Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Podsumowanie

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Streszczenie

Ilościowa proteomika w połączeniu z oczyszczaniem immuno-powinowactwa, immunoprecypitacją SILAC, stanowią potężny środek do odkrycia nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, można łatwo odróżnić prawdziwe interakcje od zanieczyszczeń eksperymentalnych. Oddziaływania o niskim powinowactwie mogą być zachowane dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych i pozostają łatwe do zidentyfikowania. W protokole tym omówiono znakowanie komórek hodowli tkankowej stabilnymi aminokwasami znakowanymi izotopami, transfekcję i immunoprecypitację białka znakowanego powinowactwem, a następnie przygotowanie do przesłania do zakładu spektrometrii mas. Protokół ten następnie omawia, w jaki sposób analizować i interpretować dane zwrócone ze spektrometru mas w celu identyfikacji partnerów komórkowych oddziałujących z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Na przykład technika ta jest stosowana do identyfikacji białek wiążących się z eukariotycznymi czynnikami inicjacji translacji: eIF4AI i eIF4AII.

Wprowadzenie

Niezbędnym krokiem w zrozumieniu funkcji białka jest identyfikacja odpowiednich białek oddziałujących na siebie. Tam, gdzie takie białka są nieznane, dostępnych jest wiele technik, z których każda ma swoje zalety i wady. Należą do nich system dwuhybrydowy drożdży, testy pulldown z użyciem białka rekombinowanego, a także oczyszczanie powinowactwa w tandemie lub znakowanie TAP ^1,2.

Nowszym dodatkiem do tych technik jest połączenie oczyszczania z powinowactwem interesującego białka z odpowiedniej linii komórkowej ssaków, a następnie ilościowej spektrometrii mas przy użyciu znakowania stabilnych izotopów aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC)³. Ma to zalety w porównaniu z podejściem dwuhybrydowym drożdży, ponieważ lokalizacja komórek i modyfikacje potranslacyjne nie są zaburzone, a także zalety w porównaniu z tradycyjnym znakowaniem TAP, ponieważ jest to podejście ilościowe, a nie jakościowe, co pozwala użytkownikowi łatwo odróżnić niespecyficznie oddziałujące białka i zanieczyszczenia od czynników gospodarza, które wiążą się specyficznie. Ponadto, ponieważ próbka jest zwykle analizowana w całości, a nie jako pojedyncze prążki białkowe, interesujące białka nie są maskowane przez podobnie migrujące białka na żelu, ani zazwyczaj nie muszą być obecne na wystarczających poziomach, aby były widoczne po barwieniu, co prowadzi do zwiększonej liczby pewnie zidentyfikowanych białek ⁴.

Aby zademonstrować tę technikę, fuzje GFP blisko spokrewnionego eukariotycznego czynnika inicjacji translacji eIF4AI i eIF4AII, które mają ponad 90% identyczności aminokwasowej, zostały zbadane za pomocą ilościowej proteomiki SILAC-immunoprecypitacji. Ludzkie eIF4AI i II sklonowano do pEGFP-C1 w celu utworzenia białka fuzyjnego, w którym GFP jest połączone z N-końcem eIF4A. Aby uniknąć konieczności generowania stabilnych linii komórkowych, zastosowano transfekcję przejściową w celu dostarczenia tych konstruktów do stabilnych komórek 293T znakowanych izotopami.

Komórki były najpierw znakowane przez dwa tygodnie w pożywce do hodowli komórkowych SILAC, a następnie transfekcja plazmidowego DNA kodującego interesujące białko. Komórki poddano następnie lizie, stężenie białka znormalizowano i oczyszczono równe ilości powinowactwa do lizatu na agarozie anty-GFP. Jednakowe ilości eluatu połączono następnie i poddano analizie LC-MS/MS. Wyniki tej analizy są następnie przetwarzane w celu zidentyfikowania interakcji białko-białko o wysokim poziomie ufności (ryc. 1).

SILAC immunoprecypitacja umożliwia identyfikację nie tylko bezpośrednich interakcji, ale także niskich lub pośrednich oddziaływań z kompleksami białkowymi⁴. Korzystając z tego systemu, immunoprecypitacje eIF4AI i II umożliwiły powtarzalną i pewną identyfikację głównego partnera wiążącego eIF4G (izoformy I/II i III)⁵, a także pośrednie interakcje z eIF4E i licznymi składnikami kompleksu eIF3.

Protokół

1. Generowanie i pasaż linii komórkowych oznaczonych SILAC

Uwaga: należy unikać stosowania Trypsin-EDTA na wszystkich etapach pasażu i przygotowania próbek eksperymentalnych do analizy, ponieważ trypsyna może zawierać nieznakowane aminokwasy, co prowadziłoby do niekompletnego etykietowania próbek.

