Amoniak jest ważnym metabolitem fizjologicznym istotnym dla różnych stanów chorobowych i zdrowotnych. Jest to również cząsteczka trudna do zmierzenia w wydychanym powietrzu, co wymaga podjęcia szczególnych środków ostrożności w celu uzyskania dokładnych wyników. Nie wszystkie czynniki wpływające na amoniak są znane, ale postęp może być trudny bez uwzględnienia tych czynników.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybki i dokładny pomiar amoniaku w wydychanym powietrzu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ta metoda amoniaku z wydychanym oddechem wykorzystuje szybką i bardzo czułą metodę spektroskopową znaną jako kwarcowa spektroskopia fotoakustyczna (QEPAS), która wykorzystuje laser oparty na kaskadzie kwantowej. Monitor jest sprzężony z samplerem, który mierzy ciśnienie w ustach i dwutlenek węgla. System jest kontrolowany pod względem temperatury i specjalnie zaprojektowany, aby zająć się reaktywnością tego związku. Próbnik natychmiast przekazuje pacjentowi i technikowi informację zwrotną na temat jakości wysiłku oddechowego. Wraz z krótkim czasem reakcji monitora, system ten jest w stanie dokładnie mierzyć poziom amoniaku w wydychanym powietrzu reprezentatywny dla głębokich poziomów ogólnoustrojowych w płucach.
Ponieważ system jest łatwy w użyciu i generuje wyniki w czasie rzeczywistym, umożliwił eksperymentom zidentyfikowanie czynników, które wpływają na pomiary. Na przykład płyn do płukania jamy ustnej i pH w jamie ustnej w sposób powtarzalny i znaczący wpływają na wyniki, dlatego muszą być kontrolowane. Temperatura i sposób oddychania to inne przykłady. Wraz z ewolucją naszego zrozumienia tych czynników, zmniejsza się błąd, a badania kliniczne stają się bardziej znaczące. System ten jest bardzo niezawodny, a indywidualne pomiary są niedrogie.
Sampler jest stosunkowo tani i dość przenośny, ale monitor nie jest ani jednym, ani drugim. Ogranicza to możliwości niektórych badań klinicznych i zapewnia racjonalne warunki dla przyszłych innowacji.
Wprowadzenie
Amoniak jest wszechobecnym produktem ubocznym metabolizmu białek1. Pomiar amoniaku może zatem pomóc klinicystom w ocenie różnych stanów chorobowych i zdrowotnych2. Jednak amoniak jest trudny do dokładnego zmierzenia, za pomocą krwi lub oddechu, ponieważ jest bardzo reaktywny. Chociaż powszechnie stosowane, testy krwi mają wiele wad, w tym podstawowe obawy dotyczące dokładności3. Ale głównym problemem z testami krwi jest fakt, że zawsze były one pobierane tylko epizodycznie. Jest to ważne, ponieważ fizjologia amoniaku, podobnie jak poziom glukozy we krwi i wiele innych procesów metabolicznych, jest płynna i ciągle się zmienia4. Natomiast testy oddechowe są w pełni nieinwazyjne i szybkie, co ułatwia powtarzanie pomiarów. W związku z tym pomiar amoniaku w wydychanym powietrzu jest atrakcyjny, ponieważ może w wyjątkowy sposób zaspokoić poważną, niezaspokojoną potrzebę.
Kolekcja oddechu przedstawia jednak wyjątkowe problemy. Podczas gdy flebotomia z natury niesie ze sobą ryzyko błędu na kilka nieprzewidywalnych sposobów (np. czas opaski uciskowej, zanieczyszczenie potem, hemoliza krwinek, opóźnienie w pomiarach laboratoryjnych itp.), naukowcy zajmujący się pomiarem oddechu muszą zmagać się z inną grupą nowych wyzwań: zmiennością oddychania, zanieczyszczeniem błoną śluzową jamy ustnej lub amoniakiem bakteryjnym, wpływem otaczającego powietrza oraz wilgotności i temperatury aparatury, itd6. Rzeczywiście, nierozsądne jest niedocenianie zadania polegającego na łączeniu sprzętu eksperymentalnego z ludźmi za pomocą procedur eksperymentalnych w celu odkrycia nieznanej biologii. Częściowo z powodu tych przeszkód amoniak w wydychanym powietrzu nie osiągnął jeszcze swojego potencjału.
