Artykuł metodologiczny

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51655

⸱

20 maja 2014

 , 
1Reproductive Development and Cancer Laboratory, MIMR-PHI Institute of Medical Research, 2Department of Developmental Biology and Anatomy, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Streszczenie

Rak jajnika daje przerzuty do płynu otrzewnowego i rozprasza się do dystalnych miejsc w otrzewnej. Hodowle jednowarstwowe nie modelują dokładnie zachowań komórek rakowych w nieprzylegającym środowisku, ponieważ komórki rakowe z natury agregują się w struktury wielokomórkowe, które przyczyniają się do procesu przerzutowego poprzez przyczepianie się i atakowanie wyściółki otrzewnej, tworząc guzy wtórne. Aby modelować ten ważny etap przerzutów raka jajnika, można wygenerować agregaty wielokomórkowe lub sferoidy z ustalonych linii komórkowych raka jajnika utrzymywanych w warunkach nieprzylegających. Aby naśladować mikrośrodowisko otrzewnej, z którym spotykają się komórki nowotworowe in vivo, stworzono model kohodowli sferoidy i międzybłonka, w którym wstępnie uformowane sferoidy są powlekane na wierzchu ludzkiej monowarstwy komórek międzybłonka, utworzonej nad barierą macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie opracowano metody wykorzystujące analizator komórek w czasie rzeczywistym do przeprowadzania ilościowych pomiarów w czasie rzeczywistym zdolności inwazyjnych różnych linii komórkowych raka jajnika hodowanych jako sferoidy. Takie podejście pozwala na ciągły pomiar inwazji w długich okresach czasu, co ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi testami końcowymi i bardziej pracochłonnymi analizami obrazów mikroskopowych w czasie rzeczywistym. Krótko mówiąc, metoda ta umożliwia szybkie określenie czynników, które regulują interakcje między komórkami sferoidalnymi raka jajnika atakującymi w czasie przez bariery międzybłonka i macierzy.

Wprowadzenie

Rak jajnika ma najwyższy wskaźnik śmiertelności spośród wszystkich nowotworów ginekologicznych1. Na całym świecie każdego roku odnotowuje się ~230 000 przypadków i ponad 100 000 zgonów z powodu tej choroby1. Większość pacjentów (>75%) rozpoznaje się po przerzutach nowotworu, gdy leczenie jest dodatkowo skomplikowane przez zwiększoną oporność na chemioterapię, a rokowanie jest złe2. Pacjenci z przerzutami w stadium III-IV mają 5-letnie przeżycie wynoszące zaledwie 30-40%3. W związku z tym istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia zachowań komórkowych leżących u podstaw przerzutów raka jajnika, aby skutecznie leczyć zaawansowaną chorobę.

Obecny model przerzutów raka jajnika proponuje kilka etapów procesu przerzutowego, z których każdy zachodzi w odrębnym mikrośrodowisku, które wpływa na zachowanie guza. Przerzuty komórek raka jajnika są początkowo wydalane z pierwotnego miejsca guza i przeżywają w stanie nieprzylegającym w płynie otrzewnowym jako pojedyncze komórki lub trójwymiarowe struktury wielokomórkowe, zwane agregatami wielokomórkowymi lub sferoidami2,4,5. Komórki, które nie tworzą sferoid w zawiesinie, są bardziej podatne na anoikis2,4,5. Sferoidy wykazują również zwiększoną oporność na chemioterapeutyki, przyczyniając się do choroby resztkowej i późniejszego nawrotu nowotworu2,4,5. Drugim krytycznym etapem przerzutów raka jajnika jest przejście agregatów ze swobodnie pływających klastrów do ustalonych guzów wtórnych w obrębie ściany otrzewnej i sieci5,6. Interakcje komórka-komórka i komórka-substrat są zaangażowane w tworzenie agregatów, przeżycie i przyleganie do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wytwarzanej przez wyściółkę międzybłonka otrzewnej4-11. Jak dotąd procesy te są słabo poznane.

