Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51647

⸱

19 sierpnia 2014

 ,  , 
1Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center

W tym artykule

Podsumowanie

Dynamika glikosomów w afrykańskich trypanosomach jest trudna do zbadania za pomocą tradycyjnych technik biologii komórki, takich jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna. Jako sposób obserwacji dynamicznego zachowania organelli, zastosowano system reporterowy fluorescencyjno-organelli w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów.

Streszczenie

Trypanosoma brucei to pasożyt kinetoplastyd, który powoduje u bydła ludzką afrykańską trypanosomatozę (HAT), czyli śpiączkę, oraz chorobę wyniszczającą, nagana, u bydła1. Pasożyt przemieszcza się naprzemiennie między krwiobiegiem żywiciela ssaka a wektorem muchy tse-tse. Skład wielu organelli komórkowych zmienia się w odpowiedzi na te różne warunki zewnątrzkomórkowe2-5.

Glikosomy to wysoce wyspecjalizowane peroksysomy, w których wiele enzymów biorących udział w glikolizie jest podzielonych na przedziały. Skład glikosomów zmienia się w sposób regulowany rozwojowo i środowiskowo4-11. Obecnie najpowszechniejszymi technikami stosowanymi do badania dynamiki glikosomów są mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna; techniki, które są drogie, czasochłonne i pracochłonne oraz niełatwe do dostosowania do analiz o wysokiej przepustowości.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, ustanowiono system reporterowy fluorescencyjno-glikosomowy, w którym wzmocnione białko żółtej fluorescencji (eYFP) jest łączone z sekwencją celującą w peroksysomy (PTS2), która kieruje białko fuzyjne do glikosomów12. Po imporcie białka fuzyjnego PTS2eYFP glikosomy stają się fluorescencyjne. Degradacja i recykling organelli powoduje utratę fluorescencji, którą można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Duża liczba komórek (5 000 komórek/s) może być analizowana w czasie rzeczywistym bez konieczności intensywnego przygotowywania próbek, takich jak utrwalanie i montaż. Metoda ta zapewnia szybki sposób wykrywania zmian w składzie organelli w odpowiedzi na zmienne warunki środowiskowe.

Wprowadzenie

Trypanosoma brucei powoduje śpiączkę afrykańską u ludzi i chorobę wyniszczającą, nagana, u bydła. Leki stosowane w leczeniu tych chorób są przestarzałe i niezwykle toksyczne, szczepionki nie są dostępne, a potencjał rozwoju lekooporności wymaga poszukiwania nowych celów terapeutycznych1.

Podczas swojego cyklu życia, T. brucei, na przemian jest nosicielem owada i ssaka; dwoma gospodarzami, którzy prezentują bardzo różne środowiska, w których pasożyt musi przetrwać. Szereg zmian metabolicznych i morfologicznych zachodzi, gdy pasożyt jest narażony na różne warunki środowiskowe. Niektóre z najbardziej dramatycznych zmian obserwuje się w mikrociałach specyficznych dla pasożytów ograniczonych pojedynczą błoną, zwanych glikosomami13.

Poziom glukozy jest stosunkowo wysoki (~5 mM) w krwiobiegu, a pasożyty krwiobiegu (BSF) generują ATP wyłącznie poprzez glikolizę, podczas gdy metabolizm mitochondriów jest hamowany14. W przeciwieństwie do innych eukariontów, u których glikoliza zachodzi w cytoplazmie, T. brucei dzieli większość enzymów glikolitycznych w glikosomy14,15. Pasożyty są wychwytywane przez muchę tse-tse podczas posiłku z krwi i doświadczają spadku glukozy, która spada do niewykrywalnego poziomu w ciągu 15 minut od spożycia przez muchę. Metabolizm owadów, formy procyklicznej (PCF), pasożytów jest bardziej elastyczny, a glukoza, a także aminokwasy, takie jak prolina, mogą być wykorzystywane w syntezie ATP16-18. Porównawcze badania proteomiczne ujawniają zależne od cyklu życiowego zmiany w białkach glikosomalnych i mitochondrialnych ze zwiększonym wzrostem białek glikolitycznych w pasożytach krwi i białkach mitochondrialnych zaangażowanych w cykl TCA i łańcuch oddechowy13,19. Podczas gdy wiele badań koncentrowało się na różnicach między glikosomami BSF i PCF, niewiele wiadomo na temat zmian w glikosomy PCF, które zachodzą w odpowiedzi na zmiany środowiskowe.