1. Aby przygotować butelkę z pożywką SILAC, dodać 0,5 ml podwielokrotności odpowiednio znakowanej SILAC argininy (84 mg/ml w PBS) i lizyny (146 mg/ml w PBS) do 500 ml wolnej od Arg/Lys DMEM (zawierającej L-glutaminę).
2. Następnie dodać 50 ml dializowanego FBS i 5 ml penicyliny/streptomycyny do butelki o pojemności 500 ml.
   Uwaga: Limfocyty HEK 293T (ATCC) powinny być utrzymywane w pożywkach DMEM pozbawionych argininy i lizyny oraz uzupełnione lekkimi (R0K0), średnimi (R6K4) lub ciężkimi (R10K8) aminokwasami, dializowaną płodową surowicą bydlęcą (odcięcie 10 kDa) oraz penicyliną/streptomycyną. Komórki muszą być utrzymywane w pożywce przez co najmniej 5 podziałów komórkowych, aby zapewnić pełne oznakowanie. W większości przypadków komórki są łatwo znakowane w ciągu ≥2 tygodni.
3. Aby podzielić komórki w celu pasażowania, komórki należy usunąć z monowarstwy, uderzając w kolbę. Alternatywą jest użycie skrobaków do komórek lub użycie bezenzymatycznego bufora dysocjacyjnego komórkowego na bazie PBS.
   Uwaga: Aby zachować pożywkę, komórki powinny być pasażowane w kolbach T25, a większa liczba komórek powinna być generowana tylko bezpośrednio przed eksperymentem.
4. Na 24 godziny przed transfekacją komórek, wysiewać 3,5 x 10⁶ komórek znakowanych SILAC do pojedynczej szalki o długości 10^cm2 dla każdego badanego warunku doświadczalnego.

2. Transfekcja znakowanych komórek za pomocą konstruktów fuzji pEGFP

1. Usuń pożywkę z komórek i zastąp ją 9 ml wolnych od antybiotyków pożywek SILAC DMEM (Lekkie, Średnie lub Ciężkie).
   Uwaga: Antybiotyki nie powinny być dodawane do pożywki, ponieważ mogą one zakłócać skuteczność odczynników do transfekcji na bazie liposomów.
2. Przygotować mieszaninę 10 μg odpowiedniego plazmidu (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) w 500 μl wolnego od antybiotyków SILAC DMEM i wymieszać ją z 500 μl wolnego od antybiotyków SILAC DMEM zawierającego 10 μl odczynnika do transfekcji (np. lipofektaminy 2000). Dokładnie wymieszać reakcję, odpipetowując ją kilka razy w górę i w dół.
3. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie dodawać kroplami do monowarstwy komórki. Delikatnie kołysz talerzem z boku na bok.
4. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C i 10% CO₂ przez 24 godziny.
   Uwaga: Jeżeli ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania powoduje jakąkolwiek widoczną toksyczność, może być konieczne zmniejszenie ilości transfekowanego plazmidu i/lub czasu trwania kolejnego okresu ekspresji.

3. Zbieranie lizatów komórkowych

1. Zbierz komórki z naczynia do lodowatego PBS za pomocą skrobaka do komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 220 x g, 4 °C przez 5 min. Umyj komórki jeszcze 3x w 10 ml lodowatego PBS.
2. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do lizy komórek (10 mM TrisCl/pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP40) zawierającym świeżo dodany koktajl inhibitorów proteazy III o stężeniu 1x i koktajl RNazy (opcjonalnie) o stężeniu 5 μl / ml
   Uwaga: W przypadku białek o znanej aktywności wiązania kwasów nukleinowych może być konieczne dodanie nukleaz do lizatu przed wytrąceniem. W przypadku dodawania nukleazy próbki należy inkubować na lodzie przez 30 minut, pipetując co 10 minut. Ekstrakcja całkowitego kwasu nukleinowego z niewielkiej frakcji próbki i analiza za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym może przetestować skuteczność nukleazy.
3. Odwirować próbki w temperaturze 13 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut, zachowując supernatant jako rozpuszczalny lizat komórkowy.
4. Stężenie lizatu komórkowego należy ocenić za pomocą testu BCA zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Za pomocą buforu do lizy zawierającego koktajl inhibitorów proteazy III należy znormalizować stężenie białka w końcowej objętości 500 μl.
6. Dostosować objętość do 1 ml z dodatkiem 500 μl buforu rozcieńczającego (10 mM TrisCl/pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) zawierającego koktajl inhibitorów proteazy III o końcowym stężeniu 1x. Podwielokrotność 50 μl próbki należy zachować jako wsad próbki, a lizat należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania kulek anty-GFP (np. pułapki GFP).
   Uwaga: Zazwyczaj wydajność waha się od 1 do 3,5 mg białka w końcowej próbce 1 ml. Podczas gdy powyższe są odpowiednie dla wielu interesujących białek, dla innych może być konieczna modyfikacja składników buforowych, aby zapewnić rozpuszczenie białka przynęty i utrzymać interakcje białko-białko. Możliwe zmiany obejmują środek buforujący (fosforan, HEPES), stężenie soli (150-500 mM), wybór detergentu lub innych dodatków.

