Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Trypanosoma brucei powoduje śpiączkę afrykańską u ludzi i chorobę wyniszczającą, nagana, u bydła. Leki stosowane w leczeniu tych chorób są przestarzałe i niezwykle toksyczne, szczepionki nie są dostępne, a potencjał rozwoju lekooporności wymaga poszukiwania nowych celów terapeutycznych¹.

Podczas swojego cyklu życia, T. brucei, na przemian jest nosicielem owada i ssaka; dwoma gospodarzami, którzy prezentują bardzo różne środowiska, w których pasożyt musi przetrwać. Szereg zmian metabolicznych i morfologicznych zachodzi, gdy pasożyt jest narażony na różne warunki środowiskowe. Niektóre z najbardziej dramatycznych zmian obserwuje się w mikrociałach specyficznych dla pasożytów ograniczonych pojedynczą błoną, zwanych glikosomami¹³.

Poziom glukozy jest stosunkowo wysoki (~5 mM) w krwiobiegu, a pasożyty krwiobiegu (BSF) generują ATP wyłącznie poprzez glikolizę, podczas gdy metabolizm mitochondriów jest hamowany¹⁴. W przeciwieństwie do innych eukariontów, u których glikoliza zachodzi w cytoplazmie, T. brucei dzieli większość enzymów glikolitycznych w glikosomy^14,15. Pasożyty są wychwytywane przez muchę tse-tse podczas posiłku z krwi i doświadczają spadku glukozy, która spada do niewykrywalnego poziomu w ciągu 15 minut od spożycia przez muchę. Metabolizm owadów, formy procyklicznej (PCF), pasożytów jest bardziej elastyczny, a glukoza, a także aminokwasy, takie jak prolina, mogą być wykorzystywane w syntezie ATP^16-18. Porównawcze badania proteomiczne ujawniają zależne od cyklu życiowego zmiany w białkach glikosomalnych i mitochondrialnych ze zwiększonym wzrostem białek glikolitycznych w pasożytach krwi i białkach mitochondrialnych zaangażowanych w cykl TCA i łańcuch oddechowy^13,19. Podczas gdy wiele badań koncentrowało się na różnicach między glikosomami BSF i PCF, niewiele wiadomo na temat zmian w glikosomy PCF, które zachodzą w odpowiedzi na zmiany środowiskowe.

W jelicie tylnym muchy poziom glukozy jest niski z przejściowym wzrostem podczas karmienia²⁰. W większości badań in vitro pasożyty PCF są hodowane w pożywkach zawierających glukozę. Jednak ostatnie badania wykazały, że metabolizm PCF zmienia się znacząco w odpowiedzi na dostępność glukozy¹⁷. Przy braku glukozy wzrasta wychwyt proliny i aktywność dehydrogenazy proliny¹⁸. Tej zmianie metabolizmu mitochondrialnego prawdopodobnie towarzyszy zmiana składu i morfologii glikosomu, jednak nie zostało to bezpośrednio ocenione.

Mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna są powszechnie stosowanymi technikami do badania dynamiki glikosomów u T. brucei^2,21-24. Protokoły te są czasochłonne i pracochłonne, kosztowne i trudne do dostosowania do badań w czasie rzeczywistym i protokołów o wysokiej przepustowości. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, system reporterowy fluorescencyjno-organelli używany do badania organelli w systemach ssaków i drożdży został zmodyfikowany do stosowania u T. brucei¹².

Systemy reporterowe organelli fluorescencyjnych były szeroko stosowane u wyższych eukariontów, takich jak komórki drożdży, roślin i ssaków^25-27. W takich układach białko fluorescencyjne jest łączone z sekwencją aminokwasów, która kieruje białko do określonych organelli. Degradację lub syntezę docelowych białek mierzy się za pomocą fluorescencji, a zmiany w składzie organelli są odzwierciedlane przez zmiany we fluorescencji komórek.

Gdy otwarta ramka odczytu wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (eYFP) jest połączona z peroksysomalną sekwencją celującą typu II (PTS2)¹², białko PTS2eYFP jest importowane do dojrzałych, kompetentnych do importu glikosomów, a fluorescencja może być monitorowana za pomocą cytometrii przepływowej. Różnice w składzie glikosomów znajdują odzwierciedlenie w zmianach fluorescencji komórek. System ten może pomóc w rozwiązaniu mechanizmów, które regulują wywołane przez środowisko zmiany w składzie glikosomu.