W jelicie tylnym muchy poziom glukozy jest niski z przejściowym wzrostem podczas karmienia20. W większości badań in vitro pasożyty PCF są hodowane w pożywkach zawierających glukozę. Jednak ostatnie badania wykazały, że metabolizm PCF zmienia się znacząco w odpowiedzi na dostępność glukozy17. Przy braku glukozy wzrasta wychwyt proliny i aktywność dehydrogenazy proliny18. Tej zmianie metabolizmu mitochondrialnego prawdopodobnie towarzyszy zmiana składu i morfologii glikosomu, jednak nie zostało to bezpośrednio ocenione.

Mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna są powszechnie stosowanymi technikami do badania dynamiki glikosomów u T. brucei2,21-24. Protokoły te są czasochłonne i pracochłonne, kosztowne i trudne do dostosowania do badań w czasie rzeczywistym i protokołów o wysokiej przepustowości. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, system reporterowy fluorescencyjno-organelli używany do badania organelli w systemach ssaków i drożdży został zmodyfikowany do stosowania u T. brucei12.

Systemy reporterowe organelli fluorescencyjnych były szeroko stosowane u wyższych eukariontów, takich jak komórki drożdży, roślin i ssaków25-27. W takich układach białko fluorescencyjne jest łączone z sekwencją aminokwasów, która kieruje białko do określonych organelli. Degradację lub syntezę docelowych białek mierzy się za pomocą fluorescencji, a zmiany w składzie organelli są odzwierciedlane przez zmiany we fluorescencji komórek.

Gdy otwarta ramka odczytu wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (eYFP) jest połączona z peroksysomalną sekwencją celującą typu II (PTS2)12, białko PTS2eYFP jest importowane do dojrzałych, kompetentnych do importu glikosomów, a fluorescencja może być monitorowana za pomocą cytometrii przepływowej. Różnice w składzie glikosomów znajdują odzwierciedlenie w zmianach fluorescencji komórek. System ten może pomóc w rozwiązaniu mechanizmów, które regulują wywołane przez środowisko zmiany w składzie glikosomu.

Ten manuskrypt opisuje generowanie systemu reporterowego glikosomów u pasożytów PCF w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów i podaje przykład tego, jak był on używany do śledzenia zmian w składzie glikosomu w odpowiedzi na różne środowiska. Podsumowując, na skład glikosomów wpływa zewnątrzkomórkowe stężenie glukozy, a przejście kultur logarytmicznych do świeżej pożywki powoduje zmiany w składzie glikosomu. System ten można zmodyfikować w celu zbadania dynamicznego zachowania innych organelli w trypanosomach i innych pasożytach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ogólna hodowla trypanosomów

