Artykuł metodologiczny

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

35.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51670

⸱

11 lipca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Jewish Health, 2Department of Pharmacology, School of Medicine, University of Colorado Denver

W tym artykule

Podsumowanie

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Streszczenie

Metabolomika to rozwijająca się dziedzina, która umożliwia profilowanie próbek z żywych organizmów w celu uzyskania wglądu w procesy biologiczne. Istotnym aspektem metabolomiki jest przygotowanie próbki, w wyniku którego niespójne techniki generują niewiarygodne wyniki. Technika ta obejmuje wytrącanie białek, ekstrakcję ciecz-ciecz i ekstrakcję do fazy stałej jako sposób frakcjonowania metabolitów na cztery odrębne klasy. Uzyskuje się lepsze wzbogacenie cząsteczek o niskiej obfitości z wynikającym ze wzrostem czułości, co ostatecznie skutkuje pewniejszą identyfikacją cząsteczek. Technika ta została zastosowana do próbek osocza, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i płynu mózgowo-rdzeniowego o objętości tak małej, jak 50 μl. Próbki mogą być używane do wielu dalszych zastosowań; Na przykład osad powstały w wyniku wytrącania białek może być przechowywany do późniejszej analizy. Supernatant z tego etapu poddawany jest ekstrakcji ciecz-ciecz przy użyciu wody i silnego rozpuszczalnika organicznego w celu oddzielenia związków hydrofilowych i hydrofobowych. Po frakcjonowaniu warstwa hydrofilowa może być przetworzona do późniejszej analizy lub wyrzucona, jeśli nie jest potrzebna. Frakcja hydrofobowa jest następnie traktowana szeregiem rozpuszczalników podczas trzech etapów ekstrakcji do fazy stałej w celu rozdzielenia jej na kwasy tłuszczowe, obojętne lipidy i fosfolipidy. Pozwala to technikowi na elastyczność w wyborze klasy związków, które są preferowane do analizy. Pomaga również w bardziej wiarygodnej identyfikacji metabolitów, ponieważ istnieje pewna wiedza na temat klasy chemicznej.

Wprowadzenie

Reakcje biologiczne generują metabolity jako produkty końcowe procesów komórkowych. Metabolomika to zbiór wszystkich związków obecnych w organizmie w wyniku tych procesów. Daje obraz fizjologii komórek i odzwierciedla reakcję organizmu na bodźce zewnętrzne lub wewnętrzne 1,2. Takie bodźce mogą być środowiskowe, toksykologiczne, farmakologiczne, dietetyczne, hormonalne lub związane z chorobą. Wiele zastosowań metabolomicznych było i jest obecnie badanych przez naukowców i obejmuje odkrywanie biomarkerów3, badania żywieniowe4, nauki o żywności5 i testowanie leków6. Niezależnie od zastosowania, różnice w danych, zanieczyszczenie i obecność wyników fałszywie dodatnich muszą zostać zmniejszone lub najlepiej usunięte. W przypadku odkrywania biomarkerów lub w przypadku określania różnic między grupą kontrolną a grupą chorobową lub badania wpływu leków na badanych, płyn biologiczny jest wybierany na podstawie zadawanych pytań i rodzajów badanych metabolitów7. Na przykład, jeśli bada się natychmiastowy wpływ leku wziewnego na płuca astmatyków, preferowane byłoby badanie metabolitów w próbkach płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF) przed i po podaniu. Aby upewnić się, że obserwowane różnice wynikają z rzeczywistej zmienności biologicznej, a nie z niewłaściwej techniki przygotowania próbki, niezbędny jest ustandaryzowany i spójny protokół laboratoryjny8. Informacje o próbce muszą być starannie udokumentowane, aby zapewnić, że zmienne, takie jak płyn biologiczny, szczep zwierzęcia, czas pobierania próbek, wiek uczestnika, płeć, by wymienić tylko kilka, są brane pod uwagę i uwzględniane w badaniu9. Ponadto, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia lub wyników fałszywie dodatnich, zaleca się analizę ślepych prób rozpuszczalnika i ślepych prób narzędzi10.

