Artykuł metodologiczny

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

DOI:

10.3791/51667

⸱

28 czerwca 2014

 , 
1School of Physics, Georgia Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaginanie dwuniciowego DNA (dsDNA) jest związane z wieloma ważnymi procesami biologicznymi, takimi jak rozpoznawanie DNA-białka i pakowanie DNA do nukleosomów. Termodynamika zginania dsDNA została zbadana metodą zwaną cyklizacją, która opiera się na ligazie DNA w celu kowalencyjnego łączenia krótkich, lepkich końców dsDNA. Jednak na wydajność ligacji może mieć wpływ wiele czynników, które nie są związane z pętlą dsDNA, takich jak struktura DNA otaczająca połączone lepkie końce, a ligaza może również wpływać na pozorną szybkość pętli poprzez mechanizmy, takie jak niespecyficzne wiązanie. Tutaj pokazujemy, jak zmierzyć kinetykę pętli dsDNA bez ligazy, wykrywając przejściowe tworzenie pętli DNA za pomocą FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Cząsteczki dsDNA są konstruowane przy użyciu prostego protokołu opartego na PCR z parą FRET i łącznikiem biotyny. Gęstość prawdopodobieństwa pętli, znana jako współczynnik J, jest uzyskiwana z szybkości zapętlania i szybkości wyżarzania między dwoma rozłączonymi lepkimi końcami. Testując dwa dsDNA o różnych wewnętrznych krzywiznach, pokazujemy, że czynnik J jest wrażliwy na wewnętrzny kształt dsDNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie właściwości mechanicznych dsDNA ma fundamentalne znaczenie w naukach podstawowych i zastosowaniach inżynieryjnych. Struktura dsDNA jest bardziej skomplikowana niż prosta spiralna drabina, ponieważ kąty przetaczania, pochylania i skręcania między kolejnymi parami zasad mogą się różnić w zależności od sekwencji. Fluktuacje termiczne mogą powodować, że dsDNA ulega różnym trybom fluktuacji konformacyjnych, takich jak zginanie, skręcanie i rozciąganie. Przejścia, takie jak topnienie i załamanie, mogą również wystąpić w ekstremalnych warunkach.

Wśród tych ruchów, zginanie dsDNA ma najbardziej zauważalny wpływ biologiczny1. Wyginanie dsDNA jest związane z represją lub aktywacją genów poprzez zbliżenie do siebie dwóch odległych miejsc. Odgrywa również ważną rolę w pakowaniu DNA wewnątrz jądra komórkowego lub kapsydu wirusa. Deformacja zginania dsDNA może być wizualizowana eksperymentalnie za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości (AFM2 i TEM3), a termodynamikę i kinetykę można badać za pomocą testów pętlowych, które chemicznie łączą zestawione miejsca dsDNA.

Jednym z takich testów jest cyklizacja zależna od ligazy4. W tym teście cząsteczki dsDNA z "lepkimi" (spoistymi) końcami są cyrkularyzowane lub dimeryzowane przez ligazę DNA. Porównując tempo powstawania okręgów i dimerów, można uzyskać efektywne stężenie molowe jednego końca DNA w pobliżu drugiego końca, które jest znane jako czynnik J. Ten czynnik J jest wymiarowo równoważny gęstości prawdopodobieństwa znalezienia jednego końca DNA w niewielkiej odległości od drugiego końca, a zatem odzwierciedla elastyczność DNA. Pomiar czynnika J w funkcji długości DNA ujawnia wiele cech mechaniki DNA, w tym długość trwałości4,5.

