadku fotografii nefronowej należy zamontować próbkę nerki na płasko, jak opisano powyżej w krokach od 2.10 do 2.12, a następnie wykonać zdjęcie za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego. Różnicowe interferencyjne filtry kontrastowe mogą być stosowane do lepszej wizualizacji konturów komórkowych nefronów w celu ułatwienia analizy próbki.

Results

Każdy z protokołów został przeprowadzony na dzikich rybach pręgowanych. Przykłady uzyskanych danych dokumentują prawidłowy skład strukturalny i właściwości nefronów w zdrowej nerce dorosłego danio pręgowanego. Dorosły danio pręgowany posiada mesonefrosts lub drugą formę nerkową, która znajduje się na grzbietowej ścianie ciała (ryc. 1A). Dorosła nerka jest stosunkowo płaska i zawiera tak zwany obszar głowy, tułowia i ogona z powierzchownymi melanocytami rozsianymi po tych obszarach (ryc. 1A). Tkanka nerkowa zawiera rozgałęzione układy nefronów, które łączą się i odprowadzają do centralnych przewodów zbiorczych (ryc. 1A). Każdy nefron jest spolaryzowany na całej swojej długości, z filtrem krwi (lub krwinką nerkową) na jednym końcu, po którym następuje szereg segmentów kanalików, a na końcu kończy się na kanale, który zbiera roztwór, który zostanie wydalony (ryc. 1A). Każdy dorosły kanalik nefronowy zawiera proksymalne i dystalne segmenty komórek, wyznaczone przez ekspresję specyficznych transporterów substancji rozpuszczonej^30,31,36,37, które są zachowane z wzorcem segmentowym wykazywanym przez nefrony embrionalne^31-35 (Figura 1B). Na przykład transkrypty kubiliny oznaczają kanalik proksymalny³⁹ (PCT i PST), a transkrypty clcnk oznaczają kanalik dystalny³² (DE i DL) (Figura 1B). Ponadto segment PCT wyróżnia się ekspresją slc20a1a, PST rozróżnia się ekspresją slc13a1, DE rozróżnia się wyrażeniem slc12a1, a DL rozróżnia się ekspresją slc12a3³² (Figura 1B). Różnice między dorosłymi kanalikami nefronowymi w porównaniu z embrionalnymi polegają na tym, że dystalne segmenty wykazują zwoje (DE, DL), a segment DL rozgałęzia się szeroko u osoby dorosłej, co różni się od liniowej, nierozgałęzionej anatomii tych regionów w zarodku^30,31,36,37 (Figura 1A). Zarówno w kanalikach nefronowych dorosłych³⁰, jak i embrionalnych^38-41 nabłonek PCT można rozróżnić ze względu na jego właściwości endocytarne i można go uwidocznić i ocenić pod kątem funkcji reabsorpcyjnej w oparciu o zdolność do wychwytu fluorescencyjnych koniugatów dekstranu (Figura 1B). Ponadto, jak wykazano na kolejnych rysunkach, kanalik proksymalny osoby dorosłej (PCT i PST lub region pan-proksymalny) jest znakowany fosfatazą alkaliczną, podczas gdy kanalik dystalny (DE i DL lub obszar pan-dystalny) jest znakowany przez DBA (Figura 1B). Metody stosowane w niniejszym dokumencie do znakowania segmentów nefronu dorosłego ryba danio pręgowanego za pomocą wychwytu dekstranu, fosfatazy alkalicznej, DBA, immunohistochemii lub WISH mogą być wykonywane w różnych kombinacjach, w całości lub z histologicznymi skrawkami tkanki nerkowej (ryc. 2). Pozwala to na dużą elastyczność i różnorodność, gdy ma być oceniany skład nefronów (ryc. 2).

Dorosła nerka może być zamontowana płasko na szkiełku do analizy, z wgłębieniami z plasteliny modelarskiej (lub alternatywnie smaru próżniowego) użytymi do zawieszenia szkiełka nakrywkowego na tkance (Rysunek 3A). Ponieważ typowa długość nerki wynosi około 5-7 mm, jej rozmiar sprzyja obrazowaniu pod mikroskopem stereoskopowym lub złożonym (ryc. 3A). W jasnym świetle można uwidocznić powierzchowną populację melanocytów z czarną pigmentacją w połączeniu z tkanką nerkową, a unaczynienie, takie jak aorta, można zobaczyć, ponieważ krążące erytrocyty mają czerwony odcień (ryc. 3B). Po dootrzewnowym wstrzyknięciu dekstranu-FITC, domeny PCT zlokalizowane w śródnerczu były nadal znakowane 3 dni później i obrazowane przy użyciu filtra FITC na mikroskopie fluorescencyjnym (Figura 3C). Podczas gdy melanocyty częściowo zasłaniają wizualizację poszczególnych kanalików nerkowych (ryc. 3C'), melanocyty nie uniemożliwiają ilościowego określenia liczby nefronów ani oceny średnicy i długości kanalików. Po dootrzewnowym wstrzyknięciu dekstranu fluoro-rubinowego, wybielanie utrwalonej próbki wyeliminowało pigmentację melanocytów, a segmenty PCT obserwowano przy samym jasnym oświetleniu pola (ryc. 3D). Kropelki lipidów z jamy brzusznej można czasami zaobserwować w połączeniu z preparatami z całych narządów nerkowych (ryc. 3A). Poszczególne segmenty PCT wykazują zwoje, zwoje (rysunek 3D'), ale mogą być również charakteryzowane względnie liniowymi rozciągnięciami (rysunek 3D).