Dla tego protokołu, termin "metabolity" będzie używany w odniesieniu do faktycznie zidentyfikowanych związków. Korzystając z oprogramowania dostawcy, do wykrywania pików widma masowego używany jest algorytm wstępnego znajdowania pików. Piki te są wyrównane na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z) i czasu retencji. Drugi algorytm jest następnie używany do łączenia wielu cech w jeden związek. Obejmuje to takie cechy, jak addukty sodu, potasu lub amonu w trybie jonizacji dodatniej oraz chlorki w trybie jonów ujemnych. Dodatkowe opcje w oprogramowaniu obejmują takie funkcje, jak dimery i inne addukty. Na przykładzie glukozy, z pikami na poziomie 181,0707 m/z (M+H), 198,0972 m/z (M+NH4) i 203,05261 m/z (M+Na), przy użyciu pierwszego algorytmu byłyby trzy piki odpowiadające temu samemu związkowi. Jednak po zastosowaniu drugiego algorytmu, który opiera się na wzorze cząsteczkowym, te trzy addukty zostają zgrupowane razem, w wyniku czego powstaje jeden związek.

Metabolity mogą powodować zakłócenia w próbkach ze względu na złożoność obecnych związków. Obecność tysięcy metabolitów w jednej próbce powoduje supresję sygnału, szczególnie metabolitów o mniejszej liczebności. Oczyszczanie próbki w celu usunięcia białek zakłócających, a następnie rozdzielanie na wiele frakcji zmniejsza złożoność próbki, poprawiając w ten sposób separację pików, zwiększając rozdzielczość i zmniejszając koelucję metabolitów. W związku z tym wymagane jest oczyszczenie próbki i lepsza separacja związków. Wykazano, że samo wytrącanie białek, nawet przy użyciu różnych rozpuszczalników polarności, nie jest w stanie rozwiązać tego problemu11,12. Jednak poprzez połączenie silnego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak MTBE, z kolejnym etapem frakcjonowania, zwiększa się pokrycie metabolitami. Yang i wsp.12 pacjentów zgłosiło wzrost metabolitów z 1 851 lub 2 073 odpowiednio po samym wytrącaniu metanolu lub metanolu i etanolu do 3 806 metabolitów przy użyciu połączonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem MTBE, a następnie etapów ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Dzięki tej metodzie zaobserwowano zmniejszone nakładanie się metabolitów, lepszą separację pików i zwiększoną liczebność metabolitów.

Zanieczyszczenie niemetabolitami, takimi jak polimery, może wynikać z pobierania próbek, rozpuszczalników lub hałasu instrumentu, i może spowodować tłumienie sygnału potencjalnie istotnych metabolitów. Zaleca się, aby technicy i osoby pobierające próbki przed ich przygotowaniem konsekwentnie używali tej samej marki, typu i rozmiaru fiolek do pobierania próbek, końcówek do pipet i wszelkich innych probówek używanych podczas pobierania i przygotowywania próbek. Dzięki temu analityk danych ma pełną pewność, że obserwowane zmiany są realne, a nie wynikają z różnic w tle z innych źródeł. Skuteczność leczenia, różnice między grupą chorobową i kontrolną lub wszelkie inne analizy metaboliczne mogą być następnie badane z większą pewnością.

Omawiana tutaj metoda skupia się na połączonych metodach przygotowania próbek13-15, które mogą być stosowane do próbek osocza, BALF lub płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) do nieukierunkowanego profilowania metabolomicznego dla analizy opartej na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LCMS). Zarówno techniki rozdzielania chromatografii cieczowej (LC), jak i ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) mogą być sprzężone z MS po tej procedurze. Wielu badaczy przeprowadzających badania metabolomiczne stosuje technikę wytrącania białek i/lub technikę ekstrakcji ciecz-ciecz16,17. W naszych badaniach skutkowało to wykryciem mniejszej liczby metabolitów. Opisana tu metoda12 umożliwia wykrycie i identyfikację większej liczby metabolitów, obejmujących szerszy zakres metabolomu. Wzrost ten wynika z wyższej czystości próbek i zmniejszonego wpływu matrycy spowodowanego wcześniejszym oddzieleniem klas metabolitów.