4. Wiązanie z koralikami anty-GFP

1. Krótko zmieszaj zawiesinę koralików, aby ponownie zawiesić koraliki. Używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl z odciętym końcem, przenieś 25 μl kulek na próbkę do świeżej probówki.
   Uwaga: Użytkownik powinien przygotować kulki do pojedynczego eksperymentu SILAC jako mastermix, aby zminimalizować różnice między próbkami.
2. Na każde 25 μl zawiesiny perełkowej dodać 20 objętości (1 500 μl na 75 μl zawiesiny) buforu rozcieńczającego i odwirować kulki przy 2 700 x g przez 5 minut. Następnie przemyć kulki kolejne 2x w 20 objętościach buforu rozcieńczającego.
3. Dodać 100 μl buforu rozcieńczającego na 25 μl zawiesiny kulek. Używając końcówki o pojemności 200 μl z odciętym końcem, przenieść 85 μl tej zawiesiny do każdej z próbek znakowanych SILAC z kroku 3.6.
4. Inkubować próbki z kulkami na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.

5. Mycie, elucja i przygotowanie próbek do analizy MS

1. Próbki wirować w temperaturze 2 700 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut. 50 μl supernatantu należy zachować jako próbkę niezwiązaną, a pozostałą część supernatantu należy odrzucić.
2. Do każdej probówki należy dodać 1 ml buforu rozcieńczającego w celu ponownego zawieszenia kulek i odwirować próbkę w temperaturze 2 700 x g, 4 °C przez 5 minut. Supernatant należy wyrzucić. Należy to zrobić dwukrotnie.
3. Elutować białko z kulek przez dodanie 50 μl buforu ładującego 2x SDS i ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 10 min. Granulować kulki przez odwirowanie w temperaturze 2 700 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C
4. Zawiesinę należy przechowywać w wstępnie nasmarowanych probówkach, gdzie można ją przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebna. W celu przekazania do zakładu spektrometrii mas należy zmieszać znakowane próbki w stosunku 1:1:1 (np. 10 μl każdej) i przesłać wymieszaną próbkę.
   Uwaga: Na tym etapie próbki mogą być badane za pomocą western blot, barwienia srebrem lub innych środków w celu zbadania interakcji ze znanymi/nieznanymi partnerami wiążącymi. Przykład przedstawiono na rysunku 2 pokazującym specyficzne wiązanie znanego partnera interakcji – eIF4G przez western blot oraz pojawienie się srebrnych pasm barwiących obecnych w próbkach pulldown z białka będącego przedmiotem zainteresowania, ale nie w próbce kontrolnej.
5. Prześlij próbkę do analizy LC-MS/MS.
   Uwaga: po upewnieniu się, że znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania z powodzeniem wiąże partnerów interakcji, równe objętości każdej znakowanej próbki (lekka, średnia i ciężka) są łączone i przesyłane do analizy LC-MS/MS. Zazwyczaj przekazuje się do analizy łącznie 30 μl próbki IP. Wiązałoby się to z zmieszaniem 10 μl próbki znakowanej światłem z 10 μl próbek znakowanych średnio i 10 μl próbek znakowanych wysoko, aby uzyskać łącznie 30 μl.

6. Analiza danych I: Zrozumienie wyników i usuwanie identyfikacji o niskim poziomie ufności

Uwaga: Lista nagłówków kolumn zwróconych przez oprogramowanie Proteome Discoverer znajduje się w Tabeli 1. Różne programy (np. MSQuant, MaxQuant) zwracają różne nagłówki, jednak tylko ich podzbiór jest wymagany do analizy i są one wspólne dla różnych pakietów oprogramowania. Dane powinny zawsze zawierać numer dostępu dla każdego zidentyfikowanego białka, współczynniki porównujące stosunek każdej próbki (lekkie do średniej, lekkiej do ciężkiej, średniej do ciężkiej itp.), liczbę zidentyfikowanych unikalnych peptydów oraz jakąś formę fałszywie dodatniego wskaźnika lub wskazania ufności.

1. Przed przejrzeniem danych najpierw skopiuj nieprzetworzone dane do nowego arkusza kalkulacyjnego. Z tego arkusza kalkulacyjnego usuń wszystkie kolumny z wyjątkiem tych, które podają numer dostępu, liczbę unikalnych peptydów, proporcje porównujące próbki, zmienność proporcji i opis białka. Jeśli przeprowadzono eksperymenty z replikami, należy je połączyć w jeden plik Excel, przy czym każdy eksperyment powinien być wyświetlany na osobnej karcie.
   Uwaga: Dane o niskim poziomie ufności obejmują białka zidentyfikowane tylko przez pojedynczy unikalny peptyd oraz te, w przypadku których kwantyfikacja nie była możliwa.
2. Użyj funkcji "sortuj" programu Excels, aby uporządkować dane według liczby peptydów i usunąć wpisy dotyczące białek, w których brakuje więcej niż jednego peptydu. Następnie posortuj według proporcji i usuń białka, które nie mają proporcji SILAC (białka niekwantyfikowane).
3. Przekonwertuj współczynniki SILAC na wartości logarytmu₂ przy użyciu formuły: '=log(Stosunek SILAC,2)', gdzie identyfikator komórki jest podstawiany przez 'Współczynnik SILAC'.
   Uwaga: Ponieważ stosunek SILAC powoduje, że wszelkie dane dotyczące białek wykazujących spadek liczebności są ograniczone do wartości między 0 a 1, zwykle przekształca się stosunek SILAC na stosunek logarytmu₂ SILAC, ponieważ oznacza to, że białka zarówno zwiększone, jak i zmniejszone w próbce są reprezentowane na skali logarytmicznej, gdzie 2 lub -2 oznacza 4-krotny wzrost lub spadek liczebności, i 3 lub -3 odpowiednio 9-krotny wzrost lub spadek liczebności. Po tej transformacji dane powinny pasować do rozkładu Gaussa wyśrodkowanego wokół stosunku SILAC logarytmu₂ równego 0. Przykład tego przedstawiono na rysunku 3.
4. Utwórz nowe kolumny w pliku programu Excel i oblicz współczynniki SILAC log₂ dla wszystkich kolumn próbnych/makietowych. Aby przeliczyć stosunek próby/próbki na stosunek próby/próby, należy użyć wzoru: "=1/stosunek"

