Artykuł metodologiczny

Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus)

DOI:

10.3791/51648

⸱

6 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Fisheries & Wildlife, Michigan State University, 2Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minóg morski traci pęcherzyk żółciowy i drogi żółciowe podczas metamorfozy, procesu podobnego do atrezji dróg żółciowych u ludzi. Nowa metoda fiksacji i klarowania (CLARITY) została zmodyfikowana w celu wizualizacji całego drzewa żółciowego za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Ta metoda stanowi potężne narzędzie do badania zwyrodnienia dróg żółciowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atrezja dróg żółciowych jest rzadką chorobą wieku niemowlęcego, z częstością występowania szacowaną na 1 na 15 000 w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych, ale bardziej powszechną w krajach Azji Wschodniej, z częstością zgłaszaną 1 na 5 000 na Tajwanie. Chociaż wiele wiadomo na temat leczenia atrezji dróg żółciowych, jej patogeneza jest nadal nieuchwytna. Minóg morski (Petromyzon marinus) daje wyjątkową okazję do zbadania mechanizmu i postępu zwyrodnienia dróg żółciowych. Minóg morski rozwija się w trzech różnych stadiach życia: larwalnym, pasożytniczym i dorosłym. Podczas przejścia od larw do pasożytniczego młodocianego minoga morskiego przechodzi metamorfozę z dramatyczną reorganizacją i przebudową morfologii zewnętrznej i narządów wewnętrznych. W wątrobie dochodzi do utraty całego układu żółciowego, w tym pęcherzyka żółciowego i drzewa żółciowego. Nowo opracowana metoda o nazwie "CLARITY" została zmodyfikowana w celu wyjaśnienia całej wątroby i połączenia z jelitem u metamorficznego minoga morskiego. Proces zwyrodnienia dróg żółciowych został uwidoczniony i rozpoznany podczas metamorfozy minoga morskiego za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania atrezji dróg żółciowych w unikalnym modelu zwierzęcym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minóg morski rozwija się w trzech różnych etapach życia1,2. Larwy minoga morskiego (L) spędzają większość czasu w norach jako filtry bentosowe. Po przejściu przez siedem etapów metamorficznych dramatycznych zmian w morfologii zewnętrznej i reorganizacji narządów wewnętrznych3, powstałe młode osobniki (JV) wchodzą w fazę pasożytniczą, podczas której żywią się krwią i płynami tkankowymi ryb gospodarzy, zwiększając masę ciała ponad 100-krotnie. Po 1,0 do 1,5 roku żerowania na rybach żywicielskich w oceanie lub dużych jeziorach, dorosłe osobniki przestają żerować wczesną wiosną i migrują do rzek na tarło, a następnie umierają1,2.

Podczas metamorfozy, wątroba minoga morskiego traci woreczek żółciowy i całe drzewo żółciowe, ewolucyjnie zmutowany fenotyp, który naśladuje atrezję dróg żółciowych choroby u niemowląt. Zarośnięcie dróg żółciowych u niemowląt jest rzadką chorobą wątroby u dzieci z ciężkimi powikłaniami medycznymi4,5,6,7,8,9,10, jednak patogeneza i etiologia atrezji dróg żółciowych są w dużej mierze nieznane4. Pacjenci z atrezją dróg żółciowych umierają w ciągu dwóch lat po urodzeniu, chyba że zostanie wykonana interwencja chirurgiczna (procedura Kasai)5. Następnie pacjenci ci wymagają intensywnego leczenia klinicznego i często przeszczepu wątroby 6. Zaproponowano wiele teorii etiopatogenezy atrezji dróg żółciowych, takich jak infekcja wirusowa, wrodzone wady rozwojowe, choroba autoimmunologiczna i toksyczna zniewaga. Jednak wkład każdego z nich w rozwój atrezji dróg żółciowych pozostaje niejednoznaczny7,8,9,10.