Początkowy etap wytrącania białka jest wykonywany przy użyciu zimnego metanolu (MeOH) w celu usunięcia białka z próbki. Ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) przy użyciu eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE) i wody służy do oddzielania związków hydrofilowych i hydrofobowych. Następnie na warstwie hydrofobowej przeprowadza się ekstrakcję do fazy stałej (SPE) w celu rozdzielenia związków hydrofobowych na trzy klasy – kwasy tłuszczowe, lipidy obojętne i fosfolipidy. Frakcje hydrofobowe rozpuszcza się w 100% metanolu, natomiast frakcję hydrofilową rozpuszcza się w 5% acetonitrylu w wodzie. Etap ekstrakcji do fazy stałej (SPE) zapewnia dodatkowy poziom pewności wyników poprzez zmniejszenie liczby związków koeluujących, które w przeciwnym razie byłyby obecne, gdyby nie przeprowadzono etapu separacji.

Protokół

1. Wstępne rozważania, przygotowanie instrumentów i standardów

  1. Do przechowywania (szklane probówki, szklane fiolki z automatycznym samplerem) lub przenoszenia (szklane pipety) lipidów i rozpuszczalników organicznych należy zawsze używać szkła (szklane probówki).
  2. Zminimalizuj narażenie wszystkich próbek lipidów i wzorców na działanie powietrza. Szczelnie uszczelnij nakrętki z politetrafluoroetylenu (PFTE), aby uniknąć kontaktu z powietrzem i parowania. Wysuszone lipidy należy natychmiast ponownie zawiesić w następnym rozpuszczalniku lub utrzymywać je w stałym strumieniu azotu.
  3. Użyć 100 μl próbki. W przypadkach, gdy dostępna jest większa (lub mniejsza) próbki, odpowiednio dostosuj objętość. Jednakże podczas frakcjonowania lipidów w kolumnie NH2 SPE podane objętości muszą pozostać takie, jak wskazane.
  4. Włączyć wirówkę i ustawić temperaturę 0 °C przed rozpoczęciem przygotowania próbki.
  5. Technika ta wykorzystuje wiele lotnych rozpuszczalników, więc wszystkie rozpuszczalniki powinny być zakorkowane podczas przygotowywania próbki.
  6. Przygotuj dwa typy standardów dla każdego zalecenia.
  7. Przygotować kontrolę ujemną składającą się z dodanych wzorców, wszystkie w stałym stężeniu. Jest on dodawany do wszystkich próbek, a także do próbki zbiorczej, która jest używana jako kontrola jakości partii (próbka zbiorcza z wzbogaconymi próbkami używana do monitorowania odtwarzalności przygotowania próbki w oddzielnych dniach) i kontrola jakości instrumentu (wzbogacone próbki zbiorcze wcześniej przygotowane, podporcjowane i używane do monitorowania warunków/wahań przyrządu podczas analizy i w oddzielnych dniach).
    1. Przygotuj kontrole pozytywne przy 1x, 2x i 4x standardowych kolcach. Kontrole dodatnie są dodawane do wszystkich próbek, jak również do zbiorczej próbki osocza i są stosowane jako związki kontroli jakości zarówno na etapach przygotowania próbki, jak i na etapach analizy instrumentalnej w celu analizy i identyfikacji różnic w zmianie krotności podczas analizy danych, aby zapewnić, że wszystkie aspekty przygotowania i analizy instrumentalnej zostały przeprowadzone prawidłowo.
  8. Wzorce należy przechowywać w temperaturze -20 °C, a próbki w temperaturze -80 °C. Niektóre wzorce wewnętrzne, które są podatne na degradację w wyniku długotrwałego przechowywania, należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  9. Procedura ta wymaga użycia niebezpiecznych, łatwopalnych lub lotnych rozpuszczalników, takich jak MTBE. Wykonaj wszystkie czynności w dygestorium.