Ten manuskrypt opisuje generowanie systemu reporterowego glikosomów u pasożytów PCF w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów i podaje przykład tego, jak był on używany do śledzenia zmian w składzie glikosomu w odpowiedzi na różne środowiska. Podsumowując, na skład glikosomów wpływa zewnątrzkomórkowe stężenie glukozy, a przejście kultur logarytmicznych do świeżej pożywki powoduje zmiany w składzie glikosomu. System ten można zmodyfikować w celu zbadania dynamicznego zachowania innych organelli w trypanosomach i innych pasożytach.

1. Ogólna hodowla trypanosomów

1. Zważyć ciała stałe do przygotowania pożywek SDM79 (Tabela 1).
2. Przechowywać w temperaturze 4 °C w 50 ml stożkowym opakowaniu lub woreczku Ziploc. UWAGA: Odczynniki są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.
3. Rozmrozić płodową surowicę bydlęcą (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i okresowo mieszać przez inwersję. UWAGA: FBS jest otrzymywany od dostawcy w postaci sterylnego roztworu. Sterylizacja filtra FBS zmniejsza jego zdolność do wspierania wzrostu pasożytów.
4. Po rozmrożeniu całej butelki podgrzewać surowicę dezaktywującą przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, mieszając okresowo, aby zminimalizować wytrącanie się składników surowicy.
5. Rozmrozić roztwór penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowiec), heminę (2 mg/ml w 50 mM NaOH) i podstawowy roztwór witaminy orła w temperaturze pokojowej.
6. Do cylindra z podziałką o pojemności 1 000 ml dodać 20,2 g substancji stałych SDM79 (Tabela 1) do składników płynnych (Tabela 2) i dobrze wymieszać na płytce mieszającej.
7. Dostosuj pH do 7,35 i dodaj objętość do 850 ml wodą.
8. Filtruj media sterylizacyjne, podłączając wąż próżniowy do dna butelki z filtrem. Zastosuj próżnię, aż roztwór zostanie przefiltrowany.
9. Zdejmij pokrywę filtra w komorze bezpieczeństwa biologicznego i dodaj 150 ml inaktywowanego termicznie FBS. Usuń plastikową osłonę ze sterylnej nakrętki i zamknij butelkę z pożywką.
10. Przygotuj pożywkę SDM80 w taki sam sposób jak SDM79 z następującymi wyjątkami: nie dodawaj glukozy ani glukozaminy i używaj MEM bez glutaminy. W miejsce 150 ml FBS inaktywowanego termicznie dodać 135 ml dializowanego, inaktywowanego termicznie FBS i 15 ml FBS inaktywowanego termicznie.
11. Hodowla pasożytów PCF w kolbie o średnicy 25^cm2 z 10 ml odpowiedniej pożywki w temperaturze 27 °C i 5%_CO2. UWAGA: Komórki należy liczyć codziennie za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego (patrz punkt 6), a hodowle należy utrzymywać w gęstości między 1 x 10⁵ a 5 x 10⁶ komórek/ml.

2. Transfekcja pasożytów PCF za pomocą fluorescencyjnego konstruktu reporterowego

UWAGA: Aby śledzić dynamikę glikosomów, w pasożytach ulega ekspresji białko reporterowe zawierające peroksysomalną sekwencję celującą (PTS2) aldolazy połączonej ze wzmocnionym białkiem fluorescencyjnym na żółto. Sekwencja kodująca białko fuzyjne jest klonowana do pXS2bla¹², który zawiera promotor procykliny i regiony międzygenowe tubuliny, które kierują rekombinację homologiczną do genomu i genu oporności na blasticydynę w celu selekcji. Procykliczne linie komórkowe zawierające geny kodujące polimerazę T7 i represor tetracykliny (PF29-13) są przekształcane za pomocą konstruktu celującego, pXS2:PTS2eYFP.