  1. Zważyć ciała stałe do przygotowania pożywek SDM79 (Tabela 1).
  2. Przechowywać w temperaturze 4 °C w 50 ml stożkowym opakowaniu lub woreczku Ziploc. UWAGA: Odczynniki są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.
  3. Rozmrozić płodową surowicę bydlęcą (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i okresowo mieszać przez inwersję. UWAGA: FBS jest otrzymywany od dostawcy w postaci sterylnego roztworu. Sterylizacja filtra FBS zmniejsza jego zdolność do wspierania wzrostu pasożytów.
  4. Po rozmrożeniu całej butelki podgrzewać surowicę dezaktywującą przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, mieszając okresowo, aby zminimalizować wytrącanie się składników surowicy.
  5. Rozmrozić roztwór penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowiec), heminę (2 mg/ml w 50 mM NaOH) i podstawowy roztwór witaminy orła w temperaturze pokojowej.
  6. Do cylindra z podziałką o pojemności 1 000 ml dodać 20,2 g substancji stałych SDM79 (Tabela 1) do składników płynnych (Tabela 2) i dobrze wymieszać na płytce mieszającej.
  7. Dostosuj pH do 7,35 i dodaj objętość do 850 ml wodą.
  8. Filtruj media sterylizacyjne, podłączając wąż próżniowy do dna butelki z filtrem. Zastosuj próżnię, aż roztwór zostanie przefiltrowany.
  9. Zdejmij pokrywę filtra w komorze bezpieczeństwa biologicznego i dodaj 150 ml inaktywowanego termicznie FBS. Usuń plastikową osłonę ze sterylnej nakrętki i zamknij butelkę z pożywką.
  10. Przygotuj pożywkę SDM80 w taki sam sposób jak SDM79 z następującymi wyjątkami: nie dodawaj glukozy ani glukozaminy i używaj MEM bez glutaminy. W miejsce 150 ml FBS inaktywowanego termicznie dodać 135 ml dializowanego, inaktywowanego termicznie FBS i 15 ml FBS inaktywowanego termicznie.
  11. Hodowla pasożytów PCF w kolbie o średnicy 25cm2 z 10 ml odpowiedniej pożywki w temperaturze 27 °C i 5%CO2. UWAGA: Komórki należy liczyć codziennie za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego (patrz punkt 6), a hodowle należy utrzymywać w gęstości między 1 x 105 a 5 x 106 komórek/ml.

2. Transfekcja pasożytów PCF za pomocą fluorescencyjnego konstruktu reporterowego

UWAGA: Aby śledzić dynamikę glikosomów, w pasożytach ulega ekspresji białko reporterowe zawierające peroksysomalną sekwencję celującą (PTS2) aldolazy połączonej ze wzmocnionym białkiem fluorescencyjnym na żółto. Sekwencja kodująca białko fuzyjne jest klonowana do pXS2bla12, który zawiera promotor procykliny i regiony międzygenowe tubuliny, które kierują rekombinację homologiczną do genomu i genu oporności na blasticydynę w celu selekcji. Procykliczne linie komórkowe zawierające geny kodujące polimerazę T7 i represor tetracykliny (PF29-13) są przekształcane za pomocą konstruktu celującego, pXS2:PTS2eYFP.