Aby zdefiniować mechanizmy związane z rozprzestrzenianiem się raka jajnika, sferoidy mogą być generowane z ustalonych linii komórek nowotworowych przy użyciu metod hodowli nieprzynależnych, utrzymując komórki w zawiesinie albo przez dodanie metylocelulozy do pożywkihodowlanej 12,13, albo przez hodowlę komórek na płytkach o niskim przyczepie2,14. Hodowane w ten sposób komórki raka jajnika łączą się w wielokomórkowe agregaty lub sferoidy, które wykazują podobne właściwości komórkowe, molekularne i biochemiczne do agregatów nowotworowych znalezionych in vivo2,14. Po uformowaniu sferoidy mogą być następnie zbierane z nieprzylegającej pożywki i ponownie powlekane na różnych powierzchniach stałych w celu dalszych badań funkcjonalnych. Stanowi to postęp w porównaniu z testami w hodowli jednowarstwowej, które nie modelują dokładnie zachowań komórek raka jajnika przerzutujących w nieprzylegającym środowisku, takim jak płyn dootrzewnowy.

Zdolność inwazyjna sferoid nowotworowych może być oceniana w tradycyjnych testach końcowych w komorach Boydena2, ale to podejście może być mylące, ponieważ inwazja komórek raka jajnika jest procesem dynamicznym w czasie. Niedawno opracowano metodę czasu rzeczywistego wykorzystującą poklatkową mikroskopię wideo usuwania komórek międzybłonka przez atakujące sferoidy raka jajnika15,16; Jednak analiza danych poklatkowych jest czasochłonna i może być subiektywna. W niniejszym artykule opisano szybką, ilościową metodę oceny inwazyjnych zachowań sferoidów raka jajnika w czasie rzeczywistym. Po pierwsze, stworzono model komórek sferoidalno-międzybłonkowych, który reprezentuje stadium przerzutów raka jajnika, gdy wielokomórkowe sferoidy przyczepiają się do błony śluzowej otrzewnej i atakują ją, tworząc guzy wtórne. Następnie dostosowano metodologię dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym (RTCA; szczegóły firmy można znaleźć w tabeli Materiały) do przeprowadzania ilościowych pomiarów w czasie rzeczywistym zdolności inwazyjnych różnych linii komórkowych raka jajnika hodowanych jako sferoidy i testowanych w tym modelu.

W instrumencie RTCA, odpowiedzi komórkowe są monitorowane w sposób ciągły w trakcie testu, bez potrzeby stosowania egzogenicznych etykiet, poprzez pomiar zmian impedancji elektrycznej. Specjalnie zaprojektowane płytki hodowlane mają pokryte złotem mikroelektrody umieszczone pod mikroporowatą membraną na granicy faz między górną i dolną komorą studzienki 2-komorowej (płytki "CIM"). Umiejscowienie elektrod w dolnej komorze umożliwia pomiar zmian impedancji elektrycznej, gdy ogniwa przenikają przez ECM lub ECM/barierę komórkową. Interfejs membranowy między 2 komorami każdej studzienki płytowej CIM jest najpierw pokryty interesującym komponentem ECM. W systemie modelu komórek sferoidalno-międzybłonkowych interfejs jest pokryty warstwą Matrigelu (szczegóły firmy znajduje się w tabeli Materiały), aby naśladować złożony ECM leżący u podłoża wyściółki międzybłonka otrzewnej, a następnie zlewającą się monowarstwę ludzkich komórek "docelowych" międzybłonka. Na koniec dodaje się wstępnie uformowane sferoidy raka jajnika. Komórki sferoidalne raka jajnika muszą aktywnie przenikać przez warstwę komórek docelowych i matrycę, aby dotrzeć do dolnej komory i zmienić odczyty impedancji elektrycznej. Komórki docelowe same w sobie są również oceniane, aby upewnić się, że nie przenikają przez warstwę matrycy i nadają się do wykorzystania w tym teście.