Model łańcucha podobnego do robaka (WLC) jest powszechnie uważany za kanoniczny model polimerowy dla mechaniki dsDNA, na podstawie jego sukcesu w wyjaśnianiu krzywych siły-wydłużenia uzyskanych w eksperymentach z ciągnięciem DNA6 i poprawnego przewidywania czynników J dla dsDNA dłuższych niż 200 pz7. Jednak korzystając z testu cyklizacji na cząsteczkach dsDNA o wielkości zaledwie 100 pz, Cloutier i Widom zmierzyli, że czynniki J są o kilka rzędów wielkości wyższe niż przewidywania modelu WLC8. Rok później Du i wsp. wyprodukowano czynniki J zgodne z modelem WLC przy użyciu testu cyklizacji z niższymi stężeniami ligazy i przypisano anomalny wynik z grupy Widoma zastosowanym wysokim stężeniom ligazy9. Ta kontrowersja ilustruje nieunikniony wpływ ligazy DNA na kinetykę cyklizacji przy użyciu konwencjonalnego testu9. Co więcej, ligaza DNA może również wpływać na strukturę i sztywność DNA poprzez niespecyficzne wiązanie10,11.

Aby wyeliminować problemy techniczne związane z testami pętli zależnych od białek, niedawno zademonstrowaliśmy test pętli bez białka oparty na transferze energii rezonansu fluorescencji (FRET)12. W tej metodzie zapętlone konformacje są wykrywane przez FRET między donorem a akceptorem przyczepionym w pobliżu lepkich końców cząsteczki DNA. Obiektywny mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) służy do rejestrowania trajektorii odwracalnych zdarzeń pętli i odpętlania z unieruchomionych powierzchniowo pojedynczych cząsteczek DNA przez dłuższy czas. Metoda ta polega na składaniu cząsteczek DNA w oparciu o PCR w celu wygenerowania cząsteczek DNA wolnych od niezgodności, co jest kluczowym ulepszeniem w porównaniu z podobną metodą Vafabakhsh i Ha13. Aspekt pojedynczej cząsteczki tego protokołu umożliwia pomiar rozkładów oprócz średnich zespołowych, podczas gdy aspekt FRET pozwala na wielokrotny pomiar dynamiki pętli DNA z tej samej cząsteczki, nawet w warunkach, które mogą upośledzać aktywność ligazy.

Ustawienia TIRFM są pokazane na rysunku 1. Specjalnie zaprojektowany stolik na próbki jest umieszczony nad korpusem mikroskopu Olympus IX61. Lasery o długości fali 532 nm i 640 nm są wprowadzane z boku i są odbijane przez maleńkie eliptyczne zwierciadła14 do wysokiego obiektywu NA, aby osiągnąć krytyczny kąt padania na granicy faz szkiełko nakrywkowe. Zwracamy uwagę, że w tym zastosowaniu FRET można również zastosować bardziej rozpowszechniony TIR przez obiektyw przy użyciu zwierciadeł dichroicznych lub konfiguracji TIR opartych na pryzmacie. Obraz fluorescencyjny utworzony przez mikroskop jest dzielony na obrazy donorowe i akceptorowe przez lustro dichroiczne. Następnie są one ponownie obrazowane na dwóch połówkach EMCCD. Dodatkowe długoprzepustowe filtry emisyjne służą do redukcji sygnału tła.

Kontrola temperatury jest niezbędna do pozyskiwania powtarzalnych danych kinetycznych. W celu kontroli temperatury obiektyw jest oddzielony od końcówki korpusu mikroskopu, aby zminimalizować przenoszenie ciepła, a woda z agregatu chłodniczego / grzałki o kontrolowanej temperaturze krąży przez mosiężny kołnierz, który ściśle przylega do wewnętrznego metalu pod osłoną obiektywu. Taki układ jest w stanie zapewnić solidną kontrolę temperatury na powierzchni szkiełka nakrywkowego w zakresie od 15 do 50 °C (ilustracja 2). W tej pracy temperaturę próbki utrzymywano na poziomie 24 °C.

Poniższy protokół przedstawia krok po kroku procedurę budowy DNA, szacowania kształtu DNA, eksperymentu z pojedynczą cząsteczką i wyznaczania czynnika J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki dsDNA