2. Standardy wewnętrzne

  1. Wybierz standardy wewnętrzne (ISTD) w oparciu o indywidualne projekty i ich specyficzny projekt eksperymentalny. W przypadku płynów biologicznych, takich jak osocze, BALF lub mocz, idealne byłyby znakowane izotopowo ISTD, które mają podobny charakter do tych występujących biologicznie w tych próbkach. Należą do nich między innymi aminokwasy, hormony lub lipidy. W przypadku próbek metabolomicznych roślin można stosować znakowane wzorce, takie jak flawonoidy lub karotenoidy. To samo dotyczy innych badań metabolomicznych, w których badacz powinien wybrać wzorzec wewnętrzny, który jest reprezentatywny dla rodzaju analizowanej próbki.
  2. Upewnij się, że wybrany ISTD obejmuje szeroki zakres chromatogramu; na przykład, jeśli czas akwizycji wynosi 20 minut, można zastosować wzorce, które eluują co 5 minut.
  3. Tworzyć hydrofilowe roztwory podstawowe w stężeniu 2 mg/ml przy użyciu różnych wzorców znakowanych izotopowo i/lub innych związków polarnych, które są egzogenne w stosunku do analizowanej próbki. Z każdego roztworu podstawowego utwórz jeden roztwór w stosunku 1:1 metanol:woda ze wszystkimi wzorcami do końcowego stężenia 25 μg/ml kreatyniny-D3, 100 μg/ml lizyny-D4 i 200 μg/ml waliny-D8.
  4. Twórz hydrofobowe roztwory podstawowe przy użyciu różnych izotopowo znakowanych wzorców i/lub innych związków niepolarnych, które są egzogenne w stosunku do analizowanej próbki; podstawowe stężenia kwasu tłuszczowego 17:0 (4 mg/ml), kwasu tłuszczowego 19:1 (4 mg/ml), ceramidów 17:0 (2 mg/ml), 17:0 PE (1,75 mg/ml), 15:0 PC (2 mg/ml) i testosteronu-D2 (1 mg/ml). Z każdego wywaru utwórz jeden roztwór w chloroformie: metanolu 1:1 ze wszystkimi wzorcami do końcowego stężenia 50 μg/ml 17:0 ceramidu, 100 μg/ml 15:0 PC, 100 μg/ml testosteronu-D2, 200 μg/ml kwasu tłuszczowego 17:0, 200 μg/ml kwasu tłuszczowego 19:1 i 200 μg/ml 17:0 PE w standardowej mieszance.
  5. Przetestuj stopień jonizacji każdego wzorca z wyprzedzeniem, używając co najmniej pięciu różnych stężeń dla każdego wzorca, aby określić granicę wykrywalności i liniowość przyrządu dla tych związków. Stężenie roztworu podstawowego dla każdego indywidualnego wzorca będzie się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego, a stężenie każdego wzorca w połączonym wzorcu wzbogaconym może wynosić od 20 μg/ml do 2 mg/ml w zależności od tego, jak dobrze jonizują.
  6. Stwórz mieszankę kolców kontroli dodatnich i dodaj je do próbek przy poziomach stężenia 1x, 2x lub 4x, aby monitorować ilościowo moc przygotowania próbki i dokładność danych instrumentalnych. Końcowe stężenie kontroli pozytywnych może wynosić: 2 mg/ml D-glukozy, 100 μg/ml alaniny-D3, 200 μg/ml kwasu metylomalonowego-D3, 20 μg/ml triglicerydu-D5 i/lub inne wzorce hydrofobowe i hydrofilowe. Dostosuj standardowe stężenia w oparciu o czułość oprzyrządowania MS i HPLC użytego do analizy.