Protokół

1. Przygotowanie komórek, pożywek i odczynników

  1. Przygotowanie podłoża zawierającego metylocelulozę
    1. Rozpuścić 1,5 g metylocelulozy w 100 ml sterylnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (bez dodatków) w kolbie o pojemności 250 ml.
    2. Podgrzej roztwór na małym ogniu w kuchence mikrofalowej przez 5 minut, uważając, aby nie wykipiał.
    3. Gdy proszek metylocelulozy zostanie częściowo rozpuszczony, dodaj czyste mieszadło magnetyczne i pożywkę, aby zwiększyć objętość do 125 ml.
    4. Wymieszaj, odwróć i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny, a następnie mieszaj w temperaturze 4 °C przez noc.
    5. Podzielić roztwór równomiernie na cztery probówki o pojemności 50 ml i odwirowywać przez 1,5 godziny przy 2 300 x g.
    6. Zebrać klarowny, wysoce lepki supernatant (około 90-95% bulionu), podać do sterylnych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Hodowla i znakowanie komórek
    1. Utrzymuj linie komórkowe raka jajnika w monowarstwie w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w odpowiednich pożywkach wzrostowych (DMEM dla komórek KGN17 i MCBD110:M199 dla OVCA429 i OVCA433 linii komórkowych18) uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminą i 1% penicyliną-streptomycyną.
    2. Utrzymuj ludzkie komórki międzybłonka LP9 w pożywce M199: Hams F12 zawierającej 15% FBS, 10 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 400 ng / ml hydrokortyzonu, w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
    3. Komórki nasienne mają pożądaną wielkość kolby i rosną do około 75% zbieżności. Zbierz komórki przez trypsynizację przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA, wiruj przy 186 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyj osad komórkowy PBS.
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  3. Opcjonalna metoda znakowania komórek fluorescencyjnych
    1. Zawiesić komórki rakowe w końcowym stężeniu 1 x 106 komórek/ml w 1 ml wstępnie podgrzanego PBS/0,1% BSA.
    2. Dodać 2 μl 5 mM podstawowego roztworu CSFE Cell Trace (lub innej preferowanej etykiety komórkowej, która jest zachowywana przez długi czas) do komórek o końcowym stężeniu 10 μM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut w łaźni wodnej.
    3. Ugasić reakcję 1 ml lodowatej pożywki zawierającej 10% FBS i ponownie zagletować przez odwirowanie. Zawiesić ponownie w 10 ml odpowiedniej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej (patrz krok 1.2.1).
    4. Komórki nasienne umieścić w kolbie z filtrem o średnicy 75cm2 i wyhodować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    5. Sprawdź komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby sprawdzić, czy poziom znakowania fluorescencji jest odpowiedni do wykrycia. Gdy komórki osiągną około 75% konfluencji, zbierz i policz jak w krokach 1.2.3 i 1.2.4 powyżej.

2. Generowanie sferoid w metylocelulozie

  1. Oblicz objętość komórek raka jajnika z sekcji 1 potrzebną do wytworzenia sferoidów (w sumie 300 000 komórek jest potrzebnych do każdego pełnego eksperymentu z płytką 96-dołkową). Uwaga: w przypadku korzystania z różnych linii komórkowych niż przedstawione tutaj, może być konieczne zoptymalizowanie gęstości komórek w celu uzyskania jednolitego generowania sferoidów dla każdej linii.
  2. Aby obliczyć rozcieńczenie komórek w pożywce metylocelulozowej, należy najpierw odjąć wymaganą objętość komórek (krok 2.1) od 15 ml.
  3. Dodać 3 ml roztworu podstawowego metylocelulozy (aby uzyskać 20% metylocelulozy końcowej) do objętości pożywki hodowlanej odpowiedniej dla każdej linii komórkowej, równej 15 ml minus objętość komórki i dokładnie wymieszać przez delikatne odwrócenie.
  4. Dodać 300 000 komórek do pożywki zawierającej metylocelulozę i dokładnie wymieszać przez delikatne odwrócenie.
  5. Pobrać pipetą 150 μl mieszaniny komórka/metyloceluloza/pożywka (w sumie 3 000 komórek/studzienkę) do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej z wklęsłym dnem i hodować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-4 dni lub do momentu utworzenia się jednolitych sferoid (zwykle obserwuje się 1 sferoidę/studzienkę).

3. Testy inwazji komórek RTCA

UWAGA: Odczyty impedancji są wyrażone jako Indeks Komórki (CI), parametr bezwymiarowy, który jest względną zmianą w mierzonej impedancji komórki reprezentującą stan komórki. Na potrzeby analizy zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel.