1. Przygotować cytomiks, mieszając składniki wymienione w Tabeli 3. Filtruj, sterylizuj i przechowuj w RT.
2. Linearyzuj plazmidowe DNA za pomocą MluI, pipetując 10 μl DNA (1 μg/μl), 5 μl buforu enzymu restrykcyjnego, 33 μl wody i 2 μl enzymu MluI do probówki mikrowirówkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
3. Oczyść trawienie restrykcyjne przez dodanie 1 objętości buforu wiążącego do trawienia enzymu restrykcyjnego. Wymieszaj bufor wiążący i strawione DNA przez wirowanie. Krótko odwirować, aby pobrać próbkę na dno probówki.
4. Włożyć kolumnę wiążącą DNA do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i przenieść strawione DNA/roztwór buforowy do kolumny.
5. Wirować przez 10 000 x g przez 1 min. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
6. Dodać 700 μl buforu do płukania SPW i odwirować przy 10 000 x g przez 1 min.
7. Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej, włóż kolumnę z powrotem do probówki zbiorczej i powtórz etap płukania SPW i odwirowania.
8. Wyrzucić przesąc, wwrócić kolumnę do probówki zbiorczej i odwirować pustą kolumnę przez 3 minuty przy 10 000 x g w celu usunięcia pozostałości etanolu.
9. W komorze bezpieczeństwa biologicznego wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę w sterylnej probówce do mikrowirówki.
10. Aby wymyć DNA, dodaj 25 μl sterylnej wody do kolumny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.
11. Dodać kolejne 25 μl sterylnej wody w kapturze bezpieczeństwa biologicznego do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
12. Wirować z prędkością 10 000 x g przez 1 min.
13. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś całą objętość DNA do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. UWAGA: Ten krok zapobiega zanieczyszczeniu z otwartej pokrywy podczas wirowania.
14. Dodać sterylne, oczyszczone, zlinearyzowane DNA (10 μg) do 400 μl cytomiksu sterylizowanego filtrem.
15. Policzyć komórki zgodnie z opisem w sekcji 6 i zebrać 5 x10^{7-10 8} komórek przez odwirowanie przy 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
16. Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 450 μl DNA + cytomiks za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1 ml.
17. Przenieś roztwór zawierający komórki, DNA i cytomiks do sterylnej kuwety z odstępem 4 mm i umieść kuwetę w komorze do elektroporacji.
18. Wybierz "Zanik wykładniczy" i ręcznie wprowadź następujące ustawienia: Napięcie: 1,5 kV, Pojemność: 25 mF, Rezystancja: Ω i Kuweta: 4 mm. Naciśnij impuls. Po zakończeniu impulsu wyjmij kuwetę z komory elektroporacyjnej i wróć do komory bezpieczeństwa biologicznego.
19. Do nowej sterylnej kolby odpipetować 10 ml SDM79. Przenieść przekształcone komórki do kolby z 10 ml SDM79.
20. Inkubować BEZ wyboru leku przez 24 godziny w temperaturze 27 °C, 5% CO₂ . Po 24 godzinach dodać G418 (15 μg/ml), higromycynę (50 μg/ml) i blastycydynę (10 μg/ml). Przepuścić 1 ml przekształconych komórek z lekiem do 9 ml SDM79 z lekiem.
21. Analizuj komórki codziennie, jak opisano w sekcjach 6 i 7. Gdy komórki są fluorescencyjne i osiągnęły gęstość komórek 1 x 10⁷/ml, należy przygotować stabilaty do długotrwałego przechowywania (3.1-3.3).

3. Stabilizacja

1. Aby zrobić pożywkę do zamrażania, dodaj równą objętość 100% glicerolu do cytomiksu i sterylizacji filtra.
2. Dodać 200 μl środka zamrażającego do 800 μl komórek (1 x 10⁷) w kriowiale, delikatnie wymieszać przez odwrócenie i umieścić między dwoma styropianowymi stojakami i zamrozić w temperaturze -80 °C.
3. Po zamrożeniu (~24 godziny) przenieś komórki do ciekłego azotu. UWAGA: Ważne jest, aby przenieść komórki do LN₂ po 24 godzinach, ponieważ dłuższe przechowywanie w temperaturze -80 °C prowadzi do spadku żywotności komórek.