  1. Projektuj globalnie zakrzywione DNA, powtarzając sekwencję 10-merową. Na przykład 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCCX)7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3' jest zakrzywionym DNA o długości 186 pz, gdzie X jest losową dodatkową zasadą, a sekwencja flankująca powtarzającą się sekwencję 10-merową to sekwencje adapterowe.
    UWAGA: W tym przykładzie dwa 10-mery o przeciwnych preferencjach do tworzenia nukleosomów na podstawie wielkoskalowego badania zajętości nukleosomów przeprowadzonego przez Kaplana i wsp.Wybrano 15 osób. Ponieważ powtórzenie spiralne dsDNA jest bliskie 10 pz, każde odchylenie netto osi spiralnej 10-mera będzie się kumulować, tworząc kształt przypominający łuk kołowy (ryc. 3A). Ponieważ okres spiralny jest bliższy 10,5 pz, po każdych dwóch powtórzeniach wstawiana jest dodatkowa podstawa, aby zakrzywiona struktura była jak najbardziej płaska. Te sekwencje krótsze niż 200 pz można zamówić w firmach oferujących usługę syntezy genów. Wygodnie jest oskrzydlić te sekwencje wspólnymi sekwencjami adaptera dla kolejnych kroków. Procedura jest schematyzowana na rysunku 3B.
  2. Przeprowadzić PCR ze starterem 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) i starterem 2 (/5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). UWAGA: Podkład 2 jest oznaczony donorem FRET Cy3 na końcu 5'. Typowy przepis PCR i protokół cykliczny przedstawiono w tabelach 1 i 2.
  3. Wykonaj PCR z Primerem 3 (/5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) i Primerem 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). UWAGA: Podkład 3 jest oznaczony akceptorem FRET Cy5 przez szkielet i łącznik biotyny na końcu 5'. Przepis PCR i protokół rowerowy są jak powyżej.
  4. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.
  5. Wymieszać produkt znakowany Cy3 i produkt znakowany Cy5 w buforze do wymiany nici (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) w końcowych stężeniach odpowiednio 0,4 μM i 0,1 μM. UWAGA: Nadmiar Cy3-DNA zwiększa stężenie dupleksu przenoszącego zarówno Cy3, jak i Cy5 w wyniku wymiany nici.
  6. Wymieniać pasma przez inkubację w temperaturze 98,5 °C przez 2 minuty, stopniowe schładzanie do 5 °C z szybkością narastania 0,1 °C/s i inkubację w temperaturze 5 °C przez 2 godziny.

2. Elektroforeza żelowa do wykrywania krzywizny dsDNA

  1. Wlać żel poliakryloamidowy16,17, mieszając roztwory akrylamidu i bis-akrylamidu w stosunku 29,2:0,8, 5% (w/v) w 1X bufor Tris/Boran/EDTA (TBE) o pH 8,0. Uwaga: 10 ml roztworu żelu zawiera: 1,217 ml 40% akrylamidu, 0,667 ml 2% bis-akrylamidu, 1 ml TBE 10X, 100 L nadsiarczanu amonu (APS) 10%, 10 L TEMED, a reszta todH2O. Pełne zestalenie żelu trwa około 30 min.
  2. Załaduj żel poliakryloamidowy próbkami DNA i drabinką DNA do buforu 1X ładującego (5% glicerolu, 0,03% (w/v) błękitu bromofenolowego) i uruchom żel przy 5-8 V/cm w 4 °C przez 45 minut lub do momentu, gdy czoło barwnika zbliży się do końca żelu.
  3. Wybarwić żel za pomocą 1X buforu TBE, który zawiera 0,5 g/ml bromku etydyny przez 30 minut. Zidentyfikuj prążki DNA pod wpływem światła UV. Porównaj pozycje prążków ze znacznikiem wielkości (drabinka DNA 100 pz), aby obliczyć pozorne rozmiary cząsteczek DNA. UWAGA: Zakrzywione DNA na ogół poruszają się wolniej niż proste DNA.