  1. Przygotowanie talerza
    1. Pracując w grupach po 4 dołki na raz, dodaj 50 μl matrycy (rozcieńczonej 1:10 w pożywkach hodowlanych bez surowicy) do każdej studzienki górnej komory 16-dołkowej płytki RTCA CIM, aby upewnić się, że całkowita powierzchnia jest pokryta. Natychmiast usunąć 30 μl matrycy, ale powoli, aby pozbyć się nadmiaru płynu.
    2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przed użyciem w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    3. Dodać 30 μl pożywki bezsurowicowej (SFM) odpowiedniej dla każdej linii komórek rakowych do górnej komory i 160 μl pożywki z surowicą lub bez (zgodnie z projektem eksperymentalnym) do dolnej komory.
    4. Zamontuj płytkę CIM, zatrzaskując dolną komorę w górnej komorze i równoważ w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli tkankowych.
  2. Programowanie przyrządu RTCA
    1. Otwórz program RTCA i wybierz zakładkę "Układ". Zaznacz wszystkie eksperymentalne studnie.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy na studnie i wybierz "Włącz studnie", a następnie wypełnij warunki eksperymentalne i nazwy komórek zgodnie z potrzebami.
    3. Aby dodać kroki lub podkroki do programu, wybierz zakładkę "Harmonogram" i kliknij prawym przyciskiem myszy "Dodaj krok". Pierwszym krokiem jest wstępnie zaprogramowane zamiatanie w tle, które jest automatycznie włączane do programu po wybraniu opcji "dodaj krok".
    4. Wprowadź żądane szczegóły programu dla kroku 2 programu RTCA, który będzie rejestrował odczyty podczas tworzenia monowarstwy LP9. Dodaj odstępy czasu między odczytami impedancji, wybierając zakładkę "Interwał" i wpisując "15 min". Dodaj eksperymentalny czas trwania, wybierając zakładkę "Czas trwania" i wprowadzając czas z przedziału 12-24 godzin.
    5. Aby dodać kolejne kroki, wybierz zakładkę "Harmonogram" i kliknij prawym przyciskiem myszy na "Dodaj krok" i wprowadź szczegóły dodatkowych kroków, jak wyżej. Krok 3 programu RTCA skieruje instrument do wykonywania odczytów podczas inwazji sferoidów; wpisz "5 min" w zakładce "Interwał" i "48 godzin" w zakładce "Czas trwania".
    6. Wybierz "Płyta" na pasku menu i zapisz.
  3. Generacja monowarstwy LP9 i pomiar inwazji sferoid
    1. Umieść tabliczkę CIM w przyrządzie RTCA i otwórz program z kroku 3.2 powyżej. Przed dodaniem komórek wybierz "Wykonaj" na pasku menu, a następnie "Uruchom". Czyszczenie w tle zostanie wykonane automatycznie (krok 1 w instrukcjach oprogramowania RTCA).
    2. Wyjmij płytkę CIM z instrumentu zgodnie z przemiataniem tła i umieść w kapturze do hodowli tkankowej.
    3. Płytka 50 000 komórek LP9 zawieszona w 160 μl SFM w górnej komorze każdej studzienki płytki CIM.
    4. Umieść płytkę w przyrządzie RTCA i wykonuj odczyty co 15 minut, podczas gdy monowarstwa LP9 tworzy się przez noc (krok 2 programu RTCA).
    5. Zbieranie sferoid nowotworowych wytworzonych w ramach etapu 2 "Wytwarzanie sferoidów w metylocelulozie", powyżej.
      1. W aseptyce odciąć 1 mm od górnej części końcówki pipety o pojemności 1 ml i delikatnie pobrać zawartość każdej studzienki. Przenieść do sterylnej probówki.
      2. Odwirować sferoidy przy 120 x g przez 8 minut i usunąć pożywkę zawierającą metylocelulozę przez delikatne zasysanie.
      3. Płukać sferoidy jeszcze dwukrotnie za pomocą PBS, odwirowując przy 120 x g przez 8 minut w celu osadzenia sferoid po każdym myciu.
      4. Dla każdej studzienki doświadczalnej należy ponownie zawiesić łącznie 10 sferoid w 160 μl pożywki bez FBS.
      5. Wstrzymaj eksperyment RTCA, wybierając opcję "Wykonaj" z paska menu i zaznaczając opcję "Wstrzymaj". Wyjmij płytkę CIM z instrumentu i umieść ją w kapturze do hodowli tkankowej. Odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić pożywką zawierającą sferoidy (10 kulek w 160 μl) lub świeżą pożywką w przypadku studzienek kontrolnych zawierających tylko LP9.
    6. Umieść płytkę z powrotem w przyrządzie RTCA. Wybierz "Wykonaj" z paska menu i zaznacz "Przerwij krok". Program automatycznie przejdzie do następnego kroku. Aby wznowić eksperyment, wybierz opcję "Wykonaj" z paska menu i zaznacz opcję "Uruchom/Kontynuuj". Rozpocznie się krok 3 w programie RTCA.
  4. analiza danych
    1. Aby określić poziom inwazyjności komórek sferoidalnych, należy odjąć wartości uzyskane dla monowarstwy LP9 tylko od indywidualnych odczytów uzyskanych dla linii komórkowych raka jajnika w każdym punkcie czasowym.
    2. Aby wykreślić "inwazję sferoidów", znormalizuj wszystkie wartości do punktu czasowego, w którym sferoidy zostały dodane do płytki, ustawiając ten punkt czasu na "0".