Tutaj prezentujemy nasz protokół pomiaru amoniaku w wydychanym powietrzu dla szybkich i dokładnych wyników. Nasz protokół ma mocne strony w trzech obszarach: monitorze, samplerze interfejsu i zwróceniu uwagi na wpływy ludzkie. Monitor został zbudowany przez kolegów z Uniwersytetu Rice, jak opisano wcześniej7. Podstawą pomiaru jest technika spektroskopii fotoakustycznej wzmocnionej kwarcem (QEPAS), która wykorzystuje piezoelektryczny kwarcowy kamerton jako przetwornik akustyczny. Efekt fotoakustyczny występuje, gdy fale akustyczne są wytwarzane w wyniku absorpcji modulowanego promieniowania laserowego przez docelowe formy gazów śladowych. Gaz śladowy jest wykrywany za pomocą ogniwa akustycznego, które jest akustycznie rezonujące z modulowaną częstotliwością. Wybrano długość fali absorpcyjnej dla amoniaku, która jest wolna od zakłóceń spektralnych powodowanych przez związki zakłócające w oddechu. Na potrzeby pomiaru wydychanego powietrza przez człowieka główne cechy monitora obejmują szeroki zakres pomiarowy (od ~50 części na miliard, ppb do co najmniej 5,000 ppb) oraz prędkość (pomiary 1 s). Szybkość monitora umożliwia rozdzielczość czasową w całym cyklu oddechowym.
Monitor jest połączony ze specjalnie zaprojektowanym samplerem oddechu. Próbnik składa się z czujnika ciśnienia i kapnografu. Wyświetla i archiwizuje w czasie rzeczywistym pomiary ciśnienia w ustach i dwutlenku węgla, a także stężenia amoniaku określone przez czujnik. Próbnik ten umożliwia zatem technikowi ocenę jakości wysiłku oddechowego podczas zbierania oddechu. Dzięki temu możemy przekroczyć zalecenia dotyczące analizy tlenku azotu (FeNO) w wydychanym powietrzu zaproponowane przez grupę zadaniową Amerykańskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej/Europejskiego Towarzystwa Chorób Układu Oddechowego (ATS/ERS)8. Do pobierania próbek wydychanego powietrza zastosowano jednorazowy jednokierunkowy zawór liniowy umieszczony w porcie ustnym próbnika wydychanego powietrza.
Ze względu na szybkość monitora i kontrolę jakości zapewnianą przez próbnik, byliśmy w stanie dokładnie ocenić wpływ człowieka9. Większość badanych, na przykład, początkowo hiperwentyluje, gdy otrzymuje się instrukcję, aby oddychać. Inne ważne czynniki, takie jak pH w jamie ustnej i płyny do płukania jamy ustnej, temperatura próbnika, monitora i wszystkich powiązanych przewodów oraz tryb oddychania, zostały następnie zbadane i stanowią podstawę poniższych eksperymentów ilustracyjnych.
Na koniec, co być może najważniejsze, należy podkreślić, że wiele bardzo doświadczonych grup mierzy amoniak w wydychanym powietrzu za pomocą zupełnie różnych czujników i procedur pomiarowych. Mogą one mieć ważne zalety i ważność. Pełne porównanie wykracza poza zakres niniejszej pracy10,11,12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie instrumentów
- Włącz zewnętrzne zasilanie platformy czujnika optycznego amoniaku, kontrolera diody laserowej, niestandardowej jednostki elektroniki sterującej (CEU), próbnika oddechu, pompy powietrza i laptopa.
- Sprawdź, czy działają zarówno wentylatory wylotowe, jak i chłodzące czujnika amoniaku. UWAGA: Jeden znajduje się z tyłu czujnika, drugi znajduje się w czujniku, który jest łatwo dostępny.
- Upewnij się, że akustyczny moduł detekcyjny i zawór iglicowy mają temperaturę 38.0 °C, sprawdzając cyfrowy wyświetlacz znajdujący się z boku skrzynki czujnika amoniaku. Odczekaj około 35 minut od momentu zasilania czujnika, aby temperatura się ustabilizowała.