7. Analiza danych II: Wybór interakcji o wysokim poziomie ufności do dalszych badań

1. Otwórz Graphpad Prism, wybierz Nowy>Tabela danych i Wykres ... Wybierz pozycję "kolumna" z listy po lewej stronie okna, a następnie wybierz opcje Wprowadź/Importuj dane>Wprowadź wartości repliki, skumulowane w kolumny. Naciśnij "Utwórz".
2. Wybierz i skopiuj daną kolumnę logu₂ Sample/Mock SILAC ratio z arkusza kalkulacyjnego Excel do nowego pliku Prism.
3. Kliknij menu rozwijane "Wstaw" i wybierz "Nowa analiza". W sekcji Analiza kolumnowa wybierz opcję "Rozkład częstotliwości". Zachowując domyślne opcje, kliknij 'OK'.
   Uwaga: Ten krok generuje histogram ilustrujący liczbę białek zidentyfikowanych w danym stosunku. Powinno to utworzyć rozkład Gaussa.
4. W folderze "Wyniki" zostanie wygenerowana nowa sekcja "Histogram". Wybierz sekcję rozkładu częstotliwości.
5. Kliknij menu rozwijane "Wstaw" i wybierz opcję Nowa analiza>XY>Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej). Kliknij "Rozkład Gaussa" i kliknij OK.
   Uwaga: Ten krok dopasowuje krzywą do danych rozkładu częstotliwości wygenerowanych w kroku 7.3, uzyskując wartości, które można następnie wykorzystać do obliczenia progów istotności.
6. W wyświetlonym oknie wyników podana jest średnia i odchylenie standardowe. Wygeneruj próg, dodając 1,96 odchylenia standardowego do średniej.
   Uwaga: Te wartości reprezentują średnią i odchylenia standardowe rozkładu Gaussa, a nie cały zestaw danych. 1,96 odchylenia standardowego umieściłoby próg na granicy ufności 95% (p≤0,05). 2,58 SD dałoby 99%, a 3,3 SD 99,9%. Próg powinien być określany indywidualnie dla każdego eksperymentu repliki, ponieważ może się różnić.

8. Analiza danych III: Scalanie zestawów danych replik

Uwaga: Aby mieć pewność co do identyfikacji partnerów do interakcji, typowy eksperyment SILAC powinien być najlepiej przeprowadzony trzy razy, z zamienionymi próbkami średnio i ciężkimi znakowanymi na jedno z powtórzeń, aby kontrolować wpływ mediów na wyniki. Białko, które okazuje się oddziaływać w co najmniej dwóch z trzech eksperymentów, przy czym próbka "przełączonej" pożywki idealnie reprezentuje jedno z nich, jest interakcją o wysokim poziomie pewności.