Wyniki

Sferoidy raka jajnika można generować z wielu typów linii komórkowych, hodując je w zawiesinie lub pobierając pierwotne komórki nowotworowe z złośliwej wodobrzusza2,14. W niniejszej metodzie do generowania sferoidów wykorzystano dwie linie komórek raka nabłonkowego jajnika, OVCA433 i OVCA429, oraz linię komórek guza komórek ziarnistych jajnika, KGN (Ryc. 1A). W tej metodzie komórki hoduje się w dołkach o dnie w kształcie litery U, w zawiesinie w pożywce, której lepkość zwiększono poprzez dodanie metylocelulozy. W takich warunkach wiele komórek raka jajnika wykazuje wrodzoną zdolność do agregacji w sferoidy13. Po całonocnej hodowli w zawiesinie w pożywce z metylocelulozą wszystkie trzy linie komórkowe utworzyły zwarte struktury sferoidalne o średnicy około 400-500 μm (Ryc. 1A). W tym czasie przygotowuje się płytkę RTCA CIM, najpierw pokrywając porowatą błonę interfejsu macierzą, a następnie tworząc konfluencyjną monowarstwę ludzkich komórek mezohelialnych (Ryc. 1B). Po ich uformowaniu sferoidy są przenoszone na przygotowaną płytkę CIM. Pobrane sferoidy nowotworowe wysiewa się na monowarstwę LP9 i ocenia zgodnie z opisem poniżej. W celu ułatwienia interpretacji danych RTCA okresowo wykonuje się obrazy równoległych hodowli przy użyciu standardowej mikroskopii fazowej (lub mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli wykonano opcjonalny etap znakowania komórek) (Ryc. 1C).