W przeciwieństwie do niemowląt, które cierpią na patologiczne atrezje dróg żółciowych, minóg morski przechodzi rozwojowo zaprogramowaną atrezję dróg żółciowych bez rozległego martwiczego zapalenia lub marskości wątroby10. Zwierzęta mogą cierpieć na przejściową cholestazę podczas tego procesu10, ale przystosowują się do tego stanu rozwojowego poprzez syntezę de novo i wydzielanie soli żółciowych w jelicie po rozwojowym atrezji dróg żółciowych, oprócz znanych mechanizmów, takich jak zmniejszenie syntezy soli żółciowych w wątrobie11. Ten proces rozwojowy u minoga morskiego stanowi jedyną znaną możliwość zbadania progresji atrezji dróg żółciowych.

Nowo opracowana metoda o nazwie "CLARITY" umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w złożonych układach nerwowych ssaków poprzez przekształcenie nienaruszonej tkanki w optycznie przezroczysty nanoporowaty hydrożel12. Korzystając z wątroby minoga morskiego i zmodyfikowanego protokołu CLARITY, można udokumentować obrazowanie zwyrodnienia dróg żółciowych w nienaruszonych tkankach podczas metamorfozy wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować 1 l 10 x 0,1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS, pH 7,4): Odważyć 26,2 g fosforanu sodu (jednozasadowego), 115 g fosforanu sodu (dwuzasadowego) i 87,66 g NaCl. Rozpuścić w około 800 ml destylowanegoH2O, dostosować pH i doprowadzić objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.
    1. Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (pH 7,4): Weź 100 ml 10x PBS i dodaj 900 ml destylowanegoH2O.
    2. Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (pH 7,4) z 0,1% Triton X-100: Weź 100 ml 10x PBS, dodaj 1 ml Triton X-100 i zwiększ objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.
  2. Przygotować 1 l 10 x 0,1 M buforu fosforanowego (PB, pH 7,4): Odważyć 26,2 g fosforanu sodu (jednozasadowego) i 115 g fosforanu sodu (dwuzasadowego). Rozpuścić w około 800 ml destylowanegoH2O, dostosować pH i doprowadzić objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.
    1. Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,4): Weź 100 ml 10x PB i dodaj 900 ml destylowanegoH2O.
    2. Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,4) z 0,1% Triton X-100: Pobrać 100 ml 10x PB, dodać 1 ml Triton X-100 i zwiększyć objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.
  3. Przygotować 400 ml roztworu monomeru hydrożelowego (4% akrylamidu, 0,25% bis-akrylamidu, 4% paraformaldehydu, 0,0075% nadsiarczanu amonu, 0,0005% saponiny w 0,1 M PBS): Odważyć 0,3 g nadsiarczanu amonu i 0,2 g saponiny. Dodać 210 ml destylowanegoH2O, 40 ml 40% akrylamidu, 10 ml 2% bis-akrylamidu, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% paraformaldehydu i dobrze wymieszać.
  4. Przygotować 4 litry roztworu klarującego (4% SDS w 0,2 M kwasie borowym): Odważyć 49,464 g kwasu borowego i 160 g SDS. Rozpuścić w około 3,5 l destylowanegoH2O, dostosować pH do 8,5 za pomocą NaOH i zwiększyć objętość do 4 l.
  5. Przygotować 1 l 80% roztworu glicerolu: Odmierz 800 ml glicerolu, dodaj 200 ml destylowanegoH2Oi dobrze wymieszaj.