3. Wytrącanie białka

  1. Rozmrozić próbki do RT i dodać 10 μl ISTD do każdej próbki, jak opisano poniżej.
  2. Do każdej próbki należy dodać 10 μl zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych roztworów wzorcowych (utworzonych z podstaw w krokach 2.3 i 2.4). W razie potrzeby dostosować standardowe stężenia w oparciu o czułość oprzyrządowania MS i HPLC użytego do analizy
    1. Do każdej próbki należy dodać 10 μl 1x, 2x lub 4x roztworu kontroli dodatniej (utworzonego z podstawowego roztworu w kroku 2.6). W razie potrzeby dostosować standardowe stężenia w oparciu o czułość oprzyrządowania MS i HPLC użytego do analizy
    2. Wirować każdą próbkę przez 10 sekund przed etapem wytrącania białka
  3. Do każdej próbki dodać 400 μl lodowatego metanolu (przechowywanego w temperaturze -20 °C).
  4. Wiruj przez 10 sekund na probówkę.
  5. Wirować w temperaturze 0 °C przez 15 minut przy 18 000 x g.
  6. Przenieść cały sklarowany sklarent do nowej szklanej probówki hodowlanej, a następnie wysuszyć podN2.
  7. Analizując frakcję granulek białkowych, przejdź do kroków 3.8-3.11. Jeśli nie analizujesz osadu białka, przejdź do sekcji 4.
    Uwaga: Osad białkowy może zawierać związki o wysokiej hydrofobowości, które byłyby przydatne podczas przeprowadzania badań leków18, analiz żywności z udziałem flawonoidów hydrofobowych19 lub badań metabolomicznych związanych z chorobami, w których gromadzą się bardzo hydrofobowe związki, takimi jak ceroidowe lipofuscynozyneuronalne 20 i lizosomalne choroby spichrzeniowelipidów 21.
  8. Dodać 1 ml MTBE do białego (lub białawego) granulatu białkowego, wirować przez 30 sekund na probówkę, następnie odwirować w temperaturze 0 °C przez 15 minut przy 18 000 x g. Zdekantować warstwę MTBE do nowej szklanej probówki hodowlanej.
    Jest to krytyczny krok, ponieważ błędy w tym przypadku drastycznie wpłyną na wyniki (patrz wykres 5 w reprezentatywnych wynikach).
    1. Konsekwentnie odsysaj tę samą ilość MTBE dla WSZYSTKICH próbek, ponieważ rozmiar osadu będzie się różnić w zależności od próbki. W związku z tym, jeżeli dla próbki z najmniejszą ilością supernatantu można zdekantować tylko 900 μl, należy zdekantować 900 μl dla wszystkich próbek.
  9. Powtórzyć krok 3.9 i połączyć warstwę organiczną z tą samą szklaną probówką hodowlaną przygotowaną w kroku 3.7.
  10. Suche próbki za pomocą przepływuN2 i ponownie zawiesić w 200 μl chloroformu:metanolu w stosunku 1:1. Wiruj krótko.
  11. Przenieść do probówki wirówkowej. Wirować w temperaturze 0 °C przez 15 minut przy 18 000 x g, a następnie przenieść supernatant do fiolek z nakrętkami automatycznego podajnika próbek za pomocą szklanych pipet.

4. Ekstrakcja ciecz-ciecz

  1. Za pomocą szklanej pipety dodać 3 ml MTBE do wysuszonej pozostałości metanolu (z sekcji 3, krok 6), wirować przez 30 sekund, dodać 750 μl wody, a następnie wirować 10 sekund na probówkę.
  2. Wirować ~200 x g przez 10 minut w wirówce w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać 2,5 ml warstwy MTBE (bez pobierania wody) i przenieść do czystej szklanej probówki hodowlanej.
    Uwaga: Jest to krytyczny krok, ponieważ różnice w tym miejscu wpłyną na wyniki. 2,5 ml MTBE należy ostrożnie zdekantować z wierzchniej warstwy, ponieważ pozwala to na zdekantowanie ustalonej objętości bez pipetowania warstwy wodnej znajdującej się poniżej. Jeżeli objętość próbki na początku doświadczenia była mniejsza niż wskazane dla tej metody 100 μl, należy przeskalować objętość MTBE tak, aby proporcjonalnie odzwierciedlała tę początkową objętość próbki.
  4. Dodać 3 ml MTBE do pozostałej części wodnej próbki i wirować 10 sekund na probówkę.
  5. Wirować ~200 x g przez 10 minut w wirówce w temperaturze RT.
  6. Odessać 3 ml MTBE (bez pobierania wody) i połączyć z probówką MTBE.
  7. Pozostałą warstwę wodną zagęścić przez suszenie podN2.
  8. Zawiesić pozostałość w 100 μl wody.
  9. Dodać 400 μl lodowatego MeOH do szklanej probówki hodowlanej, krótko zwirować, a następnie przenieść do probówki mikrowirówkowej.
  10. Pozostawić w temperaturze -80 °C na 20-30 min. Wirować w temperaturze 0 °C przez 15 min w temperaturze 18 000 x g.
    Uwaga: Zaleca się umieszczenie całego stojaka na próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C, ponieważ pozwoli to na wytrącenie się pozostałego białka w metanolu. Jeśli zamrażarka o temperaturze -80 °C nie jest dostępna, inne opcje to: przechowywanie w temperaturze -20 °C, umieszczenie próbek na suchym lodzie lub przechowywanie ich w pojemniku na lód. Ważne jest, aby konsekwentnie przechowywać próbki w zimnym środowisku i w tej samej temperaturze, aby umożliwić wytrącanie się.
  11. Odessać 450 μl supernatantu i przenieść do czystej probówki do mikrowirówki. Wysuszyć całkowicie w próżniowym koncentratorze odśrodkowym w temperaturze nie wyższej niż 45 °C. (Trwa około 1-2 godzin).
  12. Zawiesić wysuszony sklarowany sklarat w 200 μl 5% acetonitrylu/wody. Wiruj krótko. Zamrażać w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja do fazy stałej