Różne koniugaty dekstranu zapewniały różne poziomy ogólnej klarowności w znakowaniu kanalików proksymalnych. W szczególności dekstran-FITC lub dekstran fluoro-rubin doprowadził do uzyskania wyraźnych etykiet nefronowych z minimalnym tłem (ryc. 3C-D). Zarówno koniugaty kaskady dekstranu niebieskiego, jak i lucyferowego żółtego wykazały wychwyt kanalików proksymalnych w dorosłej nerce (Figura 4A, 4B). Co ciekawe, nerki wystawione na działanie błękitu kaskadowego dekstranu wykazywały stosunkowo specyficzną fluorescencję PCT z pewnym tłem (Figura 4A, 4A'), podczas gdy nerki wystawione na działanie żółtego dekstranu lucyferowego miały znakowane segmenty PCT, ale wykazywały zauważalny sygnał tła, z niespecyficznym barwieniem fluorescencyjnym obecnym w całym zrębie nerkowym lub przestrzeni między nefronami (Figura 4B, 4B'). Wreszcie, zastosowanie rubinu dektran-fluoro zapewniło lepsze znakowanie kanalików proksymalnych, z minimalnym tłem lub bez niego, nawet gdy ogląda się je w różnych powiększeniach (ryc. 4C, 4C'). We wszystkich przypadkach charakterystyczny rurowy wzór wychwytu sprzężonego dekstranu korelował z ekspresją WISH transkryptów kodujących slc20a1a, ustalony marker specyficzny dla PCT^30-32 (Figura 4D). Segmenty PCT nefronu wybarwione antysensowną rybosondą slc20a1a wykazywały cewki PCT w kształcie litery S, a także mniej ostro zwinięte segmenty PCT (ryc. 4D'), jak zaobserwowano podczas znakowanych testów koniugatowych dekstranu (Figura 3D', 3D").

Inne preparaty nerkowe, takie jak wykrywanie aktywności fosfatazy alkalicznej kanalików proksymalnych (Rysunek 5A, 5B, 5C) były podobnie wykonywane po usunięciu pigmentacji melanocytów. Pozwoliło to na obrazowanie i analizę nefronów kanalików proksymalnych bez żadnych przeszkód. Endogenna reaktywność fosfatazy alkalicznej w nefronie jest jedną z głównych cech charakterystycznych kanalika proksymalnego^1,47. Barwienie fosfatazą alkaliczną jest wysoce specyficzne dla proksymalnych regionów nefronu, w porównaniu z pan-proksymalnym wzorcem ekspresji WISH genu cubiliny³⁹ (ryc. 5D, 5D'). Reaktywność fosfatazy alkalicznej była najbardziej intensywna w pierwszym odcinku kanalika proksymalnego, który odpowiada PCT (Figura 5B), podobnie jak wzorzec ekspresji kubiliny (Figura 5D, 5D'), który również miał najwyższe względne poziomy transkryptu w PCT. PCT wyróżniał się nieco szerszą średnicą, specyficzną ekspresją czynnika transkrypcyjnego mafba (Figura 5E, 5E') oraz specyficzną ekspresją genu transportera substancji rozpuszczonej slc20a1a (Figura 4D, 4D'). Reaktywność fosfatazy alkalicznej oznaczała również odcinek kanalika proksymalnego o cieńszej średnicy, która odpowiada segmentowi PST (Figura 5B) na podstawie porównania ze specyficzną dla segmentu ekspresją transkryptu genu transportera substancji rozpuszczonej slc13a1 (Figura 5F, 5F'). Domeny ekspresji WISH markera PCT slc20a1a i markera PST slc13a1 wzajemnie się wykluczają (Figura 5G), a dokładne badanie pojedynczych nefronów wykazało, że te odpowiednie domeny przylegają do siebie, z niewielką, jeśli w ogóle, przerwą między nimi, i że razem podsumowują domenę ekspresji kubiliny (czarne groty strzałek w.Rysunek 5G', 5G", 5G"').

Aby dodatkowo potwierdzić związek reaktywności fosfatazy alkalicznej z tożsamością kanalików proksymalnych, przeprowadzono wspólne znakowanie całego mocowania barwienia fosfatazą alkaliczną na nerkach danio pręgowanego, które otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie dekstranu fluoro-rubinowego 3 dni wcześniej (Rysunek 6A-C). Dekstran fluoro-rubinowy wykazywał nakładanie się na fosfatazę alkaliczną tylko w części o większej średnicy domeny kanalików proksymalnych, która odpowiada PCT (przykłady na rysunku 6D-I). Domena dekstranowo-dodatnia nagle zatrzymała się w miejscu, w którym średnica kanalika proksymalnego zmniejszyła się, tj. Tam, gdzie spotkały się PCT i PST (białe groty strzałek na rycinie 6), a w kolejnym segmencie PST zaobserwowano tylko reaktywność fosfatazy alkalicznej (przykłady na rysunku 6D-I). Fluorescencja tła z reakcji fosfatazy alkalicznej również słabo zarysowała parę równoległych głównych ścieżek przewodów zbiorczych znajdujących się w dorosłej nerce^29,30 - przewodów, które wyróżniają się najszerszą średnicą ze wszystkich rurek związanych z nerkami (gwiazdki na ryc. 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). Następnie zaobserwowano wspólne znakowanie kanalików nefronowych fosfatazą alkaliczną i wychwytem dekstranu w analizie kriosekcji (Figura 6J, obwody kanalików obrysowane białymi kropkami). W przekroju poprzecznym reaktywność fosfatazy alkalicznej odnotowano w grubym paśmie na wierzchołkowej powierzchni nabłonka kanalików, zgodnie z ultrastrukturą brzegu szczoteczki, podczas gdy odpowiednia przestrzeń cytozolowa komórek kanalików wykazała reaktywność fluororubinową dekstranu (ryc. 6J). Warto zauważyć, że barwione kanaliki były albo podwójnie dodatnie dla fosfatazy alkalicznej i dekstranu, co prowadziło do ich identyfikacji jako segmenty PCT, albo pojedynczo dodatnie dla fosfatazy alkalicznej (Figura 6J, obwód kanalika zaznaczony żółtymi kropkami), co prowadziło do identyfikacji jako segment PST (uwaga: inne obecne kanaliki były ujemne dla obu barwień, dane nie pokazane) (Figura 6J). Co więcej, barwienie fosfatazą alkaliczną (ryc. 6K) z powodzeniem połączono ze znacznikiem jądrowym, jodkiem propidyny (ryc. 6L), ułatwiającym liczenie komórek (nakładka na ryc. 6M).