  1. Przygotować cytomiks, mieszając składniki wymienione w Tabeli 3. Filtruj, sterylizuj i przechowuj w RT.
  2. Linearyzuj plazmidowe DNA za pomocą MluI, pipetując 10 μl DNA (1 μg/μl), 5 μl buforu enzymu restrykcyjnego, 33 μl wody i 2 μl enzymu MluI do probówki mikrowirówkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Oczyść trawienie restrykcyjne przez dodanie 1 objętości buforu wiążącego do trawienia enzymu restrykcyjnego. Wymieszaj bufor wiążący i strawione DNA przez wirowanie. Krótko odwirować, aby pobrać próbkę na dno probówki.
  4. Włożyć kolumnę wiążącą DNA do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i przenieść strawione DNA/roztwór buforowy do kolumny.
  5. Wirować przez 10 000 x g przez 1 min. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
  6. Dodać 700 μl buforu do płukania SPW i odwirować przy 10 000 x g przez 1 min.
  7. Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej, włóż kolumnę z powrotem do probówki zbiorczej i powtórz etap płukania SPW i odwirowania.
  8. Wyrzucić przesąc, wwrócić kolumnę do probówki zbiorczej i odwirować pustą kolumnę przez 3 minuty przy 10 000 x g w celu usunięcia pozostałości etanolu.
  9. W komorze bezpieczeństwa biologicznego wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę w sterylnej probówce do mikrowirówki.
  10. Aby wymyć DNA, dodaj 25 μl sterylnej wody do kolumny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.
  11. Dodać kolejne 25 μl sterylnej wody w kapturze bezpieczeństwa biologicznego do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  12. Wirować z prędkością 10 000 x g przez 1 min.
  13. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś całą objętość DNA do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. UWAGA: Ten krok zapobiega zanieczyszczeniu z otwartej pokrywy podczas wirowania.
  14. Dodać sterylne, oczyszczone, zlinearyzowane DNA (10 μg) do 400 μl cytomiksu sterylizowanego filtrem.
  15. Policzyć komórki zgodnie z opisem w sekcji 6 i zebrać 5 x107-10 8 komórek przez odwirowanie przy 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 450 μl DNA + cytomiks za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1 ml.
  17. Przenieś roztwór zawierający komórki, DNA i cytomiks do sterylnej kuwety z odstępem 4 mm i umieść kuwetę w komorze do elektroporacji.
  18. Wybierz "Zanik wykładniczy" i ręcznie wprowadź następujące ustawienia: Napięcie: 1,5 kV, Pojemność: 25 mF, Rezystancja: Ω i Kuweta: 4 mm. Naciśnij impuls. Po zakończeniu impulsu wyjmij kuwetę z komory elektroporacyjnej i wróć do komory bezpieczeństwa biologicznego.
  19. Do nowej sterylnej kolby odpipetować 10 ml SDM79. Przenieść przekształcone komórki do kolby z 10 ml SDM79.
  20. Inkubować BEZ wyboru leku przez 24 godziny w temperaturze 27 °C, 5% CO2 . Po 24 godzinach dodać G418 (15 μg/ml), higromycynę (50 μg/ml) i blastycydynę (10 μg/ml). Przepuścić 1 ml przekształconych komórek z lekiem do 9 ml SDM79 z lekiem.
  21. Analizuj komórki codziennie, jak opisano w sekcjach 6 i 7. Gdy komórki są fluorescencyjne i osiągnęły gęstość komórek 1 x 107/ml, należy przygotować stabilaty do długotrwałego przechowywania (3.1-3.3).

3. Stabilizacja

  1. Aby zrobić pożywkę do zamrażania, dodaj równą objętość 100% glicerolu do cytomiksu i sterylizacji filtra.
  2. Dodać 200 μl środka zamrażającego do 800 μl komórek (1 x 107) w kriowiale, delikatnie wymieszać przez odwrócenie i umieścić między dwoma styropianowymi stojakami i zamrozić w temperaturze -80 °C.
  3. Po zamrożeniu (~24 godziny) przenieś komórki do ciekłego azotu. UWAGA: Ważne jest, aby przenieść komórki do LN2 po 24 godzinach, ponieważ dłuższe przechowywanie w temperaturze -80 °C prowadzi do spadku żywotności komórek.

4. Rozmrażanie mrożonych zapasów

  1. Wyjąć zamrożoną fiolkę z temperatury -80 °C i rozmrażać w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.
  2. Odpipetować 9 ml SDM79 z lekiem do nowej sterylnej kolby. Dodać rozmrożone komórki do tej kolby. Przepuścić komórki w stosunku 1:10, dodając 1 ml tej kultury do 9 ml SDM79 w nowej kolbie (końcowe stężenie 1 x 105/ml).
  3. Zanim komórki osiągną gęstość 107 / ml, rozpocznij ustawianie cytometru i testy rozcieńczania.