4. Rozmrażanie mrożonych zapasów

1. Wyjąć zamrożoną fiolkę z temperatury -80 °C i rozmrażać w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.
2. Odpipetować 9 ml SDM79 z lekiem do nowej sterylnej kolby. Dodać rozmrożone komórki do tej kolby. Przepuścić komórki w stosunku 1:10, dodając 1 ml tej kultury do 9 ml SDM79 w nowej kolbie (końcowe stężenie 1 x 10⁵/ml).
3. Zanim komórki osiągną gęstość 10⁷ / ml, rozpocznij ustawianie cytometru i testy rozcieńczania.

5. Konfiguracja cytometru

1. Włącz cytometr przepływowy i otwórz program CFlow Plus. UWAGA: Przed uruchomieniem jakichkolwiek próbek, fluidyki należy przepłukać wstecznie i przepłukać zgodnie z krokami 5.2-5.7.
2. Zastąp probówkę z wodą nanoczystą, w której przechowywany jest łyk, pustą probówką.
3. Wybierz przycisk "płukanie wsteczne".
4. Po zakończeniu płukania wstecznego wyjmij probówkę mikrowirówki z łyka i wyrzuć.
5. Umieścić nową probówkę do mikrowirówki zawierającą 1 ml nowej wody nanoczystej na łyku.
6. Wybierz nową studnię w programie CFlow. W sekcji "Limity biegu" ustaw czas na 2 min. W sekcji "Fluidics" wybierz "szybki" i "Uruchom".
7. Po upływie 2-minutowego limitu czasu kliknij przycisk "Usuń przykładowe dane".

6. Zliczanie komórek za pomocą cytometru przepływowego

1. Zastąp wodę próbką, która ma zostać policzona. Ustaw "Run Limits" na 30 s, "Fluidics" na "fast", a następnie wybierz "Run".
2. Po upływie 30-sekundowego limitu czasu CFlow plus poda zdarzenia/μl w polu "Ostatnie uruchomienie". Powtórz liczbę dla każdej kultury. UWAGA: Zanim komórki osiągną 1 x 10⁷ komórek/ml, przystąp do testu rozcieńczania. Komórki należy przerwać po zakończeniu jednego testu rozcieńczania. Komórki hodowane przez dłuższy czas tracą zdolność reagowania na warunki środowiskowe.

7. Pomiar fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego

1. Aby ocenić fluorescencję, ustaw "Limity przebiegu" na 10 000 zdarzeń, a "Fluidyka" na "wolne". Wybierz "Ustaw próg". W sekcji "Próg podstawowy" wybierz "Trwale wyeliminuj zdarzenia na", "FSC-H" (w polu rozwijanym) i wprowadź mniej niż 30 000. Kliknij "zastosuj", a następnie "zamknij".
2. Wybierz przycisk "Histogram" w jednym z nowych okien wykresu i wybierz "FSC-A" Z listy rozwijanej wybierz "FL1-A". UWAGA: FL1-A mierzy fluorescencję w długości fali 530 nm.
3. Wybierz "Uruchom" i powtórz dla wszystkich kultur.
4. Przepuścić roztwór czyszczący przez przewód fluidyczny przez 2 minuty i wodę przez 2 minuty.

8. Testy rozcieńczania

1. Przepuścić komórki do gęstości 1 x 10⁵ komórek/ml w 3 ml SDM79 w kolbie hodowlanej o średnicy 25^cm2 i zmierzyć kwiatostan natychmiast po pasażowaniu, a następnie po 3 godzinach i 24 godzinach.

9. Analiza danych

1. Wybierz zakładkę "Analizuj" w CFlow Plus.
2. Kliknij przycisk "Histogram" w sekcji "Utwórz nowy wykres". Wybierz "FSC-A", a pojawi się lista rozwijana. Wybierz kanał "FL1-A".
3. Zaznacz studnię do analizy. Wybierz przycisk "Brama" i ręcznie narysuj bramę dla interesującej Cię populacji.
4. Flow Plus dostarczy komórkę "Liczba" w tej bramce i "% tej działki".