  1. Wysuszyć frakcję MTBE pod azotem w temperaturze 35 °C przy dobrym przepływie azotu (trwa około 10-15 min).
  2. Po całkowitym wyschnięciu zatrzymać przepływ azotu i szybko ponownie zawiesić w 1 ml chloroformu (CHCl 3) za pomocą szklanej pipety. Wir krótko.
    Uwaga: Rozpuszczalniki, takie jak CHCl3, mają niską lepkość. Podczas pipetowania niskie napięcie powierzchniowe powoduje utratę rozpuszczalnika z pipety. Zaleca się, aby końcówka pipety była wstępnie zwilżona co najmniej dwa razy, aby umożliwić równowagę między pipetowanym rozpuszczalnikiem a przestrzenią w pipecie. Można również użyć gazoszczelnej strzykawki, jeśli jest dostępna.
  3. Skonfiguruj kolektor próżniowy SPE i kolumny NH2 SPE do frakcjonowania.
  4. Próbki należy ogrzewać do temperatury regulowanej i zawsze utrzymywać w zawieszeniu pod stałym przepływemN2. Ogrzewanie do temperatury słonecznej pozwoli na ponowne zawieszenie lipidów, a azot zapobiegnie utlenianiu i polimeryzacji lipidów.
  5. Umyj i kondycjonuj wkład SPE 2x z 400 μl heksanu. Wyrzuć odpady i zastąp je nową szklaną rurką zbiorczą.
  6. Dodać próbkę do kolumny SPE, zebrać przepływ w szklanych probówkach.
  7. Za pomocą szklanej pipety dodać 1 ml 2:1 CHCl3:IPA, zebrać płyn w tych samych szklanych probówkach (jest to frakcja neutralna).
  8. Wysuszyć frakcję obojętną podN2, aby zminimalizować utlenianie (trwa około 10-15 minut).
  9. Za pomocą szklanej pipety dodać 1 ml 5% kwasu octowego w eterze dietylowym, zebrać przepływ w nowych szklanych probówkach (jest to frakcja kwasów tłuszczowych).
  10. Wysuszyć frakcję kwasów tłuszczowych podN2, aby zminimalizować utlenianie (trwa około 10-15 minut).
  11. Za pomocą plastikowych końcówek dodaj 800 μl metanolu do wkładu SPE i zbierz przepływ w 15 ml plastikowych stożkowych probówkach (jest to frakcja fosfolipidowa).
  12. Przenieść frakcję fosfolipidową do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć próbki za pomocą próżniowego koncentratora odśrodkowego w temperaturze 45 °C (trwa to około 1-1,5 godziny).
  13. Zawiesić każdą z próbek z trzech frakcji w 200 μl 100% metanolu, wirować i przenieść do fiolki z automatycznym samplerem zakrętki w celu przechowywania.