- Ustaw temperaturę rurki wlotowej i ustnika na 55 °C, klikając ikonę o nazwie "ChangeT" znajdującą się na pulpicie próbnika oddechu. Temperaturę można następnie zmienić, klikając strzałkę w górę lub w dół, a następnie klikając "Aktualizuj temperaturę". Kliknij "Wyjdź", aby powrócić do pulpitu. Odczekaj co najmniej 5 minut, aby temperatura się ustabilizowała. Utrzymywanie temperatury próbnika i przewodów na poziomie 55 °C minimalizuje powierzchniową utratę amoniaku.
- Otwórz oprogramowanie na laptopie, które steruje czujnikiem amoniaku. Dostęp do programu można uzyskać w folderze o nazwie "NH3 Breath Sensor Program" na pulpicie. W tym folderze użytkownik musi wybrać ikonę "main labview software". Ten folder zawiera kilka aplikacji, ale użytkownik musi wybrać "Mainsequence.vi", aby uzyskać dostęp do żądanego interfejsu. Wybierz "uruchom" w lewym górnym rogu ekranu. UWAGA: Rozpoczyna to sekwencję kalibracji blokowania linii. Laser monitora QEPAS działa na optymalnym prądzie, który jest wybierany podczas automatycznej procedury blokowania linii. Ten proces zajmie około 25 minut.
- Utwórz nową sesję w próbniku, tak aby każda sesja tematyczna miała swój własny plik, który jest zapisywany na dołączonym dysku flash. UWAGA: Odbywa się to poprzez otwarcie programu "Breath Sampler" znajdującego się na pulpicie samplera. Jest miejsce na odpowiednią identyfikację sesji. Wszystkie dane wygenerowane podczas sesji zostaną zapisane na pendrivie pod tym identyfikatorem. Data eksperymentu jest zwykle używana jako część nazwy pliku. Temperatura na wlocie i ustniku musi być wyregulowana przed przystąpieniem do programu pobierania próbek wydychanego powietrza.
- Włóż nowy jednorazowy ustnik do rury wlotowej. Nosić jednorazowe rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia ustnika amoniakiem z palców.
2. Pobieranie próbek oddechu
UWAGA: Odpowiednia Instytucjonalna Komisja Rewizyjna (Rada ds. Etyki) musi zatwierdzić każde badanie, które obejmuje ludzi. Istnieje wiele czynników, które mogą drastycznie wpływać na amoniak w wydychanym powietrzu. Czynniki te mogą wpływać na pomiary amoniaku w wydychanym powietrzu, wpływając bezpośrednio na ogólnoustrojowe poziomy amoniaku lub wpływając na podróż metabolitów wydychanych z płuc do oprzyrządowania.
- Upewnij się, że badani przybyli do laboratorium na czczo, nie spożywając żadnego jedzenia przez około 12 godzin po przybyciu i że powstrzymali się od ćwiczeń rano przed badaniem.
- Upewnij się, że żadna substancja nie została wprowadzona do jamy ustnej przez co najmniej 1 godzinę przed zebraniem danych. Upewnij się, że badani myją zęby dłużej niż 1 godzinę przed badaniem.
- Posadź obiekt przed czujnikiem amoniaku. Poinstruuj testera, aby trzymał rurę wlotową i upewnij się, że nie dotyka ustnika, aby uniknąć zanieczyszczenia amoniakiem.
- Kliknij "Start" w interfejsie samplera. Niech badany wydycha powietrze do ustnika tak długo, jak to możliwe, lub do momentu, gdy operator uzna, że próbka jest wystarczająca. UWAGA: Jest to pojedynczy pełny wydech trwający co najmniej 10 sekund. Ciśnienie w ustach jest mierzone w czasie rzeczywistym jako substytut natężenia przepływu. Manometr oznaczony kolorami pomaga badanemu wytworzyć i utrzymać pożądane ciśnienie wydechu wynoszące 10 cm wody, co odpowiada natężeniu przepływu wydechu wynoszącemu 50 ml/sek. To natężenie przepływu zostało wybrane, ponieważ zostało przyjęte przez ATS/ERS do protokołu oznaczaniaFe NO. Takie natężenie przepływu wydechu jest osiągalne przez dzieci i dorosłych. Podobnie należy uzyskać trzy powtarzalne wydechy, które różnią się o mniej niż 10%.