W tym systemie zaobserwowano zależną od glukozy zmianę składu glikosomu. Kiedy komórki są hodowane w pożywkach zawierających glukozę, obserwuje się dwie populacje; jeden jasny i jeden przyciemniony (rysunek 2A). Ciemne komórki zawierają niedojrzałe glikosomy, które nie zaimportowały PTS2eYFP, podczas gdy jasne komórki zawierają mieszaninę dojrzałych i niedojrzałych glikosomów12. Gdy glukoza jest obecna w pożywce, błędna lokalizacja białek glikosomu jest śmiertelna15,28, a ekspresja białka glikosomu jest prawdopodobnie ściśle sprzężona z importem. Ta ścisła regulacja jest odpowiedzialna za pojawienie się ciemnych komórek, w których ekspresja białka glikosomu jest tłumiona, gdy komórki nie mają wystarczającej zdolności importowej. Gdy maszyneria importu glikosomów jest w pełni zmontowana i funkcjonalna, komórki wyrażają białka glikosomu, które są następnie importowane do glikosomów, dając komórki fluorescencyjne. W pożywkach zubożonych w glukozę tolerancja białek glikosomu jest tolerowana15, a bimodalny rozkład populacji jest zastępowany pojedynczym pikiem o szerszym zakresie fluorescencji (ryc. 2B).

Ten system został użyty do identyfikacji warunków, które wywołują zmiany w składzie glikosomy. Gdy kultury o dużej gęstości zawierające ~10% komórek przyciemnionych (ryc. 3A) są przekazywane do świeżej pożywki, następuje przejściowy wzrost odsetka komórek przyciemnionych (ryc. 3B). Do 24 godzin pierwotny rozkład populacji zostaje przywrócony (ryc. 3C).

Tabela 1. Komponenty bryłowe SDM79.Podane są składniki i ilość pożywek stałych (g/l).

Tabela 2.Składniki płynne SDM79.Podaje się objętości w ml.

Tabela 3. Przepis na cytomiks.

Rysunek 1. Fluorescencyjny system reporterowy glikosomu. A) Całkowanie konstrukcji wyrażenia PTS2eYFP. Trypanosomy PCF transformowano plazmidem pXS2PTS2eYFP zlinearyzowanym enzymem restrykcyjnym MluI. Konstrukt ten integruje się poprzez rekombinację homologiczną z locus tubuliny (Tub), a sekwencje PARP (PARP) zawierają promotor, który napędza konstytutywną ekspresję PTS2eYFP i sekwencje wymagane do przetwarzania RNA. ZA)Import PTS2eYFP. PTS2eYFP jest syntetyzowany w cytoplazmie, gdzie wiąże rozpuszczalny receptor PEX7, który dostarcza białko reporterowe do glikosomów. Po dostarczeniu do błony glikosomu białko jest importowane. Dojrzałe organelle zawierające maszynę importową importują PTS2eYFP i fluorescencję, podczas gdy te, które nie zawierają funkcjonalnej maszynerii importowej, pozostają przyćmione.

Rysunek 2. Kompozycja glikosomów zależna od glukozy. Komórki PCF hodowano w SDM79 (+Glc) lub SDM80 (-Glc) i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Histogramy 10 000 zdarzeń. ZA)Analiza komórek hodowanych w SDM79 konsekwentnie ujawnia dwa piki. Komórki fluorescencyjne zawierają mieszaninę dojrzałych i niedojrzałych organelli z komórkami o wyższej intensywności fluorescencji posiadającymi bardziej dojrzałe glikosomy. W SDM79 błędna lokalizacja białek glikosomu jest śmiertelna, a ekspresja i import białek glikosomu muszą być ściśle kontrolowane. Znajduje to odzwierciedlenie w braku komórek o pośredniej intensywności fluorescencji. ZA)W SDM80 tolerancja jest tolerowana przez błędną lokalizację białek glikosomowych, bimodalny rozkład populacji zostaje utracony i obserwuje się komórki o pośredniej fluorescencji.

Rysunek 3. Przebudowa glikosomu. Przebudowa glikosomów jest wywoływana przez przejście do świeżej pożywki. ZA)Histogram 10 000 zdarzeń w kulturze wyjściowej (~4 x 106/ml). ZA)Po 3 godzinach od rozcieńczenia do świeżego SDM79 następuje wzrost proporcji komórek dim z niedojrzałymi glikosomami mieszczącymi się w lewej bramce C) Histogram rozcieńczonej kultury po 24 godzinach. Po 24 godzinach rozmieszczenie populacji wróciło do normy, ponieważ niedojrzałe glikosomy zawierają teraz białka peroksysomów niezbędne do importu białka fluorescencyjnego.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.