3. Przygotowanie komory przepływowej

  1. Wywierć 6-7 par otworów wzdłuż dwóch przeciwległych krawędzi szkiełka (3'' x 1'') za pomocą wiertarki i wierteł diamentowych. Po wierceniu przetrzyj szkiełko w płynącej wodzie, aby usunąć widoczny proszek szklany. UWAGA: Otwory służą jako wloty i wyloty perfuzji. Podczas wiercenia ważne jest chłodzenie szkiełka wodą, aby zapobiec pękaniu.
  2. Umieść szkiełka pionowo w szklanym słoiku i napełnij go wodą. Sonikuj przez 15 minut i przenieś je do innego szklanego słoika przeznaczonego do czyszczenia acetonem. Napełnij go acetonem i sonikuj przez 15 minut. Przepłukać szkiełka alkoholem etylowym za pomocą butelki z rozpylaczem, a następnie wodą. Umieść je w słoiku z polipropylenu, napełnij go 5 M wodorotlenkiem potasu i sonikuj przez 15 minut. Na koniec poddaj szkiełka działaniu sonikacji w wodzie przez 15 minut. Szkiełka nakrywkowe (nr 1, 24 x 40 mm) należy oczyścić zgodnie z tym samym protokołem. UWAGA: Oczyszczone szkiełka podstawowe i nakrywkowe można przechowywać w dH2O do długotrwałego użytkowania.
  3. Zmieszać 1 mg biotyny-PEG-silanu (MW 3400) z 80 mg mPEG-silanu (MW 2000) w 340 l 0,1 M roztworu wodorowęglanu sodu. Dobrze wymieszaj i krótko odwiruj mieszaninę, aby pozbyć się pęcherzyków. UWAGA: Funkcjonalizacja powierzchni za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie DNA z powierzchnią.
  4. Umieść 80 l roztworu PEG na każdym szkiełku podstawowym i delikatnie opuść na nie szkiełko nakrywkowe. Odczekaj 45 min. Oddzielić szkiełko nakrywkowe od szkiełka pęsetą, spłukać je dużą ilościądH2Oi pozostawić do wyschnięcia na świeżym powietrzu.
  5. Umieść cienkie paski podwójnej taśmy klejącej w poprzek szkiełka, aby utworzyć kanały. Ułóż na nim szkiełko nakrywkowe i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka, aby utworzyć płynoszczelne kanały. Użyj 5-minutowej żywicy epoksydowej, aby uszczelnić krawędzie kanałów.

4. Przygotowanie roztworu Trolox

  1. Umieścić ~30 mg Trolox i 10 ml dH2O w kolbie i za pomocą mieszadła magnetycznego mieszać roztwór na wolnym powietrzu przez 18 godzin.
  2. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i dostosować pH do 7, dodając ~6 μl 1 M zasady Tris (pH 11). Uwaga: Trolox jest odczynnikiem zapobiegającym mruganiu, który jest powszechnie stosowany w badaniach nad pojedynczymi cząsteczkami18. Działanie przeciwblaknące leku Trolox wynika z jego utlenionej pochodnej, która jest obecna w częściowo zdegradowanym roztworze leku Trolox19. Należy unikać szybkiego rozpuszczania leku Trolox w metanolu lub roztworze Tris o wysokim pH ze względu na nieefektywne utlenianie.

5. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek

  1. Wstrzyknąć 15 μl roztworu NeutrAwidyny (0,5 mg/ml) do kanału i odczekać 2 minuty przed przepłukaniem 100 μl buforu T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0).
  2. Wstrzyknąć 50 μl próbki DNA (50-100 pM) do kanału. Odczekaj 5 minut i spłucz niezwiązane DNA 100 l buforu T50. UWAGA: Cząsteczki DNA będą specyficznie wiązać się z powierzchnią poprzez interakcję NeutrAvidin-biotyna.
  3. Napełnij kanał buforem obrazowania, który zawiera system oczyszczania tlenu20 (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox i 500 mM NaCl).
  4. Ustaw EMCCD w trybie przesyłania klatek, aby przesyłać strumieniowo 2 x 2 obrazy z kosza (256 x 256) do komputera z prędkością 25 klatek na sekundę.
  5. Nałóż olejek immersyjny na obiektyw mikroskopu i zamocuj komórkę przepływową na stoliku mikroskopu za pomocą klipsów do próbek. Zgrubnie dostosuj ostrość, patrząc na wzór odbicia lasera na ścianie. Precyzyjnie wyreguluj ostrość, korzystając z podglądu na żywo obrazów fluorescencyjnych na monitorze.
  6. Rozpocznij akwizycję danych przy włączonym laserze 532 nm. Sprawdź podgląd na żywo i w razie potrzeby wyreguluj ostrość. Zatrzymaj zbieranie danych, gdy większość cząsteczek uległa fotowybielaniu.
    UWAGA: W tym obiekcie używany jest napisany w laboratorium program C do sterowania mikroskopem i wyświetlania obrazów na żywo na monitorze podczas ich zapisywania na dysku twardym.

6. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

UWAGA: Seria czasowa obrazów o wymiarach 256 x 256 jest przetwarzana przez kod MATLAB w celu wygenerowania śladów czasowych pojedynczej cząsteczki o intensywności Cy3 i Cy5. Aby sparować piksele między kanałem donorowym a kanałem akceptorowym obrazu w widoku podzielonym, ręcznie wybiera się 6-7 par plamek Cy3 i Cy5, z których każda pochodzi z tej samej cząsteczki równomiernie rozproszonej w polu widzenia, a transformacja afiniczna jest obliczana przy użyciu współrzędnych tych punktów jako punktów kontrolnych.

  1. Korzystając ze skryptu MATLAB, przejrzyj wszystkie ślady czasowe pojedynczej cząsteczki, które pokazują wiele przejść między niskimi i wysokimi sygnałami FRET. Zidentyfikuj stany zapętlone i niezapętlone.
    UWAGA: Sygnał FRET definiuje się jako intensywność Cy5 (Ia) podzieloną przez sumę intensywności Cy3 i Cy5 ( Ia + Id ). Stan zapętlony ma wysoką wartość FRET, podczas gdy stan niezapętlony ma niską wartość FRET. Histogram sygnałów FRET z pojedynczej cząsteczki jest rozłożony bimodalnie ze względu na odwracalne pętlowanie i rozpętlanie.
  2. Znajdź próg oddzielający te dwa rozkłady, określając przecięcie między dwiema dopasowanymi krzywymi Gaussa.
  3. Oblicz wydajność FRET jako figure-protocol-1 i przypisz stany zapętlone z wysokimi wartościami FRET i stany niezapętlone z niskimi wartościami FRET.
  4. Korzystając ze skryptu MATLAB, przeanalizuj skumulowaną liczbę cząsteczek ( N(t)) ), które zapętliły się (lub osiągnęły wysoki stan FRET) w różnych odstępach czasu od rozpoczęcia pozyskiwania danych. UWAGA: Ponieważ cząsteczka dsDNA może rozpocząć się w dowolnej konformacji stanu niezapętlonego na początku pozyskiwania danych, szybkość wzrostu w zapętlonej populacji odzwierciedla średnią szybkość pętli uśrednioną dla początkowych konformacji. Wyodrębnij pętlę k szybkości pętli, dopasowując N(t) do funkcji wykładniczej: figure-protocol-2 Jeśli rośnie dwufazowo, można go wyposażyć w podwójną funkcję wykładniczą: figure-protocol-3 W tym przypadku pętlę k uzyskuje się z: figure-protocol-4 UWAGA: Teoretycznie prawdopodobieństwo przeżycia, że polimer nie zapętlił się w czasie t, nie jest pojedynczą lub podwójną funkcją wykładniczą12. Dopasowanie wykładnicze jest używane jako praktyczny sposób na wyodrębnienie średniego czasu zapętlenia.

7. Wyznaczanie współczynnika J

UWAGA: Czynnik J pokazuje, jak skoncentrowany jest jeden koniec dsDNA wokół drugiego. Można to określić poprzez interpolację stężenia jednego końcowego segmentu DNA, który spowodowałby taką samą szybkość reakcji z drugim segmentem końcowym, jak zmierzona szybkość pętli. Eksperymentalnie jeden segment końcowy jest unieruchomiony na powierzchni, a drugi segment końcowy jest wprowadzany w określonym stężeniu c. Jeśli zmierzona szybkość wyżarzania między dwoma końcami wynosi wyżarzanie k, to współczynnik J21 jest określony przez figure-protocol-5. Stała szybkości wyżarzania ( kwyżarzanie = kwyżarzanie / C ) jest niezależna od stężenia sondy.