1. Wróć do pliku Excel, utwórz nową kartę o nazwie "Połączone". Oznacz kolumnę A jako "Akcesja" i skopiuj do niej wszystkie numery dostępu z każdego z poszczególnych eksperymentów.
2. Wybierz zakładkę "Dane", a następnie opcję "Usuń duplikaty".
3. Utwórz kolumny dla współczynników SILAC i zmienności proporcji z każdego eksperymentu, a także dla kolumny z nazwą/opisem białka.
4. Na karcie Opis użyj formuły wyszukaj.pionowo, aby zebrać opis każdego numeru dostępu. Przeciągnij formułę w dół kolumny, aby wypełnić opis białka. Formuła wyszukaj.pionowo to: "=wyszukaj.pionowo(AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)", gdzie: AccessionNo to $aX, gdzie X jest numerem wiersza. WheretoLook to 'Nazwa karty Eksperyment'!$a$2:$Y$Z, gdzie Y i Z to prawy dolny fragment danych w arkuszu kalkulacyjnym, do którego się odwołuje. KolumnyPrzecięcie to liczba kolumn naprzeciwko numeru dostępu w kolumnie A, w której znajduje się żądana wartość.
   Uwaga: Na przykład, jeśli numer dostępu znajduje się w kolumnie A, a interesujące dane znajdują się w kolumnie E. Wartość w tym miejscu wyniesie 5 (kolumna A jest liczona jako 1). Ponieważ numery dostępu zostały zebrane w kroku b, jest bardzo prawdopodobne, że funkcja vlookup nie uzyska wszystkich wymaganych nazw z jednego eksperymentu. Tam, gdzie zwraca wartość Nie dotyczy, zmodyfikuj formułę, aby uzyskać opis z każdego eksperymentu po kolei, aż wszystkie opisy zostaną uzyskane.
5. Aby wyróżnić oddziałujące białka w połączonym zbiorze danych, wybierz każdą kolumnę proporcji osobno i kliknij kartę Narzędzia główne, a następnie Formatowanie warunkowe>Reguły podświetlania komórek>Więcej reguł.
6. Wybierz styl "Klasyczny". Formatuj tylko komórki, które zawierają wartości "Wartość komórki", "Większe lub Równe". W polu wpisz wartość odchylenia standardowego 1,96 i kliknij "OK".
7. Oceń zmienność proporcji dla każdej pozytywnej interakcji. Jeśli odjęcie % zmienności spowodowałoby spadek "trafienia" poniżej wartości progowej, należy traktować to z ostrożnością.
   Uwaga: Pokazuje to, jak spójne są indywidualne proporcje dla każdego peptydu, które razem składają się na stosunek SILAC białek, i jest podawane w procentach. Gdy weźmie się pod uwagę zmienność stosunku, a białko daje stosunek SILAC powyżej progu, białko to stanowi trafienie. Jeżeli zmienność współczynnika daje zakres, który spada poniżej progu, "trafienie" może oznaczać zanieczyszczenie.
8. Powtórz te czynności dla każdej kolumny wyników i porównaj eksperymenty. Wyróżnione białka zidentyfikowane w dwóch lub więcej eksperymentach reprezentują interakcję o wysokim poziomie ufności.
   Uwaga: W zależności od bazy danych użytej do przypisania numerów akcesyjnych białka, w różnych eksperymentach białko mogło zostać zidentyfikowane pod różnymi, a nawet wieloma numerami dostępu. Ważne jest, aby to sprawdzić, aby upewnić się, że białka nie zostaną przypadkowo pominięte.

Wyniki

W typowym eksperymencie SILAC, zdecydowana większość zidentyfikowanych białek (>90%) reprezentuje zanieczyszczenia, jak również białka wiążące się niespecyficznie z matrycą powinowactwa, co jest zilustrowane na >rysunku 2B, nawet gdy protokoły mycia usuwają większość zanieczyszczeń cytoplazmatycznych, takich jak GAPDH (Rysunek 2A). Jednak grupowanie białek niewiążących niespecyficznie w rozkładzie normalnym pozwala na rozróżnienie białek, które specyficznie wiążą się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, ponieważ mają one wyższy stosunek próbki do makiety niż tło. Chociaż teoretycznie zanieczyszczenia powinny skupiać się wokół stosunku logarytmu₂ SILAC wynoszącego 0, niekoniecznie tak jest, czego przykład przedstawiono na rysunku 3. Możliwe przyczyny takiego stanu rzeczy to niedoskonałe oznakowanie komórek SILAC, ładowanie nierównych objętości lub stężeń lizatu na kulki anty-GFP, przypadkowa utrata kulek podczas oczyszczania lub nierównomierne wymieszanie próbek pod koniec procedury oczyszczania³. Zakładając jednak, że dane są analizowane w oparciu o progowe odchylenie standardowe od średniej normalnie rozmieszczonych zanieczyszczeń, niewielkie przesunięcia w wyśrodkowaniu danych nie powinny mieć wpływu na jakość wyników.

Porównując różnice w interakcjach białkowych między dwoma powiązanymi białkami, podobna sytuacja może wystąpić, gdy jedno interesujące białko jest produkowane w komórkach do wyższych poziomów niż drugie (albo z powodu różnic w wydajności transfekcji, albo wewnętrznej właściwości białka lub mRNA). Pewne różnice w wyrażeniu (np. Rysunek 2A) można skorygować, analizując stosunek SILAC dla tych dwóch próbek. W tym przykładzie będą to próbki GFP-eIF4AI i GFP-eIF4AII. Analizując stosunek 4AI/4AII SILAC, jak omówiono w sekcji 7, możliwe jest zidentyfikowanie białek, których wiązanie różni się znacznie między izoformami.

Na rysunku 4 pokazano reprezentację białek wiążących eIF4A zidentyfikowanych w jednym z przeprowadzonych eksperymentów replikowych, ilustrujących pokrycie kompleksu czynnika inicjacji osiągniętego w tym protokole. Najwyższe współczynniki obserwowano zazwyczaj w przypadku eIF4G, który wiąże się bezpośrednio z eIF4A, z niższymi wskaźnikami w przypadku eIF4E, który wiąże się z eIF4G w miejscu oddalonym od miejsca wiązania eIF4A. Niższe współczynniki zaobserwowano dla członków kompleksu eIF3. Pokazuje to jednak wyraźnie, że w eksperymencie w zadowalający sposób zidentyfikowano zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie elementy wiążące eIF4AI i II. Jak można się spodziewać po ich wysokiej identyczności^sekwencji6, interakcje białko-białko wydawały się w dużej mierze konserwatywne między dwiema izoformami w tym systemie eksperymentalnym ^7,8. Wybrane białka oddziałujące na siebie przedstawiono w tabeli 2, ilustrując format danych.