Dystalny kanalik nefronowego dorosłego danio pręgowanego został oznaczony DBA sprzężonym z rodaminą (Rysunek 7). Podwójne znakowanie całego wierzchowca za pomocą DBA i fosfatazy alkalicznej przeprowadzono na nerkach danio pręgowanego typu dzikiego (ryc. 7A-C). Reaktywność DBA i fosfatazy alkalicznej nie wykazała nakładania się kanalików nefronowych (ryc. 7D-H). Kanaliki barwione DBA wykazywały znacznie cieńszą średnicę w porównaniu z kanalikami dodatnimi fosfatazą alkaliczną, a kanaliki DBA były często rozgałęzione (białe groty strzałek, ryc. 7G, 7H, 7J), podczas gdy rozgałęzień nigdy nie obserwowano w segmentach kanalików barwionych fosfatazą alkaliczną. Kriosekcje nerkowe pobrano od danio pręgowanego typu dzikiego, które są nosicielami transgenu, w którym promotor enpep napędza eGFP (Tg: enpep: eGFP), ponieważ GFP znakuje zarówno proksymalne, jak i dystalne kanaliki nefronowe⁵¹ (Figura 7I). Przeprowadzono immunohistochemię w celu wykrycia GFP, tak aby oznaczyć wszystkie kanaliki nerkowe (zielony, ryc. 7I), a następnie znakowanie fluorescencyjne fosfatazą alkaliczną i DBA (odpowiednio turkusowy i czerwony, ryc. 7I). Analiza odcinków kanalików wykazała, że kanaliki były dodatnie dla fosfatazy alkalicznej lub DBA, ale nie dla obu znaczników (Figura 7I). Tylko rzadkie kanaliki wykazywały reaktywność bez fosfatazy alkalicznej lub barwienia DBA, prawdopodobnie ze względu na kąt przekroju kanalika (biała strzałka, ryc. 7I). Co więcej, barwienie DBA z powodzeniem połączono w barwieniu nerki całego wierzchowca z etykietą jądrową DAPI (ryc. 7J), ponownie podkreślając charakterystyczny rozgałęziony charakter segmentów kanalików dystalnych (białe groty strzałek, ryc. 7J).

Następnie, aby dalej porównać wzorce wychwytu dektran-FITC, fosfatazy alkalicznej i DBA, zbadano potrójne znakowanie poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie dorosłemu zerosłemu dekstranu-FITC, następnie izolację nerki 3 dni później, a następnie kriosekcję i barwienie na fosfatazę alkaliczną i DBA (przykłady podane na rysunku 8A-E). Kanaliki nerkowe wykazywały trzy kategorie kombinacji etykiet: kanaliki, które były podwójnie dodatnie dla fosfatazy alkalicznej i dekstranu oznaczane segmentami PCT (białe przerywane linie), kanaliki dodatnie dla samej fosfatazy alkalicznej oznaczane segmentami PST (żółte przerywane linie), a kanaliki dystalne były oznaczone tylko DBA (czerwone przerywane kontury Rysunek 8A-E). Co więcej, tylko kanaliki dodatnie DBA wykazywały punkty rozgałęzień (ryc. 8E). Według analizy WISH, ten charakterystyczny wzór rozgałęzień dystalnych, dodatnich kanalików DBA korelował z wzorcami ekspresji genów transkryptów transportera substancji rozpuszczonej, które są specyficzne dla dystalnych segmentów kanalików (Figura 8F-I). Transkrypty kodujące clcnk, który oznacza cały dystalny kanalik (DE i DL), miały cienką średnicę, obfite w nerce i zawierały punkty rozgałęzień (grot strzały Rysunek 8F, 8F'). Dla porównania, segmenty kanalików, które wykazywały ekspresję slc12a1 lub slc12a3, które są markerami odpowiednio DE i DL, były mniej liczne w próbkach nerek ogółem w porównaniu z ekspresją clcnk (porównaj Figura 8G i 8F, 8H). Co więcej, segmenty kanalików, które wyrażały slc12a1, były rzadko, jeśli w ogóle, rozgałęzione (ryc. 8G, 8G'), podczas gdy obszary kanalików, które wyrażały slc12a3, były często rozgałęzione w charakterystycznych układach przypominających wiatraczki (ryc. 8H, 8H', 8H", 8H", 8H"', czarne groty strzałek). Wreszcie, podwójne WISH dla markera PCT slc20a1a i markera dystalnego clcnk wykazały, że te plamy nie nakładają się na siebie (Figura 8I). Warto zauważyć, że odcinki segmentów PCT eksprymujących slc20a1a nie były przyłączone do kanalików eksprymujących clcnk, czego się spodziewano, ponieważ PST znajduje się między tymi regionami (Figura 8I). Podsumowując, testy znakowania kanalików nerkowych z wychwytem dekstranu, reaktywnością fosfatazy alkalicznej, DBA i WISH dla określonych transkryptów genów umożliwiają rozróżnienie segmentów proksymalnych i dystalnych.