- Kliknij "Stop" w interfejsie próbnika, gdy próbka oddechu zostanie zakończona.
3. Pomiar próbki oddechu
- Po przeanalizowaniu próbki wydychanego powietrza technik laboratoryjny obsługujący monitor ma możliwość przeanalizowania dowolnego segmentu tego profilu oddechu. Część oddechu, która jest przedmiotem zainteresowania, to segment fazy III. Charakteryzuje się to "plateau" stężenia dwutlenku węgla i znajduje się w środkowej lub późnej fazie oddechu.
- Wybierz III fazę próbki próbki, przeciągając pionowe linie na interfejsie próbnika, aby rozpocząć, gdy dwutlenek węgla ustabilizuje się i zatrzymać tuż przed spadkiem ciśnienia w wydychanym powietrzu. Patrz rysunek 1 w celu wyjaśnienia.
- Zapisz dane na dysku flash, klikając "Zapisz" w interfejsie ekranu dotykowego próbnika.
- Po zapisaniu danych dotyczących wydychanego powietrza użytkownik może wybrać opcję "start", aby zainicjować nową próbkę wydychanego powietrza.
4. Ilustrowanie wpływu płynu do płukania jamy ustnej i pH na amoniak w wydychanym powietrzu
- Pobrać próbkę 3 oddechów, aby ustalić wyjściowy poziom amoniaku. Upewnij się, że oddechy są wykonywane w odstępie co najmniej 5 minut.
- Dokładnie płukać usta 30 ml porcji wody przez 60 sekund.
- Pobrać próbkę oddechu w ciągu 60 sekund od płukania (sekcja 2). Pobieraj próbki wydychanego powietrza w ciągu następnej godziny, aby obserwować zmiany w amoniaku w czasie. UWAGA: Próbki można pobierać nawet co minutę, ale zwykle stosuje się dłuższe odstępy czasu.
- Dokładnie płukać usta 30 ml podwielokrotności roztworu zasadowego (wodorowęglan sodu w wodzie) przez 60 sekund i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.2.1.
- Dokładnie płukać usta 30 ml podwielokrotności kwaśnego roztworu przez 60 sekund i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.2.1.
5. Ilustrowanie wpływu temperatury przewodów dolotowych i transportowych na amoniak w wydychanym powietrzu
- Pobrać próbkę trzech oddechów w ciągu 15 minut przy temperaturze wlotu ustawionej poniżej temperatury ciała, około 30 °C.
- Zwiększ temperaturę przewodów dolotowych i transportowych odpowiednio do 55 °C za pomocą ikony na pulpicie na interfejsie ekranu dotykowego próbnika oddechu. Pozwól systemowi na co najmniej 5 minut, aby osiągnął stan ustalony.
- Pobrać próbkę 3 oddechów w odstępie 5 minut do podgrzewanego wlotu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Należy spodziewać się, że u badanych wystąpi szeroki zakres bazowych poziomów amoniaku w wydychanym powietrzu. U zdrowych osób pomiar amoniaku w powietrzu wydychanym na początku dnia może wynosić 100-1,000 ppb. Płukanie jamy ustnej jakimkolwiek płynem natychmiast zmienia ilość wykrywalnego amoniaku w oddechu. Płyny obojętne i kwasowe zazwyczaj redukują ilość obserwowanego amoniaku o ponad połowę. Po ustąpieniu efektu płukania poziomy te powracają do wartości bazowych. Działanie wody wydaje się znikać w ciągu 15 min, podc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Korzyści płynące z nieinwazyjnej procedury zdolnej do wykrywania śladowych metabolitów w czasie rzeczywistym są oczywiste. Jednakże dziedzina badań nad oddechem miała trudności z pełnym wykorzystaniem tego potencjału. Pomiar oddechu jest procesem dynamicznym, podatnym na wiele czynników zakłócających. Nasze podejście posiada istotne zalety: w szczególności czułość i szybkość monitora amoniaku opartego na metodzie Rice QEPAS, połączonego z próbnikiem oddechu, pozwoliły nam ocenić i zidentyfikować czynniki związane z pobie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Dr Risby jest konsultantem w firmie Loccioni Humancare, która jest producentem próbnika oddechu.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z grantu Narodowej Fundacji Nauki (NSF) EEC-0540832 zatytułowanego "Technologie średniej podczerwieni dla zdrowia i środowiska (MIRTHE)"