5. Konfiguracja cytometru

  1. Włącz cytometr przepływowy i otwórz program CFlow Plus. UWAGA: Przed uruchomieniem jakichkolwiek próbek, fluidyki należy przepłukać wstecznie i przepłukać zgodnie z krokami 5.2-5.7.
  2. Zastąp probówkę z wodą nanoczystą, w której przechowywany jest łyk, pustą probówką.
  3. Wybierz przycisk "płukanie wsteczne".
  4. Po zakończeniu płukania wstecznego wyjmij probówkę mikrowirówki z łyka i wyrzuć.
  5. Umieścić nową probówkę do mikrowirówki zawierającą 1 ml nowej wody nanoczystej na łyku.
  6. Wybierz nową studnię w programie CFlow. W sekcji "Limity biegu" ustaw czas na 2 min. W sekcji "Fluidics" wybierz "szybki" i "Uruchom".
  7. Po upływie 2-minutowego limitu czasu kliknij przycisk "Usuń przykładowe dane".

6. Zliczanie komórek za pomocą cytometru przepływowego

  1. Zastąp wodę próbką, która ma zostać policzona. Ustaw "Run Limits" na 30 s, "Fluidics" na "fast", a następnie wybierz "Run".
  2. Po upływie 30-sekundowego limitu czasu CFlow plus poda zdarzenia/μl w polu "Ostatnie uruchomienie". Powtórz liczbę dla każdej kultury. UWAGA: Zanim komórki osiągną 1 x 107 komórek/ml, przystąp do testu rozcieńczania. Komórki należy przerwać po zakończeniu jednego testu rozcieńczania. Komórki hodowane przez dłuższy czas tracą zdolność reagowania na warunki środowiskowe.

7. Pomiar fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego

  1. Aby ocenić fluorescencję, ustaw "Limity przebiegu" na 10 000 zdarzeń, a "Fluidyka" na "wolne". Wybierz "Ustaw próg". W sekcji "Próg podstawowy" wybierz "Trwale wyeliminuj zdarzenia na", "FSC-H" (w polu rozwijanym) i wprowadź mniej niż 30 000. Kliknij "zastosuj", a następnie "zamknij".
  2. Wybierz przycisk "Histogram" w jednym z nowych okien wykresu i wybierz "FSC-A" Z listy rozwijanej wybierz "FL1-A". UWAGA: FL1-A mierzy fluorescencję w długości fali 530 nm.
  3. Wybierz "Uruchom" i powtórz dla wszystkich kultur.
  4. Przepuścić roztwór czyszczący przez przewód fluidyczny przez 2 minuty i wodę przez 2 minuty.

8. Testy rozcieńczania

  1. Przepuścić komórki do gęstości 1 x 105 komórek/ml w 3 ml SDM79 w kolbie hodowlanej o średnicy 25cm2 i zmierzyć kwiatostan natychmiast po pasażowaniu, a następnie po 3 godzinach i 24 godzinach.