Rysunek 1. Anatomia nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego. Schematyczne rysunki (A) nerki dorosłego osobnika danio pręgowanego oraz (B) wykres porównawczy cech molekularnych segmentów wykazywanych przez dorosłe i zarodkowe nefrony danio pręgowanego. (A) (U góry po lewej) Dorosła nerka jest płaskim narządem znajdującym się na grzbietowej ścianie ciała. (U góry po prawej), patrząc z perspektywy brzusznej, nerka ma charakterystyczną zakrzywioną morfologię, składającą się z obszarów głowy, tułowia i ogona, a także ma powierzchniową populację powiązanych melanocytów. Powiększenie (u dołu po lewej) pokazuje schemat typowego drzewa nefronowego w nerce dorosłego danio pręgowanego, w którym każdy pojedynczy nefron posiada filtr krwi (krwinkę nerkową) na jednym końcu, a następnie kanalik proksymalny, kanalik dystalny i przewód. Kolorowy schemat (na dole po prawej) przedstawia liniowy diagram jednego dorosłego drzewa nefronowego w celu porównania cech segmentów z cechami embrionów nefronów (B). Nefrony zarodkowe danio pręgowanego zawierają segmenty kanalików, które obejmują proksymalny kanalik kręty (PCT), proksymalny kanalik prosty (PST), dystalny wczesny (DE) i dystalny późny (DL), z odpowiednimi domenami ekspresji genów wymienionymi poniżej. Nefrony u dorosłego grybończyka mają podobny skład segmentowy i analogiczną sygnaturę molekularną opartą na domenach ekspresyjnych genów kodujących transportery substancji rozpuszczonej, chociaż godną uwagi różnicą w porównaniu z zarodkiem jest to, że kilka nefronów może być połączonych za pomocą rozgałęzionego segmentu DL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Mapa schematu blokowego wskazująca relacje między metodami przedstawionymi w tym protokole, wskazująca, w jaki sposób metody mogą być wykonywane pojedynczo lub w różnych kombinacjach. Po dootrzewnowym wstrzyknięciu znakowanego dekstranu utrwalanego lizyną dorosłemu danio pręgowanemu, nerkę można uwidocznić w całym preparacie do mocowania, samodzielnie lub w połączeniu z fosfatazą alkaliczną i / lub barwieniami DBA. Alternatywnie, wybraną nerkę danio pręgowanego można zbadać po histologicznym przekroju tkanki za pomocą kriostatu. Skrawki mogą być barwione w celu oznaczenia wielu kombinacji atrybutów, przy użyciu immunohistochemii, barwienia jądrowego, barwienia DBA i/lub reaktywności fosfatazy alkalicznej. Ponadto skrawki nerek mogą być bezpośrednio uwidocznione pod kątem obecności wychwytu dekstranu utrwalanego lizyną w segmentach PCT. Na koniec wybrane nerki mogą być przetwarzane w celu czasoprzestrzennej ekspresji genów za pomocą WISH. Numery w nawiasach kwadratowych odnoszą się do odpowiednich części protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3. Przygotowanie i zastosowanie płaskiego mocowania nerki dorosłego danio pręgowanego w celu wizualizacji sprzężonego wychwytu dekstranu w segmencie PCT nefronów nerkowych. (A) Obraz w jasnym polu preparatu do płaskiego mocowania próbki nerki, w którym narząd został umieszczony płasko na szkiełku podstawowym, z szkiełkiem nakrywkowym umieszczonym na wierzchu tkanki spoczywającej na czterech wgłębieniach z plasteliny (gorący różowy kolor). W tym przypadku preparat nerkowy jest obrazowany wraz z linijką metryczną, aby zapewnić porównanie w skali. Typowa dorosła nerka ma około 5-7 milimetrów (mm) od głowy do ogona. (B) Obraz w jasnym polu niebielonej nerki. pigmentacja odpowiada rozproszonej populacji melanocytów znajdujących się w połączeniu z nerką, a aorta biegnie wzdłuż linii środkowej nerki. (C) Wizualizacja segmentów PCT nefronu 3 dni po dootrzewnowym wstrzyknięciu 40 kDa dektran-fluoresceiny (FITC), bez wybielania dorosłej nerki. Segmenty PCT są widoczne w całej nerce, ale są częściowo zasłonięte przez melanocyty. (C') Zoom cyfrowy pojedynczego nefronu z melanocytami (biała strzałka). (D) Obraz dorosłej nerki 3 dni po dootrzewnowym wstrzyknięciu 10 kDa dekstranu fluororubinowego, utrwaleniu nerki i wybielaniu. Pigmentacja melanocytów została usunięta, a regiony PCT zostały tutaj uwidocznione na podstawie ich endocytarnego wychwytu dekstranu w jasnym świetle. Kropelki lipidów (strzałka) z jamy brzusznej można czasami zobaczyć w połączeniu z próbkami tkanki nerkowej. (D', D") Reprezentatywne obrazy przedstawiają niewielkie różnice morfologiczne między segmentami PCT. Podczas gdy wiele nefronów PCT jest ciasno zwiniętych (D'), inne nefrony zawierają obszary PCT, które mają minimalne zwijanie (D"). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4. Znakowanie segmentu kanalika PCT nefronu nerkowego u dorosłych. Danio pręgowanego typu dzikiego wstrzykiwano dootrzewnowo pojedynczy koniugat fluorescencyjnego dekstranu; następnie ich nerka została zbadana 3 dni po wstrzyknięciu w celu wizualizacji PCT. (A, A') Kaskadowy błękit dekstranu, 10 kDa (B, B') dekstran lucyfer żółty, 10 kDA i (C, C') dekstran fluororubinowy, 10 kDa preferencyjnie znakują segmenty PCT w nefronach nerkowych. Zarówno kaskada dekstranu niebieskiego, jak i żółcień lucyfera wykazują pewne niespecyficzne znakowanie populacji komórek zrębu znajdujących się między nefronami, ze znacznie wyższym tłem obserwowanym w nerkach leczonych lucyferem żółtym. W przeciwieństwie do tego, dekstran fluoro-rubinowy wykazywał znacznie zmniejszone tło z intensywnym znakowaniem PCT. (D, D') Dorosła nerka wybarwiona metodą WISH w celu wykrycia lokalizacji transkryptów kodujących slc20a1a, specyficzny marker typu komórki transportowej PCT. Domena ekspresji slc20a1a odpowiada charakterystycznemu wzorcowi wychwytu dekstranu obserwowanemu w nerkach, z rozkładem różnych ciasno zwiniętych/zapętlonych domen PCT, a także bardziej wydłużonych odcinków PCT, które wykazują stałą szeroką średnicę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. Reprezentatywny wynik barwienia fosfatazy alkalicznej, markera kanalików pan-proksymalnych, w nerce dorosłego danio proksymalnego w porównaniu z innymi markerami kanalików proksymalnych ocenianymi za pomocą WISH. (A-C) Barwienie fosfatazą alkaliczną (turkusowe) oświetla kanalik proksymalny nefronu, podkreślając zarówno PCT, jak i PST. (D-F') Pojedyncze ŻYCZENIE dla wymienionych genów (każdy w fioletowym zabarwieniu). (D, D') Wzorzec ekspresji cubiliny, markera pan-proksymalnego (PCT-PST), koreluje z fosfatazą alkaliczną (D, D'). Dla porównania, WISH dla mafba oznacza PCT (E, E'), a slc13a1 oznacza PST (F,F'). W (G-G"') podwójne ŻYCZENIE dla markera PCT slc20a1a (czerwony) i markera PST slc13a1 (fioletowy) pokazuje, że segmenty oznaczone tymi markerami nie nakładają się na siebie, a raczej, że ich domeny ekspresji zajmują sąsiednie pozycje, gdy pojedyncze nefrony są dokładnie badane (G'-G"'). Czarne groty strzałek wskazują połączenie między segmentami PCT i PST, które zwykle wiąże się ze zmianą średnicy kanalika odpowiednio z dużej na małą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Fosfataza alkaliczna i wychwyt dekstranu wykazują nakładanie się w segmencie PCT dorosłych nefronów nerkowych, a barwienie fosfatazą alkaliczną jest zgodne ze współznakowaniem jądrowym jodkiem propidyny. (A-I) Preparaty barwienia fosfatazą alkaliczną w całości wykonane na nerkach dorosłych ryb danio pręgowanego, które wcześniej otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie fluororubinu dekstranu. Fosfataza alkaliczna (turkusowa) i dekstran fluororubinowy (czerwony) wykazują nakładanie się w PCT, ale nie w PST, co jest dodatnie tylko w przypadku fosfatazy alkalicznej. Poziomy tła fosfatazy alkalicznej oświetlają parę głównych przewodów zbiorczych w każdej nerce (gwiazdki, *), które wyróżniają się dużą średnicą. (A-C) Scalony obraz i oddzielne obrazy obszaru siodła pojedynczej nerki. (D-F) i (G-I) Dwa zestawy połączonych obrazów i oddzielnych obrazów przykładowych nefronów. (I) Analiza kriosekcji potwierdza wspólne znakowanie fosfatazy alkalicznej i fluororubinu dekstranu w segmentach PCT (zaznaczonych białymi kropkami), podczas gdy sama fosfataza alkaliczna znakuje segment PST (zaznaczony żółtymi kropkami). (K-M) Nerkę znakowano fosfatazą alkaliczną (K) (turkusową) i jodkiem (L) propidyny (fioletową), co umożliwiło (M) połączoną wizualizację odpowiednio komórek kanalików proksymalnych i ich jąder. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 7. Fosfataza alkaliczna i DBA to wzajemnie wykluczające się znaczniki segmentów, które oznaczają odpowiednio regiony pan-proksymalne i pan-dystalne obecne w nefronach nerkowych dorosłego danio pręgowanego. (A-H) Preparaty z całego wierzchowca danio pręgowanego barwionego fosfatazą alkaliczną i rodaminą-DBA. Fosfataza alkaliczna (turkusowa) i DBA (czerwona) nie wykazują nakładania się w nerkach. Poziomy tła fosfatazy alkalicznej oświetlają parę głównych przewodów zbiorczych w każdej nerce (gwiazdki, *), które wyróżniają się dużą średnicą. Kanaliki dodatnie DBA mają cieńszą średnicę i często charakteryzują się obecnością punktów rozgałęzień (białe groty strzałek). (A-C) Scalony obraz i oddzielne obrazy obszaru siodła pojedynczej nerki. (D-F) Jeden zestaw scalonych obrazów i oddzielnych obrazów przykładowych nefronów. (G, H) Dodatkowe przykłady, z rozgałęzionymi kanalikami DBA obok kanalików dodatnich fosfatazy alkalicznej, połączyły obrazy. (I) Analiza kriosekcji potwierdza, że fosfataza alkaliczna i DBA znakują odrębne odcinki kanalików, a tylko rzadkie kanaliki nie wykazują żadnej etykiety (biała strzałka), prawdopodobnie ze względu na kąt przekroju tego kanalika. Do tej analizy wykorzystano transgeniczne ryby typu dzikiego, Tg:enpep:eGFP, a wszystkie kanaliki nerkowe w tej nerce zostały znakowane immunologicznie pierwotnym przeciwciałem w celu wykrycia GFP. (J) Zabarwienie nerki na całym wierzchu dla DBA (czerwony) i DAPI (niebieski) (połączony obraz), ponownie pokazujący rozgałęzione segmenty dystalnych kanalików dorosłych nefronów (biały grot strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Potrójne znakowanie kriosekcji nerek dorosłych z wychwytem dekstranu, fosfatazą alkaliczną i DBA w porównaniu z analizą WISH odcinka dystalnego. (A-E) Dorosłe nerki zostały wstrzyknięte dootrzewnowo z dekstranem-FITC (zielony), a nerki pobrano 3 dni później w celu osadzenia i kriosekcji. Barwienie fosfatazą alkaliczną (turkusowy) i DBA (czerwony) ujawniło trzy populacje kanalików: segmenty PCT, które były dodatnie pod względem reaktywności fosfatazy alkalicznej i dekstranu (zaznaczone białymi kropkami), segmenty PST, które były dodatnie tylko pod względem reaktywności fosfatazy alkalicznej (zaznaczone żółtymi kropkami) oraz dystalne segmenty kanalików, które były dodatnie tylko dla DBA (zaznaczone czerwonymi kropkami), które również wykazywały charakterystyczne dystalne punkty rozgałęzień. (A-D) Scalony obraz i oddzielne obrazy jednej przykładowej sekcji. (E) Scalony obraz innej przykładowej sekcji. (F-I) Porównanie wzorców ekspresji genów kanalików dystalnych według pojedynczego (F-H'") i podwójnego (I) WISH. (F-H') Pojedyncze ŻYCZENIE dla wymienionych genów (każdy w fioletowym zabarwieniu). (F,F') Wzorzec ekspresji clcnk, markera pan-dystalnego (DE-DL), wykryto w cienkich kanalikach, które zawierały punkty rozgałęzień (grot strzałki). (G,G') Dla porównania, WISH dla slc12a1 oznacza DE bez wykrytych punktów rozgałęzień, a (H-H'") slc12a3 oznacza DL, segment charakteryzujący się licznymi punktami rozgałęzień w całym narządzie nerkowym (czarne groty strzałek). (I) Podwójne ŻYCZENIE dla markera PCT slc20a1a (czerwony) i dystalnego clcnk pan-dystalnego (fioletowy). Segmenty oznaczone tymi markerami nie zachodzą na siebie, a raczej ich domeny ekspresji zajmują nieprzylegające pozycje, tak że poszczególne cewki PCT (na dole po prawej) nie przylegają do dystalnych kanalików, a te ostatnie zajmują dyskretne lokalizacje i posiadają charakterystyczne punkty rozgałęzień (grot strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym miejscu opisaliśmy metody, które umożliwiają wizualizację składowych segmentów nefronu u dorosłego danio pręgowanego. Wstrzyknięcie fluorescencyjnych koniugatów dekstranu umożliwia preferencyjne znakowanie PCT ze względu na właściwości endocytarne tych bliższych komórek kanalików^30,38. Metoda ta może być wykonywana z dużą elastycznością ze względu na istnienie dektransu, który można uzyskać za pomocą szeregu różnych koniugatów fluorescencyjnych. Ponadto stosowanie dektransu utrwalanego lizyną jest szczególnie wygodnym sposobem znakowania segmentów PCT, ponieważ nie są wymagane procedury etykietowania wtórnego. Umożliwia to stosunkowo proste wykrywanie sygnału i jest kompatybilne z wieloma innymi znacznikami fluorescencyjnymi, znakowaniem immunologicznym i wykorzystaniem transgenicznych linii reporterowych. Znakowanie fosfatazą alkaliczną oznacza również kanaliki proksymalne, z silną reaktywnością w PCT i nieco słabszą reaktywnością w PST. Wreszcie, barwienie DBA umożliwia znakowanie dystalnych segmentów kanalików, które wykazują charakterystyczną rozgałęzioną morfologię. Różne cząsteczki lektyny, które są białkami wiążącymi cukier pochodzenia nieimmunologicznego, były szeroko stosowane do rozróżniania segmentów nefronu ssaków⁴⁷. Interesujące jest to, że DBA u danio pręgowanego koreluje z dystalnymi segmentami kanalików, ponieważ jest wykorzystywany do oznaczania przewodów zbiorczych w nerkach ssaków⁴⁷.

Podsumowując, metody te mogą być wykorzystywane w różnych kombinacjach do dokumentowania składu i funkcji nerek. Ponieważ wszystkie te metody mogą być stosowane w preparatach nerkowych, dostarczają one narzędzi do oceny struktury i funkcji nefronu w całym narządzie bez całkowitego polegania na bardziej czasochłonnych, żmudnych metodach, np. kriosekcji i znakowaniu immunologicznym. Jednak plamy opisane w tym artykule o metodach są żywotne w kriosekcji. Analiza kriosekcji generuje próbki (w porównaniu z całym wierzchem), które lepiej nadają się do immunohistochemii w celu wykrycia określonych peptydów, choć oczywiście ten rodzaj analizy wymaga dostępności odpowiednich przeciwciał pierwotnych. Niestety, jednym z głównych ograniczeń w pracy z modelem zwierzęcym danio pręgowanego pozostaje słaba dostępność przeciwciał. W związku z tym WISH pozostaje najpowszechniej stosowaną procedurą analizy ekspresji genów. WISH wykorzystujący reakcje substratowe BCIP, NBT i/lub INT w celu wytworzenia fioletowych lub czerwonych osadów nie jest kompatybilny z barwieniem fluorescencyjnym na kriosekcjach. Jedną z opcji byłoby zastosowanie fluorescencyjnej detekcji WISH, procedury, która została zoptymalizowana dla próbek embrionalnych danio pręgowanego i może być dostosowana do użytku z dorosłą nerką. Opis metod w tym artykule wideo powinien pozwolić na dalsze eksperymentowanie z technikami takimi jak fluorescencyjny WISH w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, w których poszczególne segmenty są znakowane za pomocą reportera, takiego jak eGFP lub mCherry. Alternatywnie, opisane tutaj metody mogą być testowane w połączeniu z innymi ważnymi barwnikami, np. innymi lektynami. W związku z tym można by odwołać się do dalszej adaptacji i rozszerzenia opisanych tu metod, aby dostosować je do potrzeb badacza w zakresie preparatów i analizy całej nerki wierzchowca.