Warto ocenić zarówno podstawowy poziom inwazyjności linii komórkowej raka, jak i inwazję indukowaną chemoatraktantem. Zazwyczaj inwazyjność podstawową mierzy się poprzez dodanie SFM do obu komór, górnej i dolnej. W niniejszym przykładzie do zbadania inwazji „indukowanej chemoatraktantem” zastosowano pożywkę kompletną (10% FBS), która zawiera wiele potencjalnych chemoatraktantów (Rysunek 2). Równoległe badania samych komórek mezohelialnych LP9 potwierdziły, że komórki te wykazują minimalną inwazyjność w ciągu 2 dni, zarówno w warunkach podstawowych, jak i indukowanych „chemoatraktantem”, i tym samym stanowią odpowiedni typ komórek do zastosowania w testach kokultury z komórkami raka jajnika (Rysunki 2A i 2B). W przeciwieństwie do nich, sferoidy raka jajnika wytworzone z dowolnej z trzech linii komórkowych wykazały zdolność do inwazji w kierunku chemoatraktanta (FBS) (Rysunki 2A-2C). Główną zaletą stosowania aparatury RTCA do pomiaru w czasie rzeczywistym w porównaniu z tradycyjnymi testami końcowymi jest możliwość ilościowego określenia zmian w zachowaniu komórek/sferoidów w czasie. W ciągu 2-dniowego testu linie komórkowe KGN, OVCA429 i OVCA433 wykazywały zdolność do inwazji w kierunku chemoatraktanta (co wskazywały rosnące indeksy komórkowe), ale niskie podstawowe poziomy inwazji (Rysunek 2C). Linie komórkowe wykazywały podobne tempo inwazji, co wskazywały równoległe nachylenia krzywych (Rysunek 2C); jednak krzywa dla OVCA429 wykazała wyższą asymptotę górną, co wskazywało na wyższy maksymalny poziom inwazji w porównaniu z innymi liniami komórkowymi. Ponadto linie komórkowe wykazywały różnice w czasie rozpoczęcia inwazji: komórki KGN szybko przenikały przez bariery komórkowe i macierzyowe, natomiast komórki OVCA433 i OVCA429 potrzebowały odpowiednio 3-5 razy więcej czasu na inwazję (Rysunek 2D). Co istotne, ich zachowanie w momencie rozpoczęcia inwazji nie pozwalało na przewidzenie ich całkowitej zdolności do inwazji (Rysunki 2C i 2D). Sugeruje to różnice w wrodzonych możliwościach linii komórkowych raka, ale może również wskazywać, że różne czynniki mogą regulować wczesne i późne zachowania inwazyjne sferoidów.

Sferoidy komórkowe, monowarstwy i schemat komory do analizy hodowli komórkowych.
Rycina 1. Generowanie sferoidów i model układu eksperymentalnego. A: Obrazy wykonane za pomocą mikroskopii kontrastowej fazowej przedstawiające sferoidy tworzące się w metylocelulozie/pożywce (góra) oraz odpowiadającą im linię komórkową hodowaną jako monowarstwę (dół). B: Schemat przedstawiający konfigurację studni płytki CIM RTCA z dwiema komorami, w której wcześniej uformowane sferoidy raka jajnika są wysiewane na monowarstwę bariery z komórek mezotelialnych LP9/macierzy w górnej komorze, a do dolnej komory dodawana jest pożywka ±FBS jako chemoatraktant. Elektrody znajdujące się pod interfejsem obu komór mierzą wzrost impedancji elektrycznej w miarę jak coraz więcej komórek infiltruje bariery do dolnej komory. C: Obrazy sferoidów KGN na monowarstwie LP9 wykonane za pomocą mikroskopii kontrastowej fazowej (lewo) lub mikroskopii fluorescencyjnej (prawo). Paski skali = 100 μm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Porównanie proliferacji komórek za pomocą wykresów przedstawiających sferoidy raka jajnika; analiza indeksu komórkowego w czasie.
Rysunek 2. Dane dotyczące inwazji sferoidów raka jajnika w czasie rzeczywistym. A - B: Reprezentatywne wyniki testu inwazji RTCA przeprowadzonego z dodatkiem i bez dodatku FBS w dolnej komorze studni płytki CIM. Inwazję komórek KGN porównano z komórkami mezoteliów LP9. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SD indeksu komórkowego (Cell Index) z trzech powtórzeń w punkcie czasowym 24 h (A) oraz w trakcie całego dwudniowego okresu testu (B). C - D: Porównanie potencjału inwazyjnego linii komórkowych KGN, OVCA429 i OVCA433 przedstawione w okresie 24 h (C) oraz bardziej szczegółowo w okresie 2,5 h (D).

Dyskusja

Atakujące komórki raka jajnika oddziałują z różnymi typami komórek na powierzchni otrzewnej, w tym z fibroblastami, adipocytami i komórkami międzybłonka, a dwukierunkowa komunikacja między komórkami rakowymi a komórkami otrzewnej odgrywa kluczową rolę w napędzaniu procesu przerzutowego2. Po opanowaniu, opisany w niniejszym dokumencie protokół można łatwo dostosować do badania tych interakcji w mikrośrodowisku otrzewnej, np. poprzez dodanie egzogennych cytokin, czynników wzrostu lub specyficznych inhibitorów do górnej lub dolnej komory studzienki płytki CIM lub manipulację genetyczną linii komórkowych raka lub otrzewnej. Ponadto metoda ta może być stosowana w przypadku pierwotnych komórek nowotworowych jajnika pobranych świeżo ze złośliwego wodobrzusza i/lub pierwotnych komórek otrzewnej w celu uzyskania bezpośredniego wglądu w sygnały regulacyjne i interakcje komórkowe, które regulują powstawanie przerzutów w jamie otrzewnej2.