9. Analiza danych

  1. Wybierz zakładkę "Analizuj" w CFlow Plus.
  2. Kliknij przycisk "Histogram" w sekcji "Utwórz nowy wykres". Wybierz "FSC-A", a pojawi się lista rozwijana. Wybierz kanał "FL1-A".
  3. Zaznacz studnię do analizy. Wybierz przycisk "Brama" i ręcznie narysuj bramę dla interesującej Cię populacji.
  4. Flow Plus dostarczy komórkę "Liczba" w tej bramce i "% tej działki".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym systemie zaobserwowano zależną od glukozy zmianę w składzie glikosomów. Podczas hodowli komórek w pożywkach zawierających glukozę obserwuje się dwie populacje: jedną jasną i jedną słabo fluorescencyjną (Rysunek 2A). Komórki słabo fluorescencyjne zawierają niedojrzałe glikosomy, do których nie został zaimportowany PTS2eYFP, natomiast komórki jasne zawierają mieszankę glikosomów dojrzałych i niedojrzałych12. W obecności glukozy w pożywce błędna lokalizacja białek glikosomalnych jest letaln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Glikosomy są niezbędnymi, dynamicznymi, specyficznymi dla pasożytów organellami. Procesy regulujące biogenezę, utrzymanie, proliferację i przebudowę tych organelli prawdopodobnie obejmują cele leków, które można wykorzystać do celów terapeutycznych. Pomimo potencjalnie dużej liczby takich celów terapeutycznych, biogeneza glikosomów pozostaje w tyle za badaniami nad podobnymi procesami w innych organizmach, głównie z powodu braku elastycznego, wysokowydajnego systemu, za pomocą którego można by monitorować szybkie, dynami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Creative Inquiry Program for Undergraduate Research oraz Calhoun Honors College na Uniwersytecie Clemson.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdenozynaAvocado Research Chemicals LtdA10781SDM79 Składnik
L-AlaninaAvocado Research Chemicals LtdA15804SDM79 Składnik
L-argininaCalBiochem1820SDM79 Składnik
Kwas p-aminobenzoesowyICN Biomedicals102569SDM79 Składnik
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)SigmaB6891SDM79 Składnik
BiotynaFisherBP232-1SDM79 Składnik
Chlorek wapniaVWRBDH0224Cytomix
EDTAFisherS311-100Składnik Cytomix
Zestaw do ekstrakcji żelu EZNAOmega BiotekD2500-01Oczyszczanie DNA
Klasa badawcza SerumFisher03-600-511SDM79 Składnik
Kwas foliowyICN Biomedicals101725SDM79 Składnik
Glukozamina HClICN Biomedicals194671SDM79 Składnik
GlukozaGIBCO15023-021SDM79 Składnik
L-GlutaminaCalBiochem3520SDM79 Składnik
GlicerolAcros OrganicsAc15892-0010Pożywka do zamrażania
Pożywka z komórek owadów Graces w proszkuGIBCO11300-043SDM79 Składnik
HeminMP Biomedicals194025SDM79 Składnik
GuanozynaAvocado Research Chemicals LtdA11328SDM79 Składnik
HEPESMP Biomedicals194025SDM79 Składnik
ChlorekmagnezuFisherBP214-500Cytomix składnik
L-metioninaFisherBP388-100SDM79 Składnik
MEM Aminokwasy (50x)Cellgro25-030-CISDM79 Składnik
Mieszanina NEAA (100x)Lonza13-114ESDM79 Składnik
Minimalny niezbędny środek (1x) z L-glutaminąSkładnik Cellgro10-010-CMSDM79
MOPSFisherBP308-500SDM79 Składnik
Biowęglan soduFisherS233-500SDM79 Składnik
Roztwór penicyliny-streptomycynyCellgro30-002-CISDM79 Składnik
L-fenyloalaninaICN Biomedicals102623SDM79 Składnik
Chlorek potasuFisherP217-500Cytomix składnik
Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodnyFisheerP290-212Składnik Cytomix
L-ProlineFisherBP392-100SDM79 Składnik
L-serynaAcros Organics56-45-1SDM79 Składnik
Kwas pirogronowy, sól sodowaAcros Organics113-24-6SDM79 Składnik
L-TaurynaTCI AmericaA0295SDM79 Składnik
L-treoninaAcros Organics72-19-5SDM79 Składnik
L-tyrozynaICN Biomedicals103183SDM79 Składnik
E.Z.N.A. Cycle Pure kitOmega BiotekD6492-02
Bufor wiążącyOmega BiotekPDR041Oczyszczanie DNA
Bufor do płukania SPWOmega BiotekPDR045Oczyszczanie DNA
Gene Pulser XcellBiorad165-2660Transformacja trypanosomów
4 mm Kuwety do elektroporacjiVWRTransformacja trypanosomów
do oczyszczania DNA

Bibliografia

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

białko fluorescencyjnecytometria przepływowakierowanie do peroksysomówprzebudowa organelliTrypanosoma bruceianaliza w czasie rzeczywistympomiar fluorescencjihodowla komórkowawarunki środowiskowe
Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.