W związku z tym metody te mają duży potencjał do zastosowania w modelu danio pręgowanego w trwających badaniach nad regeneracją, a także w modelowaniu chorób genetycznych. Istnieje pilna potrzeba innowacyjnych badań i metod leczenia chorób nerek. Każdego roku miliony ludzi cierpią na jakąś formę choroby nerek, która wynika z przyczyn wrodzonych, ostrych i/lub przewlekłych. Co więcej, częstość występowania chorób nerek stale rośnie na całym świecie, co sprawia, że choroby te stanowią globalny problem zdrowia publicznego^14,15. Dostępne są metody leczenia, takie jak hemodializa, w których zewnętrzna maszyna do dializy służy do usuwania odpadów metabolicznych z krwi pacjenta, jeśli jego nerki nie są w stanie pełnić tej roli. Niestety, interwencja ta ma ograniczenia, ponieważ do przeżycia konieczne jest ciągłe leczenie. Co więcej, pacjenci w końcu będą wymagać przeszczepu nerki, który może trwać latami po umieszczeniu pacjenta na liście oczekujących. Nawet po uzyskaniu przeszczepu nerki wielu pacjentów odczuwa działania niepożądane w wyniku zabiegu i musi walczyć z tymi skutkami do końca życia. Trudności te wskazują na poważną potrzebę opracowania nowych metod leczenia, które pomogą zapobiec chorobom nerek lub być może wspomóc regenerację tkanek^8,16,52,53. Biorąc pod uwagę oczywiste ograniczenia etyczne związane z wykorzystywaniem ludzi w laboratoriach biomedycznych, modele zwierzęce są niezbędne do badania patogenezy chorób u ludzi oraz do testowania nowych metod leczenia. Ze względu na podobieństwo anatomiczne i bliskość ewolucyjną, mysz stała się najczęściej stosowanym modelem choroby człowieka⁴⁵. Istnieją jednak pewne ograniczenia związane z tym zwierzęciem, w tym niemożność wizualizacji rozwoju narządów in vivo i praktyczność wykonywania badań genetycznych na dużą skalę. Danio pręgowany jest istotnym i użytecznym organizmem modelowym do badań nad rozwojem narządów i modelowaniem chorób człowieka^45,46. Jeśli chodzi o choroby ludzkie, homologi funkcjonalne u danio pręgowanego istnieją dla prawie 70% wszystkich ludzkich genów^54,55.

Ostatnie prace podkreśliły przydatność danio pręgowanego w wielu obszarach badań nad nerkami^31,37,56. Badania nad regeneracją i naprawą u danio pręgowanego po AKI sugerują, że regeneracja nabłonka kanalików i neonefrygeneza to dwa procesy, które zachodzą i nakładają się na siebie w całym okresie regeneracji^30,37. Stosowanie antybiotyku aminoglikozydowego zwanego gentamycyną zostało wykorzystane jako paradygmat urazów, za pomocą którego badano wyniki AKI u dorosłych danio pręgowanego^29,30,37. W ciągu około dwóch tygodni po uszkodzeniu przez gentamycynę kanaliki proksymalne regenerują się, a tymczasem w całym narządzie tworzą się nowe nefrony^29,30,37. Ogólnie rzecz biorąc, mechanizmy regulujące regenerację nabłonka pozostają wysoce kontrowersyjne. Jednym z proponowanych mechanizmów procesu naprawy jest początkowy ostry uraz, po którym następuje złuszczenie martwych komórek do światła. Następnie następuje seria zdarzeń deróżnicowania, proliferacji i migracji, po których nowe komórki różnicują się, ponownie zasiedlając uszkodzoną błonę podstawną i przywracając funkcję w uszkodzonym miejscu. Alternatywnie, inne badania sugerują, że komórki zastępcze powstają z komórek macierzystych / progenitorowych, które znajdują się w kanalikach nefronowych. Jeśli chodzi o proces neonefrogenezy u zebry pręgowanego, zaobserwowano agregaty komórkowe po AKI przez wstrzyknięcie gentamycyny^29,30. Agregaty te dojrzewają później do nowych nefronów, które zagłębiają się w już istniejące kanaliki^29,30. Wspólnym mianownikiem łączącym regenerację nabłonka nefronów i neonfrogenezę jest ich tajemniczy czynnik: obecnie istnieje wykładniczo więcej pytań o to, jak zachodzą te wyczyny regeneracyjne, niż dostępnych informacji.