  1. Przelać 20 μl oligo biotyny-Cy5 o stężeniu 30-50 pM (Primer 3) do kanału pokrytego NeutrAwidyną. Przepłukać kanał 100 μl T50, aby zmyć niezwiązane oligonukleotydy.
  2. Przygotować bufor do obrazowania zgodnie z opisem w części 5 z dodatkiem oligo Cy3 (starter 2) o końcowym stężeniu 50 nM. Przelej ten bufor obrazowania do kanału.
  3. Trzymając włączony laser 532 nm, na krótko włącz laser 640 nm, aby zidentyfikować lokalizacje oligonukleotydów Cy5 związanych z powierzchnią. Wyłącz laser 640 nm i rozpocznij monitorowanie sygnału FRET.
    UWAGA: Po hybrydyzacji oligo Cy3 z oligotypukleoligukryptą Cy5 związaną powierzchniowo, fluorescencja Cy5 powstanie z FRET.
  4. Korzystając ze skryptu MATLAB, przeanalizuj liczbę cząsteczek, które zaczynają się w stanie niezwiązanym (niska intensywność Cy5), ale później przechodzą w stan wyżarzony (wysoka intensywność Cy5) w funkcji czasu od śladów intensywności Cy5.
  5. Wykreśl tę liczbę wyżarzonych cząsteczek w funkcji czasu. Dopasuj tę krzywą do pojedynczej funkcji wykładniczej (figure-protocol-6), aby uzyskać szybkość wyżarzania ( k wyżarzania ).
  6. Powtórz ten eksperyment przy różnych stężeniach oligonugolakotymetrycznych Cy3 (60, 100 i 180 nM), aby potwierdzić liniowość między szybkością wyżarzania a stężeniem reagenta. Wyodrębnić stałą szybkości wyżarzania drugiego rzędu ( kwyżarzania ) ze zbocza.
  7. Oblicz współczynnik J z figure-protocol-7, gdzie k pętla to szybkość zapętlania mierzona w tym samym stanie bufora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cząsteczki DNA użyte do badania pętli składają się z dupleksowego obszaru o zmiennej sekwencji i długości oraz jednoniciowych zwisów, które są względem siebie komplementarne. Zwisy, które mają długość 7 podstaw, mogą wyżarzać się względem siebie, aby uchwycić stan pętli. Każdy zwis zawiera Cy3 lub Cy5, który jest połączony w szkielecie DNA poprzez chemię amidytów. Zwis Cy5 jest również połączony z biotyną-TEG (15-atomowy dystans glikolu tetraetylenowego) w celu unieruchomienia powierzchni (patrz rysunek 4A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prosty test jednocząsteczkowy oparty na FRET wykorzystano do zbadania kinetyki pętli DNA o różnych wewnętrznych kształtach. Zakrzywione DNA można wytworzyć, powtarzając sekwencję 10-merową w fazie z okresem spiralnym 10,5 pz, a ich krzywizny można oszacować za pomocą PAGE. Te dsDNA są zaprojektowane z lepkimi końcami, aby umożliwić stabilizację pętli przejściowej. Uzyskaliśmy szybkość zapętlania na podstawie wykładniczego wzrostu liczby zapętlonych cząsteczek w czasie. Stała szybkości wyżarzania między rozłączonymi lepki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jamesowi Watersowi, Gable'owi Wadsworthowi i Bo Broadwaterowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy również czterem anonimowym recenzentom za przydatne komentarze. Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Georgia Institute of Technology, nagrodę Burroughs Wellcome Fund Career Award w Scientific Interface oraz grant studenckiej sieci badawczej od NSF Physics of Living Systems.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw ekstraktu z małego DNA FRAG-100PRVWR97060-558
Akrylamid 40% roztwór 500 mlVWR97064-522
Bis-akryloamid 2% (w/v) roztwór 500 mlVWR97063-948
GeneRuler 100 bp Drabinka DNA, 100-1,000 pzFermentasSM0241
Mini pionowy system PAGEVWR89032-300
Filtr strzykawkowy 0,2 μ m CS50VWRA2666
TroloxSigma-Aldrich238813-1Gwygaszacz stanu trypletowego
Kwas protokatechowy (PCA)System oczyszczania tlenuSigma-Aldrich08992-50MG
Protokatechuat 3,4-dioksygenaza (PCD)Sigma-AldrichP8279-25UNsystem oczyszczania tlenu
mPEG-silan, MW 2,000 1 gLaysan BioMPEG-SIL-2000-1g
Biotyna-PEG-Silan, MW 3,400Laysan BioBiotyna-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Białko wiążące biotynęInvitrogenA2666
Phusion Hot Start Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsF-540L