Zastosowanie przyrządu RTCA do pomiaru zdolności inwazyjnej pojedynczych komórek lub sferoid ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi testami pojedynczego punktu końcowego i analizami obrazów poklatkowych. Przyrząd RTCA mierzy inwazję komórkową w określonych odstępach czasu w sposób ciągły w trakcie testu, który może trwać godziny lub dni. Umożliwia to określenie zmian w szybkości inwazji w czasie, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia testów z pojedynczym punktem końcowym. Na przykład, badanie danych dotyczących inwazji z różnych linii komórek nowotworowych w jednym punkcie końcowym (Figura 2), np. 3 godziny, mogło doprowadzić do błędnego wniosku, że komórki KGN i OVCA433 były znacznie bardziej inwazyjne niż komórki OVCA429. Kolejną zaletą tej technologii jest to, że przyrząd RTCA mierzy zmiany impedancji elektrycznej. Oznacza to, że testy można przeprowadzać bez znakowania komórek czynnikiem egzogennym, co może mieć niezamierzony wpływ na fenotyp lub funkcję komórki. Staje się to szczególnie ważne podczas badania komórek pierwotnego raka jajnika pochodzących ze złośliwego wodobrzusza, w przypadku którego konieczne jest ograniczenie manipulacji do minimum, aby uniknąć wprowadzania zmian molekularnych i fenotypowych, które nie odzwierciedlają ich natury in vivo 2. Co więcej, wykorzystanie instrumentu RTCA umożliwia gromadzenie danych ilościowych w czasie rzeczywistym, co nie tylko pozwala uniknąć czasochłonnych analiz związanych z mikroskopią poklatkową, ale także umożliwia szybkie określenie kluczowych okien eksperymentalnych do optymalizacji testów. Jest to szczególnie przydatne przy porównywaniu wpływu szeregu czynników na inwazję sferoidów, ponieważ różne czynniki mogą wywierać swoje maksymalne efekty w różnych punktach czasowych lub o bardzo różnych profilach w czasie.

Chociaż protokół ten jest podatny na zmiany (np. użycie różnych matryc ECM, różnych linii komórek rakowych lub różnych komórek docelowych), jeśli to robisz, ważne jest, aby pamiętać, że najpierw należy zoptymalizować różne warunki eksperymentalne. Na przykład, przed rozpoczęciem badań nad inwazją sferoidów, optymalna liczba komórek nowotworowych/studzienka na płytce CIM powinna być najpierw określona za pomocą testu miareczkowania liczby komórek w hodowli jednowarstwowej. Optymalna liczba sferoid do użycia na studzienkę jest następnie oparta na tej analizie. Na przykład w obecnej metodzie sferoidy składają się z około 3000 komórek każda, gdy są generowane po raz pierwszy. Jeśli początkowe miareczkowanie liczby komórek wskazuje, że 30 000 komórek w monowarstwie jest optymalnych do wykrycia w analizach inwazji, wówczas dodaje się 10 sferoid na każdą płytkę CIM. Ponadto, podczas przeprowadzania eksperymentów z jednoczesną hodowlą, ważne jest, aby oddzielnie badać zachowania monowarstwy komórek "docelowych" w celu ustalenia, czy komórki te są z natury inwazyjne, ponieważ może to zakłócić wyniki. W pokazanym przykładzie sferoidy nowotworowe są posiewane na wierzchu monowarstwy komórek LP9, z FBS i bez FBS dodanym do dna oraz jako chemoatraktant. Równolegle komórki LP9 są hodowane samodzielnie, w każdych warunkach leczenia.