Do tej pory jednak kilka ekscytujących linii dowodów potwierdza pogląd, że badania nad regeneracją nerek z wykorzystaniem danio pręgowanego mogą rzeczywiście dostarczyć istotnych informacji porównawczych na temat ludzkiego AKI, które mogą mieć również bezpośredni potencjał translacyjny^56-58. Chemiczne badania przesiewowe mające na celu identyfikację małych cząsteczek, które zwiększają proliferację komórek progenitorowych nerek w zarodku danio pręgowanego, doprowadziły niedawno do zidentyfikowania inhibitora deacetylazy histonowej metylo-4-(fenylotio)-butanianu (m4PTB)^56,57. Podanie tego związku larwom danio pręgowanego z AKI indukowanym gentamycyną wykazało, że przeżywalność larw wzrosła i zwiększono proliferację kanalików nerkowych^56,58. Kiedy myszy z umiarkowanym AKI wywołanym niedokrwieniem były leczone m4PTB, ich powrót do zdrowia został przyspieszony w związku ze zmniejszeniem zarówno atrofii kanalików, jak i zatrzymaniem cyklu komórkowego proliferujących komórek kanalików nerkowych⁵⁸. Odkrycia te sugerują, że szlaki odpowiedzialne za prawidłowy rozwój nerek danio pręgowanego i/lub odpowiedź regeneracyjną na AKI zostaną zachowane u ssaków⁵⁶.

Tak więc, chociaż potrzebne są dalsze badania, aby wyodrębnić mechanizmy regeneracji – a mianowicie zidentyfikować zaangażowane szlaki sygnałowe i zrozumieć ich interakcje – danio pręgowany stanowi jedną obiecującą drogę do osiągnięcia tego ważnego celu w dziedzinie nefrologii. Narzędzia takie jak znaczniki komórek nefronowych opisane w tym protokole reprezentują jedną grupę testów, które można wykorzystać do oceny składu i funkcjonalności nerek w modelach AKI. Co więcej, mogą być stosowane do charakteryzowania transgenicznych modeli chorób nerek i mogą dostarczyć sposobów identyfikacji chemicznych środków terapeutycznych zdolnych do promowania odbudowy struktury nefronu po uszkodzeniu nerek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS			Wykonany przez rozcieńczenie 10 X PBS w wodzie destylowanej.
1X detergent PBST			0,1% Tween-20 w 1 X PBS.
1X PBS z 0,05% detergentem Tween			0,05% Tween-20 w 1 X PBS.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X PBS			Rozpuścić 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) w 1 X PBS, doprowadzić do wrzenia na płycie grzejnej w dygestorium. Schłodzić i zamrozić porcje do przechowywania w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C. Rozmrozić tuż przed użyciem i nie zamrażać ponownie zapasów.
Cienkie kleszcze	Roboz	RS-1050	Dumont Pęseta Wzór #55
Szkiełko szklane	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Szkiełko nakrywkowe	szklane Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Plastelina	Hasbro	Playdoh	Inne plasteliny można zastąpić i działać podobnie
Uchwyt do szkiełek	Thermo-Fisher	12-587	Opcjonalnie: taca kartonowa do przechowywania preparatów na płasko
Roztwór			wybielającyFormuła mieszanki wybielacza (na 20 ml roztworu): 1,6 ml 10% roztworu wodorotlenku potasu 0,6 ml 30% roztworu nadtlenku wodoru 100 μ l 20% Tween Napełnij do 20 ml wodą destylowaną
Wodorotlenek potasu	Sigma	221473
Nadtlenek wodoru	Sigma	H1009
Roztwór			blokujący Roztwór blokujący (dla 10 ml roztworu): 8 ml 1X PBS z 0,05% Tween 2 ml płodu surowicy cielęcej 150 μ l wykrywania
aktywności fosfatazy alkalicznej	Invitrogen	E6601	Używamy zestawu do wykrywania endogennej fosfatazy ELF 97.  Aby przygotować roztwór substratu roboczego, należy rozcieńczyć substrat 20-krotnie w buforze detekcyjnym, zgodnie z instrukcją producenta.
		do płukania fosfatazy alkalicznej	Przepis na roztwór buforowy do przemywania (na 100 ml roztworu): 5 ml 0,5 M EDTA 120 mg lewamizolu 95 ml 1X PBS
Dextran, fluoresceina, 40 000 MW	Invitrogen	D1844	Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml, i przechowywać porcje w zamrażarce w temperaturze -20°C.
Dekstran, błękit kaskadowy, 10 000 MW	Invitrogen	D1976	Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml, a podwielokrotności przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C.
Dekstran, lucyfer żółty, 10 000 MW	Invitrogen	D1825	Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C.
Dekstran, tetrametylorodamina (fluoro-rubin), 10 000 MW	Invitrogen	D1817	Rozcieńczyć wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -20 stopni C.
Dolichos biflorus aglutynina (DBA)-rodamina	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Roztwór do barwienia (dla 100 μ l roztwór): 1 Μ l z DBA 99 μ l z 1X PBS
Jodek propidyny	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield twardy zestaw podłoża montażowego	Laboratoria wektorowe	H-1400
Szkło z mikro pokrywą	VWR	48393081
Dimetylosulfotlenek, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sacharoza	Sigma	S0289
EDTA, 0,5 M roztwór, pH 8,0	AB00502		Bioanalityczna
Lewamizol	Sigma	L-9756
Podłoże do zamrażania tkanek	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Biopsja Cryomold, 10 x 10x 5 mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380	Scientific	0380W
Liquid blocker – super PAP	pen Mikroskopia elektronowa Sciences	71312
Komora wilgotnościowa na plamy immunologiczne	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Kriostat	Therm	Microm&handel; HM 525 Kriostat
Stereoskop	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-niebieski GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 Używany zestaw filtrów P-TRITC	był następujący: Filtr Hoechst/DAPI był używany do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, dekstranu lucyfera i anty-GFP. Filtr TRITC został użyty do wykrywania dektran-fluoro-rubinu, PI i DBA.
Mikroskop złożony	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Zestaw filtrów był następujący: Filtr Hoechst/DAPI był używany do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, dekstranu lucyfera i anty-GFP. Filtr Texas Red został użyty do wykrywania dektran-fluoro-rubinu, PI i DBA.