Zestaw do ekstrakcji fragmentów DNA w żelu/PCRIBI ScientificIB47020
Szkiełka mikroskopowe ze szkła zwykłego premiumFisher Scientific12-544-1
Mikro szkło nakrywkowe VWR, prostokątne, nr 1VWR48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Recyrkulacyjny agregat chłodniczy/nagrzewnicaFisher Scientifictemperatury
Obiektywny kołnierzchłodzący Bioptechs150303regulacja temperatury
KMI53 Biologiczny Mikrometryczny stolik pomiarowySemprexKMI53
Wysokowydajny laser DPSS 532 nm 50 mWEdmund optykaNT66-968Cy3 wzbudzenie
CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, światłowód, FC / APC Złączekoherentne1139604wzbudzenie Cy5
650 nm BrightLine Dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrockFF650-Di01-25x36rozdzielacz dichroiczny
Łącznik wiązki LaserMUX, odbija 514,5, 532 i Lasery 543,5 nm, 25 mmSemrockLM01-552-25łączący dichroiczny
filtr fluorescencyjny Brightline 593/40Filtr emisji SemrockFF01-593/40-25Cy3
Filtr długoprzepustowy EdgeBasic LWP 635 nm, 25 mmFiltr emisyjny SemrockBLP01-635R-25Cy5
EMCCD iXon+Andor TechnologyDU-897E-CS0-#BV
IX51 odwrócona ramka mikroskopuOlympus
Objective UApo N 100X/1.49 Olej TIRFOlympus
Olejek immersyjny typ-F do mikroskopii fluorescencyjnejOlympusIMMOIL-F30CC
2 mm Średnica 45° Soczewka pręta pokryta aluminium Edmund optics54-092miniaturowe lustro
1/4" podróżne jednoosiowe stadium translacyjneThorlabsMS-1tłumaczenie miniaturowego lustra
Ø 1" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mmThorlabsAC254-200-A soczewkaskupiająca
Regulowana szczelina mechanicznaThorlabsVA100
Lustro dielektryczneThorlabsBB1-E02
Ø 1" Achromatyczny dublet, f = 100 mmThorlabsAC254-100-A soczewka przekaźnikowa
Mocowanie obiektywu do Ø 1" OptykaThorlabsLMR1
Mocowanie filtra dichroicznegoThorlabsFFM1
Stała platforma klatkowaPlatforma ThorlabsB3C
Kinematyka Montaż do Ø 1" OptykaThorlabsKM100
N-BK7 Plano-Wypukła soczewka & Oslash; 1", f = 40 mmThorlabsLA1422-A soczewkakolimacyjna
N-BK7 Soczewka płasko-wypukła, Ø 6,0 mm, f = 15 mmSoczewka teleskopu ThorlabsLA1222-A
Soczewka plano-wypukła N-BK7 & Oslash; 6,0 mm, f = 150 mmobiektyw teleskopuThorlabsLA1433-A
Kontrola

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
  2. Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
  3. Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
  4. Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
  5. Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
  6. Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  7. Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
  8. Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
  9. Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
  10. Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
  11. Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
  12. Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
  13. Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
  14. Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
  15. Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
  16. Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
  17. Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
  18. Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
  19. Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
  20. Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  21. Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
  22. Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
  23. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
  24. Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
  25. Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
  26. Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
  27. Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescencyjny przeniesienie energii rezonansowejmikroskopia ca kowitego wewn trznego odbiciapomiar czynnika Jtermodynamika wyginania DNAwewn trzna krzywizna DNAanaliza kinetyki zap tlaniaprotok wymiany nicianaliza danych w programie MATLAB

Powiązane artykuły