Nagłówek kolumny	opis
Przystąpienia	Wyświetla numer dostępu dla sekwencji
Pokrycia	Proporcja sekwencji białka pokrytej zidentyfikowanymi peptydami
♯Psm	Dopasowanie spektralne peptydów
♯peptydy	Całkowita liczba unikalnych peptydów zidentyfikowanych dla białka
♯Aas	Długość białka w aminokwasach
MW (Da)	Masa cząsteczkowa białka w daltonach. Nie obejmuje modyfikacji
Obliczanie liczby PI	Teoretyczny punkt izoelektryczny białka
wynik	Całkowity wynik białka (który reprezentuje sumę wyników poszczególnych peptydów). Dokładny wynik wymagany do uzyskania istotności będzie się różnić w zależności od eksperymentu. Placówka MS zwykle stosuje 5% odcięcie wskaźnika fałszywych wykryć.
kolejność	Sekwencja aminokwasów składających się na białko
stosunek	Względna intensywność peptydów w nazwanej znakowanej próbce w porównaniu z drugą znakowaną próbką
Liczba współczynników	Liczba współczynników peptydów, które zostały użyte do obliczenia danego stosunku białka
Zmienność wskaźnika (%)	Zmienność poszczególnych proporcji peptydów użytych do obliczenia danego stosunku białka
opis	Nazwa białka

Tabela 1. Standardowe nagłówki kolumn z raportu Proteome Discoverer. Chociaż ze wszystkich tych kolumn można uzyskać przydatne informacje, te krytyczne dla tej analizy są pogrubione.

powiedział: szt. powiedział: pkt. Nasiona Czepek pkt. powiedział: TGL TGL powiedział: pkt. powiedział: pkt. TGL pkt. pkt. pkt.

Przystąpienia	peptydy	4AI/Pozora	4AII/Makieta	nazwa	Analiza SILAC
A8K7F6	21	100	1	eIF4AI (Sztuczna inteligencja)	'Przynęta' białko
Pytanie Q14240	22 Rozdział 22	0,01	90.855	eIF4AII (biblioteka eIF4AII)
Zobacz materiał G5E9S1	25	47.575	30,53	eIF4GI powiedział:	Białka oddziałujące
Q59GJ0	5	11 778	Klasa robocza 10,619	eIF4GII
Zobacz materiał P06730	3	Rozdział 7,22	7,57	eIF4E
Q5T6W5	4	0,685	0,646	hnRNPK powiedział:	Niespecyficznie wiążące zanieczyszczenia
Zobacz materiał P62805	1	0,531	0,498	Histon H4
Zobacz materiał H6VRG2	Rozdział 18	-	-	Keratyna-1	Zanieczyszczenia środowiska
Zobacz materiał P35527	11	0,01	0,01	Keratyna-1 cytoszkielet 9

Tabela 2. Typowe dane z eksperymentu immunoprecypitacyjnego SILAC.Podając przykładowe dane dla białka będącego przedmiotem zainteresowania/przynęty (wysokie peptydy, wysoki stosunek), białek oddziałujących z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (wysokie/niskie peptydy, wysoki stosunek), białek niewiążących niespecyficznie (peptydy wysokie/niskie, stosunek spada poniżej granicy – w tym eksperymencie 0,96) oraz zanieczyszczeń środowiskowych (często wysokie peptydy, ujemny stosunek/poniżej progu).

Rysunek 1. Plan eksperymentalny. Po pierwsze, komórki są hodowane w pożywkach pozbawionych argininy i lizyny i zastępowane stabilnym izotopem znakowanym argininą i lizyną przez 2 tygodnie (1). (2) Komórki umieszcza się na szalkach o wielkości 10^cm2 i przejściowo transfekuje plazmidami kodującymi białka fuzyjne GFP (Mock) lub GFP (próbki). (3) Komórki są poddawane lizie, a białka fuzyjne GFP lub GFP są immunoprecypitowane z lizatów komórkowych. (4) Próbki łączy się w stosunku 1:1 i przesyła do analizy LC-MS/MS. Dane są następnie analizowane w celu usunięcia identyfikacji białek o niskim poziomie ufności i wybrania poziomu wzbogacenia białek odpowiadającego prawdziwym białkom oddziałującym

.

Rysunek 2. Potwierdzenie odpowiednich warunków immunoprecypitacji. A) Analiza Western blot lizatów komórkowych, a także frakcji niezwiązanych i związanych z immunoprecypitacji potwierdza ekspresję i immunoprecypitację białka będącego przedmiotem zainteresowania. Western blot przeciwko GAPDH potwierdza wyczerpanie nieoddziałujących białek, a kolejny western blot, znany partner oddziałujący eIF4A, potwierdza udaną immunoprecypitację białek wiążących się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. B) Tam, gdzie nie są znani partnerzy oddziałującego białka będącego przedmiotem zainteresowania, żel zabarwiony srebrem może potwierdzić immunoprecypitację oddziałujących białek. Na tym srebrzyste opaski żelowe dla GFP i GFP-eIF4AI/II są przezroczyste, a pasmo migrujące w odpowiednim rozmiarze dla eIF4G występuje tylko na pasach związanych z GFP-4AI/II, a nie na pasie kontrolnym GFP.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki. Histogram przedstawiający rozkład proporcji białek z jednego powtórzenia (A) GFP-eIF4AI lub (B) GFP-eIF4AII pulldown. Granica odchylenia standardowego 1,96 jest oznaczona linią przerywaną. Oddziałujące białka znajdujące się poza normalnie rozmieszczonymi zanieczyszczeniami są widoczne od ~0,25 i 1 cala (A) oraz ~0,3-1,5 cala (B).