6. Warunki przechowywania próbki

  1. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do analizy instrumentalnej.
    Uwaga: Wyekstrahowane próbki, rozpuszczone w rozpuszczalniku organicznym, mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C. Nie jest to jednak zalecane, ponieważ potencjalne metabolity będące przedmiotem zainteresowania ulegną degradacji w tej temperaturze. Przechowywanie ciekłego azotu również nie jest zalecane, ponieważ badacze zgłaszali problemy z zanieczyszczeniem, potrzebne są specjalne fiolki do przechowywania, a brak jednorodności w komorze powoduje duże wahania temperatury.
  2. Jeśli objętość próbki jest mała (<100 μl), należy użyć wkładek do fiolek, aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika w przestrzeni nad roztworem podczas przechowywania.
  3. Unikać zamrażania i rozmrażania próbek. Próbki należy rozmrozić tylko raz, tuż przed analizą instrumentu. Powtarzające się zamrażanie i rozmrażanie powoduje degradację próbki.

7. Warunki chromatografii cieczowej

  1. Do analizy frakcji hydrofobowej należy użyć kolumny analitycznej C-18 2,1 mm x 50 mm (1,8 μm) z kolumną ochronną C-18 2,1 mm x 12,5 mm (5 μm).
  2. Ustaw temperaturę automatycznego podajnika próbek na 4 °C, temperaturę kolumny na 60 °C, objętość wtrysku na 2 μl i szybkość przepływu na 0,25 ml/min.
  3. Użyj 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie dla ruchomej fazy A i 0,1% kwasu mrówkowego w izopropanolu: acetonitrylu: wodzie (60:36:4) dla ruchomej fazy B.
  4. Uruchom następujący gradientowy profil elucji: Zacznij od 30% B i zwiększ do 70% B od 0 do 1 minuty, następnie zwiększ do 100% B od 1 do 15 minut i przytrzymaj przez 5 minut, a następnie 5 minut mycia 10% B i 5 minut po biegu.
  5. Do analizy frakcji hydrofilowej należy użyć kolumny analitycznej HILIC 2,1 mm x 50 mm (2,6 μm) z kolumną ochronną.
  6. Ustaw temperaturę automatycznego podajnika próbek na 4 °C, temperaturę kolumny na 20 °C, objętość wtrysku na 2 μl i natężenie przepływu na 0,5 ml/min.
  7. Użyj 50% acetonitrylu w 10 mM octanu amonu, pH 5,8 dla fazy ruchomej A i 90% acetonitrylu w 10 mM octanie amonu o pH 5,8 dla fazy ruchomej B.
  8. Uruchom następujący gradientowy profil elucji: Zacznij od 100% B od 0 do 2 minut, następnie zmniejsz do 50% B od 2 do 15 minut, a następnie 5 minut mycia 0% B i 10 minut po uruchomieniu.

Wyniki

Cała technika przygotowania próbek została przeprowadzona zgodnie z powyższym opisem, a najważniejsze i/lub najistotniejsze aspekty przedstawiono poniżej. Hydrofilowe i hydrofobowe standardy wewnętrzne dodano do połączonych próbek osocza, aby przeprowadzić bezpośrednie porównania ilości standardów wewnętrznych i endogennych metabolitów przy użyciu różnych metod ekstrakcji. Dane z chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS) analizowano za pomocą oprogramowania jakościowego i ilościowego, co zaowocowało doskonałym odzyskiem i rozdziałem zarówno związków endogennych, jak i standardów wewnętrznych. Rycina 1 demonstruje skuteczność metody MTBE-SPE w ekstrakcji zarówno standardów lipidowych (A), jak i związków endogennych (B).