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System monitorowania amoniaku ryżowego | Nie | Niedostępne do zakupu komercyjnego | |
| Próbnik oddechu Loccioni | Humancare | N/A | Wersja z pojedynczym oddechem |
| Jednorazowy ustnik | WestPrime Healthcare | G011-200 | Producentem jest AlcoQuant |
| Laptop | Lenovo | N/A | Stary model nie jest już sprzedawany przez producenta |
| Kwas Płukanie | Nie | Nie dotyczy Domowy kwaśny napój (kawa, napój bezalkoholowy, soki cytrusowe itp.) | |
| Płukanie bazy | Nie | Nie dotyczy Woda zmieszana z niedokładną ilością wodorowęglanu sodu (Arm & Soda oczyszczona młotkowa) | |
| Neutralne płukanie | Nie dotyczy | nie dotyczy wody |
Bibliografia
- Adeva, M. M., Souto, G., Blanco, N., Donapetry, C. Ammonium metabolism in humans. Metabolism: clinical and experimental. 61 (11), 1495-1511 (2012).
- Auron, A., Brophy, P. D. Hyperammonemia in review: pathophysiology, diagnosis, and treatment. Pediatric nephrology. 27 (2), 207-222 (2012).
- Blanco Vela, C. I., Bosques Padilla, F. J. Determination of ammonia concentrations in cirrhosis patients-still confusing after all these years. Annals of hepatology. 10 Suppl 2, (2011).
- Mpabanzi, L., Ol de Damink, S. W. M., van de Poll, M. C. G., Soeters, P. B., Jalan, R., Dejong, C. H. C. To pee or not to pee: ammonia hypothesis of hepatic encephalopathy revisited. European journal of gastroenterology & hepatology. 23 (6), 449-454 (2011).
- Goggs, R., Serrano, S., Szladovits, B., Keir, I., Ong, R., Hughes, D. Clinical investigation of a point-of-care blood ammonia analyzer. Veterinary clinical pathology / American Society for Veterinary Clinical Pathology. 37 (2), 198-206 (2008).
- Huizenga, J. R., Tangerman, A., Gips, C. H. Determination of ammonia in biological fluids. Annals of clinical biochemistry. 31 (Pt 6), 529-543 (1994).
- Lewicki, R., et al. Real time ammonia detection in exhaled human breath with a quantum cascade laser based sensor. 2009 Conference on Lasers and ElectroOptics and 2009 Conference on Quantum electronics and Laser Science Conference. 1, (2009).
- American Thoracic Society. European Respiratory Society. Recommendations for Standardized Procedures for the Online and Offline Measurement of Exhaled Lower Respiratory Nitric Oxide and Nasal Nitric Oxide. American journal of respiratory and critical care medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
- Solga, S. F., et al. Factors influencing breath ammonia determination. Journal of breath research. 7 (3), (2013).
- Schmidt, F. M., et al. Ammonia in breath and emitted from skin. Journal of breath research. 7 (1), (2013).
- Spaněl, P., Dryahina, K., Smith, D. A quantitative study of the influence of inhaled compounds on their concentrations in exhaled breath. Journal of breath research. 7 (1), (2013).
- Boots, A. W., van Berkel, J. J. B. N., Dallinga, J. W., Smolinska, A., Wouters, E. F., van Schooten, F. J. The versatile use of exhaled volatile organic compounds in human health and disease. Journal of breath research. 6 (2), (2012).
- Hibbard, T., Killard, A. J. Breath ammonia levels in a normal human population study as determined by photoacoustic laser spectroscopy. Journal of breath research. 5 (3), (2011).
- Wang, T., Pysanenko, A., Dryahina, K., Spaněl, P., Smith, D. Analysis of breath, exhaled via the mouth and nose, and the air in the oral cavity. Journal of breath research. 2 (3), (2008).
- Amann, A., Smith, D. Volatile Biomarkers. 1st Edition. , (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