Rysunek 4. Identyfikacja elementów kompleksu eIF z pojedynczej repliki eksperymentu SILAC IP. Białka w kolorze zielonym były białkiem będącym przedmiotem zainteresowania używanym do pulldown Białka oddziałujące są cieniowane od czerwonego do białego zgodnie ze stosunkiem log₂ SILAC w SILAC IP, przy czym czerwony jest najliczniejszym białkiem w analizie, a biały jest punktem odcięcia 1,96 SD. Białka zacienione na szaro nie zostały zidentyfikowane w tej analizie.

Dyskusja

Opisana tutaj strategia SILAC stanowi bardzo czuły i skuteczny sposób wykrywania nowych interakcji białko-białko, a ponadto umożliwia szybką i prostą dyskryminację zmienionych wzorców wiązania między blisko spokrewnionymi próbkami będącymi przedmiotem zainteresowania. W tym przykładzie technika ta została wykorzystana do zbadania interakcji białko-białko białek eIF4AI i eIF4AII⁶. Zgodnie z wiedzą autora, jest to pierwsze badanie w literaturze wykorzystujące użyteczność proteomiki SILAC do badania interaktomii komórkowej tych dwóch izoform eIF4A.

W opisanym powyżej podejściu wykorzystuje się znacznik GFP i kulki anty-GFP ^9,10 i dlatego mogą być wymagane modyfikacje w celu umożliwienia zastosowania tego podejścia w odniesieniu do określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład niezależnie od tego, czy znacznik jest umieszczony na N, czy C-końcu białka. Tam, gdzie to możliwe, należy wykonać western blot lub testy funkcjonalne w celu wykrycia wiązania znanego partnera w interakcji białkowej. Jeśli białko nie toleruje fuzji ze znacznikiem GFP, inne strategie znakowania lub ściągania zostały zastosowane do ściągania SILAC przy użyciu obu innych znaczników (FLAG¹¹, Biotyna¹², STREP (dane własne, niepublikowane)) lub przy użyciu pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, w którym siRNA knockdown białka docelowego zapewnia próbkę kontrolną¹³. Takie eksperymenty zostały opisane w innym miejscu w literaturze, ale w skrócie, krok 1 i kroki 5.4-8 zostaną zastosowane jak powyżej, z krokami 2-5.3 zmodyfikowanymi odpowiednio do wybranego systemu ekspresji/pulldown przy użyciu równych danych wejściowych białka, jak opisano w krokach 2.4-2.5. Ponieważ etapy kwantyfikacji pozwalają na usunięcie niespecyficznych białek wiążących na poziomie analizy, zaleca się pominięcie wstępnej inkubacji z kulkami kontrolnymi lub płukania o wysokiej zawartości soli w celu zachowania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Nukleaza może być włączona lub pominięta w tym protokole w zależności od specyfiki danego eksperymentu. Na przykład: ponieważ białka użyte w tej metodzie są helikazami RNA, koktajl RNazy został włączony do protokołu w celu usunięcia pośrednich interakcji, w których pośredniczy RNA (krok 3.2). Jednak w niektórych przypadkach korzystne może być prowadzenie równoległych eksperymentów z nukleazą i bez nukleazy w celu identyfikacji oddziaływań zależnych od kwasów nukleinowych.

W ramach tego protokołu zaleca się zamianę "średnich" i "ciężkich" próbek w powtórzonych eksperymentach w celu kontroli zmienności wprowadzonej przez różnice w pożywce SILAC lub wzroście komórek. Alternatywna kontrola polega na sekwencyjnym przełączaniu wszystkich trzech ("lekkich", "średnich" i "ciężkich") pożywek w eksperymentach z replikami. Chociaż podejście to jest potencjalnie bardziej rygorystyczne, zwiększa złożoność analizy, ponieważ w co najmniej jednej kontrpróbie białko będące przedmiotem zainteresowania zostanie wytworzone w komórkach znakowanych "światłem", a zatem konieczne jest rozróżnienie między białkami konsekwentnie identyfikowanymi w "lekkich" próbkach (zanieczyszczenia środowiskowe, takie jak keratyny) a tymi, które są wzbogacane w "lekkich" próbkach tylko po związaniu z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Chociaż wykorzystanie danych kwantyfikacyjnych pozwala na odróżnienie interakcji specyficznych od niespecyficznych poprzez zastosowanie progu, nieuchronnie niektóre rzeczywiste interakcje mogą zostać odrzucone. Powyższe podejście jest prostym i szybkim podejściem do identyfikacji interakcji białko-białko, które może być łatwo podjęte przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia ze spektrometrią mas lub analizą dużych zestawów danych interakcji białko-białko. W przypadku większości zastosowań jest to więcej niż wystarczające do identyfikacji nowych białek będących przedmiotem zainteresowania. Dalsze modyfikacje tego podejścia mające na celu zmniejszenie utraty danych opisano w innym miejscu w literaturze i obejmują one wykorzystanie biblioteki częstości białek, w której można wykluczyć znane białka zanieczyszczające dla określonego zestawu parametrów eksperymentalnych (linia komórkowa, matryca perełkowa, warunki buforowe)^10,14. Jednakże, w zależności od konkretnych parametrów eksperymentalnych, może być konieczne przeprowadzenie kilku eksperymentów kontrolnych w celu wygenerowania proteomu kulkowego, co może zwiększyć zarówno koszty, jak i złożoność eksperymentu. Więcej informacji na temat tej techniki można znaleźć na stronie internetowej www.peptracker.co.uk¹⁴.