Podobnie, badając zdolność inwazyjną komórek i sferoid, ważne jest również zbadanie ich zdolności migracyjnych, aby rozróżnić te dwa zachowania (tj. inwazja wymaga proteolitycznego trawienia bariery ECM, podczas gdy migracja nie). W tym celu należy pominąć barierę ECM (kroki 3.1.1 - 3.1.3) i przeprowadzić test równolegle z istniejącą barierą ECM. W razie potrzeby ten drugi środek "inwazji" może zostać skorygowany do pierwszego środka "migracji". Na koniec należy zauważyć, że informacje uzyskane z pomiarów impedancji elektrycznej mają ograniczony zakres: gdy komórki wnikną do dolnej komory, zmiany w ich przyczepieniu, rozprzestrzenianiu się i proliferacji na spodniej stronie membrany mogą przyczyniać się do zmian w odczytach impedancji. Dlatego ta metodologia jest najbardziej pouczająca, gdy jest stosowana w połączeniu z innymi testami żywotności komórek sferoidalnych, adhezji, migracji i morfologii w celu kompleksowej oceny zachowań komórek sferoidalnych. Na przykład, idealnie, aby w pełni zrozumieć interakcje sferoida-międzybłonek, oddzielne kokultury powinny być również okresowo obrazowane w ramach standardowej mikroskopii fazowej, tak aby można było dokonywać jakościowych ocen morfologii i zdrowia sferoidów równolegle z ilościowymi testami RTCA inwazji. Jeśli zostanie wykonany opcjonalny etap znakowania, wówczas zachowanie pojedynczych komórek rakowych można określić pod mikroskopią fluorescencyjną, gdy oddzielają się one od sferoidy i oddziałują z nieznakowanymi komórkami międzybłonka. Dodatkową korzyścią płynącą z fluorescencyjnego znakowania komórek rakowych podczas jednoczesnej hodowli z drugim typem komórek jest to, że możliwe jest potwierdzenie, że tylko komórki rakowe zaatakowały przez barierę komórkową i ECM.

Podsumowując, metoda ta stanowi wysokoprzepustową analizę ilościową inwazji sferoidalnej raka jajnika na bariery międzybłonka i ECM. Poprzez dodanie egzogennych cytokin, czynników wzrostu lub specyficznych inhibitorów do górnej lub dolnej komory płytki CIM, metoda ta umożliwia szybkie określenie czynników, które regulują interakcje między komórkami sferoidalnymi raka jajnika atakującymi w czasie przez barierę międzybłonka i macierzy.

Oświadczenia

Opłata za otwarty dostęp uiszczona przez ACEA Biosciences, Inc. i MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grant Nauki i Medycyny Fundacji CASS; (MB); grant projektowy Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii (KLS, 338516); oraz przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu Wiktorii (Australia).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
xCELLigence RTCA DP AnalizatorACEA biosciencesRTCA DP
xCELLigence Płytki CIM ACEA biosciences5665817001
Cell TraceTM CFSE Sondy molekularneC34554
Metyloceluloza (4,000 centypozy)SigmaM0512
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco)Technologie życia 11966-025
Średni 199 Technologie życiowe 
Mieszanka składników odżywczych F-12 firmy Ham'sLife Technologies 
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)PeproTech 100-15
Hydrokortyzon SigmaH4001
Trypsin EDTAGibco-Invitrogen15400-054
96-dołkowa wklęsła płytka hodowlana Grenier Bio-One650185
LP9 Ludzka linia komórkowa międzybłonkaCoriell Institute for Medical Research 
Matrigel Matrix o obniżonym współczynniku wzrostuBD Biosciences Numer telefonu 354230
1115006711765062AG07086

Bibliografia

  1. Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
  2. Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
  3. Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
  4. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  5. Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
  6. Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
  7. Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6(2006).
  8. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
  9. Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
  10. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  11. Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
  12. Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
  13. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
  14. Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
  15. Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
  16. Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  17. Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
  18. Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inwazja komórek mezoteliówanalizator komórkowy w czasie rzeczywistymtest z użyciem płytek CIMhodowla w metyloceluloziefrakcja naczyniowa zstrojonafluorescencyjne znakowanie komórekinwazja indukowana chemoatraktantempomiar inwazji podstawowejmodel mikrośrodowiska otrzewnej
Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.