2. Przygotowanie tkanek

  1. Przygotować roztwór monomeru hydrożelu i podaszkę 10 ml do każdej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  2. Rozciąć całą tkankę i utrwalić w hydrożelu przez 2 dni w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że roztwór hydrożelu jest co najmniej 10 razy większy od objętości tkanki.
  3. Doprowadzić utrwaloną tkankę hydrożelową (w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml) do dygestorium.
  4. Spolimeryzować utrwaloną tkankę hydrożelową, dodając 5 μl TEMED, dobrze wymieszać i pozostawić w dygestorium w temperaturze pokojowej na 2-3 godziny.
  5. Dokładnie usuń nadmiar żelu. Uwaga: Dodatkowy żel utrudni proces oczyszczania i penetrację przeciwciał podczas barwienia.
  6. Inkubować utrwaloną tkankę w 10 ml roztworu klarującego w wytrząsarce inkubatora ustawionej na 70 obr./min i 50 °C przez kilka dni, aż tkanka stanie się przezroczysta. Zmieniaj roztwór czyszczący co najmniej raz dziennie i usuwaj nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu oczyszczającego.
  7. Opłucz chusteczkę w 10 ml 0,1 M PB 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.
  8. Inkubować oczyszczoną tkankę w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała w PB z 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min i 37 °C przez 2 dni. Uwaga: Przygotuj wystarczającą ilość roztworu przeciwciała pierwotnego, aby zanurzyć całą tkankę.
  9. Opłucz chusteczkę w 10 ml PB 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min i 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.
  10. Wykonaj poniższe czynności w ciemnym pomieszczeniu lub przy słabym świetle. Przykryj próbki folią, aby zapobiec wybielaniu zdjęć.
  11. Inkubować oczyszczoną tkankę z fluorescencyjnym roztworem przeciwciał drugorzędowych w PB z 0,1% Triton X-100 i surowicą blokującą przy 70 obr./min i temperaturze 37 °C przez 1 dzień.
  12. Opłucz chusteczkę w 10 ml PB 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min i 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.
  13. Wypłukać chusteczkę w 10 ml PBS przy 70 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.
  14. Inkubować oczyszczoną tkankę w 80% glicerolu przy 70 obr./min i w temperaturze 37 °C przez noc.
  15. Przechowywać fluorescencyjną barwioną tkankę w temperaturze 4 °C przed mikroskopią konfokalną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas metamorfozy minoga morskiego zachodzi kilka ważnych wydarzeń rozwojowych w układzie wątrobowo-żółciowym. Przewód żółciowy i woreczek żółciowy ulegają apoptozie i degeneracji (ryc. 1). Łącząc zmodyfikowaną metodę klarowania i barwienia markerem komórek wątroby cytokeratyną 19 (CK19, obecną zarówno w cholangiocytach, jak i hepatocytach przed i po metamorfozie13) oraz markerem antyapoptotycznym Bcl2 za pomocą mikroskopii konfokalnej, cały układ żółciowy został uchwycony wzdłuż osi Z (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest modyfikowany w oparciu o nową metodę o nazwie "CLARITY"12, która sieciuje nienaruszoną tkankę za pomocą poliakrylamidu w celu utworzenia nanoporowatego hydrożelu, a następnie usuwa błonę plazmatyczną tkanki, aby uzyskać przezroczystość optyczną i przepuszczalność makromolekularną. "CLARITY" umożliwia obrazowanie nienaruszonych tkanek projekcji dalekiego zasięgu i lokalnego okablowania obwodów w układzie nerwowym. Ta nowa metoda może być wykorzystana do wizualizacji całego układu żółciowego w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają wkład Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey. Dziękujemy również dr Melindzie Frame z Centrum Zaawansowanej Mikroskopii na Uniwersytecie Stanowym Michigan za jej wsparcie techniczne w laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Badanie to jest wspierane przez dotacje Komisji Rybołówstwa Wielkich Jezior dla YWCD i WML.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40% akrylamid Bio-Rad161-0140
2% bis-akrylamid Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
nadsiarczan amonu Kwas borowy SigmaA3678-25G
saponina SigmaB7901-1KG
 Sigma47036
dodecylosiarczan sodu SigmaL337-500G
fosforan sodu (monozasadowy)Sigma04269-1KG
fosforan sodu (dwuzasadowy)SigmaS5136-1KG
Triton X-100SigmaX100-500ML
glicerol SigmaG9012-500ML
16% paraformaldehyd Mikroskopia elektronowa Nauki15710-S
Granulki NaOH EMDSX0590-3
Probówki wirówkowe 15 mlNarzędzia
 Dowolna marka
preparacyjne dowolnej marki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
  2. Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
  3. Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
  4. Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
  5. Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
  6. Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
  7. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
  8. Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
  9. Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
  10. Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
  11. Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
  14. Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
  15. Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biliary DegenerationSea LampreyCLARITY MethodLaser Scanning Confocal MicroscopyImmunofluorescent StainingTissue ClearingHydrogel PolymerizationCytokeratin 19BCL TwoMetamorphic Stages

Powiązane artykuły