Należy również zauważyć, że opisany powyżej protokół polega na mieszaniu różnie oznakowanych próbek na końcu procesu immunoprecypitacji (określanego jako Mieszanie po Oczyszczeniu – eksperyment MAP SILAC). Odbywa się to, ponieważ interakcje białko-białko zachodzą w danej równowadze¹⁵. Należy zauważyć, że inne grupy połączyły to podejście MAP SILAC opisane w niniejszym protokole z inkubacją próbek przed pobraniem (Oczyszczanie po zmieszaniu – PAM SILAC) przez różny czas (w literaturze stosowano od 20 minut do 2 godzin)^15,16. Na podstawie tego, jak szybko stosunek białek spada do 1:1, możliwe jest jakościowe zbadanie powinowactwa do wiązań i zdefiniowanie białek jako stabilnych lub dynamicznych białek oddziałujących¹⁵.

Podsumowując, ściągacze SILAC stanowią bardzo skuteczny sposób identyfikacji białek oddziałujących z danym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, w fizjologicznie istotnym otoczeniu. Technikę tę można bardzo łatwo dostosować do wielu różnych strategii oczyszczania, co pozwala na jej zastosowanie do dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Kwantyfikacja wyników znacznie upraszcza identyfikację rzeczywistych oddziaływań i pozwala na złagodzenie rygorystycznych warunków buforowych stosowanych do usuwania niespecyficznych spoiw, a tym samym pozwala zachować oddziaływania o niskim powinowactwie. Ponieważ w powyższej strategii można porównać do trzech próbek, technika ta ma wyraźne zalety w porównywaniu różnic w wiązaniu białek między różnymi izoformami białek, zmutowanymi białkami lub wpływem inhibitorów farmakologicznych. Ponieważ analizowane są całe plastry żelu, a nie pojedyncze prążki, które barwią się przez Coomassie, liczba białek zidentyfikowanych z dużą pewnością jest zwykle wyższa niż te zidentyfikowane w standardowym GST/TAP-pulldown, a stronniczość eksperymentatora w wyborze interesujących białek jest usuwana. Technika ta wypada zatem bardzo korzystnie w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi technikami stosowanymi do identyfikacji nowych interakcji białkowych (drożdże 2-hybrid, GST/His lub TAP Pulldowns).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmodyfikowany Dulbecco Eagle Medium  ( DMEM)	Dundee Cell Products	LM010	DMEM pozbawiony argininy i lizyny. (i zawierające L-glutaminę)
Dializowany FBS (odcięcie 10 kDa) 500 ml	Dundee Cell Products	DS1003
Arginina (R0) 25 g	Sigma-Aldrich	A8094	Zawiesić 0,5 g w 6 ml PBS, przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w 0,5 ml podwielokrotności (daje 84 mg/ml zapasu)
Arginina (R6) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	CLM-2265	Zawiesić 0,5 g w 6 ml PBS, przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w 0,5 ml podwielokrotności (daje 84 mg/ml zapasu)
Arginina (R10) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	CNLM-539	Zawiesić 0,5 g w 6 ml PBS, przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w 0,5 ml porcji (daje 84 mg/ml bulionu)
Lizyna (K0) 25 g	Sigma-Aldrich	L8662	Ponownie zawiesić 0,5 g w 3,5 ml PBS, przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w 0,5 ml podwielokrotności (daje 146 mg/ml bulionu)
Lizyna (K4) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	DLM-2640	Zawiesić 0,5 g w 3,5 ml PBS, przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w 0,5 ml porcji (daje 146 mg/ml bulionu)
Lizyna (K8) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	CNLM-291	Zawiesić 0,5 g w 3,5 ml PBS, przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w 0,5 ml podwielokrotności (daje 146 mg/ml bulionu)
Penicylina/streptomycyna, płyn. 100 ml	Gibco	15140-122
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Pułapka GFP Agaroza (500 μ l żywica)	Chromotek	gta-20
5x SDS Bufor do ładowania próbek	Fisher Scientific PN39000		W celu zminimalizowania zanieczyszczenia keratyną zaleca się stosowanie zakupionego, a nie domowego bufora do próbek.
Zestaw koktajlowy inhibitorów proteazy III	Calbiochem	539134
1,7 ml wstępnie nasmarowane probówki	Zestaw	3207
BCA (1 l)	Pierce	23225
Tris (Trizma)	Sigma-Aldrich	T1503
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014
Koktajl Rnase	Ambion	AM2286
NP-40 alternatywa	Millipore	492016