Ogólnie uzyskano lepszą ekstrakcję i szerszy zakres wykrytych metabolitów w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekstrakcja metanolem lub ekstrakcja „wyłącznie MTBE”, po porównaniu liczby cech za pomocą oprogramowania jakościowego i ilościowego po analizie LC-MS. Na przykład, przy zastosowaniu wyłącznie ekstrakcji metanolem, zmienność dla kreatyniny-D3 wynosiła 15,2%. Jednak w przypadku LLE z użyciem MTBE wartość ta została zredukowana do 1,04% CV. Przy użyciu MTBE powtarzalność dla lipidów i związków wodnych wynosiła odpowiednio <8% i <5%, w porównaniu do prostszej ekstrakcji metanolem, która skutkowała większą zmiennością, wynoszącą odpowiednio 29% dla lipidów i 15% dla związków wodnych. Standardy wewnętrzne użyte do monitorowania odzysku lipidów – testosteron-D2, ceramida C17, 15:0 PC oraz 17:0 PE – wzrosły odpowiednio o 26%, 200%, 100% i 400% w porównaniu do zastosowania samego metanolu. Podobne wzrosty odnotowano dla standardów wewnętrznych kwasów tłuszczowych oraz endogennych metabolitów fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanolaminy. Inne metabolity endogenne, takie jak sfingozyny, ceramidy, diacylglycerole, triacylglycerole, cholesterol i sfingomielina, nie zostały wykryte przy użyciu metanolu lub zostały wykryte na poziomie pomijalnym. Jednakże te endogenne lipidy zostały łatwo wykryte przy użyciu ekstrakcji MTBE.

W naszej analizie porównującej standardowe protokoły uzyskano następujące wyniki: sama wytrącanie metanolem pozwoliło na uzyskanie 1 851 metabolitów, wytrącanie metanol-etanol dało 2 073 metabolity, MTBE z ekstrakcją ciecz-ciecz dało 3 125, a MTBE z ekstrakcją ciecz-ciecz i ekstrakcją do fazy stałej pozwoliło na odzyskanie 3 806 metabolitów. Zatem podejście to skutkuje wyekstrahowaniem większej liczby metabolitów, co najprawdopodobniej wynika z mniejszej supresji jonów oraz czystszych próbek przed analizą LC-MS.

Rysunek 2 demonstruje wydajność rozdzielania metabolitów hydrofobowych na poszczególne klasy chemiczne w celu pewniejszej identyfikacji metabolitów. Występuje minimalny nakład związków zidentyfikowanych w trzech frakcjach lipidowych po SPE. Na potwierdzenie tego, Rysunek 3 przedstawia odzysk standardów wewnętrznych, wykazując, że ISTD zostały wymyte w frakcji odpowiadającej ich klasie chemicznej.

Próbki kontroli jakości są wykorzystywane do oceny jakości przygotowania próbek, określenia ewentualnych efektów serii w przypadku, gdy analiza dużego zestawu próbek wymaga wielu dni, oraz do monitorowania powtarzalności urządzenia. Chromatogramy są analizowane w celu upewnienia się, że odzysk standardów dodanych wynosi powyżej 90%, przy błędzie masy poniżej ± 3 ppm i oknie czasu retencji poniżej ±5%. Jeśli kryteria te nie zostaną spełnione, wyniki są odrzucane, a próbki analizowane ponownie. W przypadku wystąpienia efektów serii, w których zaobserwowano przesunięcie retencji dla jednej serii, oprogramowanie do analizy danych może to skorygować. Wcześniej przygotowana seria połączonych próbek osocza została poddana przygotowaniu próbek. Następnie frakcje podzielono na mniejsze alikwoty do fiolek autopobieracza i przechowywano w temperaturze -80 °C w celu monitorowania stanu urządzenia podczas analizy każdej próbki. Tabela 1 przedstawia wyniki dla tych standardów dodanych. Frakcja w trybie ujemnej jonizacji kwasów tłuszczowych (dane nie przedstawione w tabeli) nie została użyta do analizy, ponieważ % CV dla standardów dodanych w próbce QC przekroczył 10%. Zbiór danych dla tej frakcji został zatem odrzucony, a urządzenie poddano inspekcji i konserwacji. Tabela 2 przedstawia wyniki dla metabolitów endogennych w próbkach po trzech różnych dniach przygotowania próbek i trzykrotnych wtryskach do urządzenia. Metabolity endogenne w próbkach QC przygotowania próbek są powtarzalne, co świadczy o wysokiej jakości przygotowania próbek oraz powtarzalności wtrysków do urządzenia.

Jeśli jednak kroki przygotowania próbek nie zostaną prawidłowo wykonane, otrzymuje się nierzetelne i niespójne wyniki. Rysunek 4 przedstawia wyniki w sytuacji, gdy etap wytrącania białek w metodzie nie został przeprowadzony zgodnie z opisem. Trzech operatorów (A, B i C) wykonało tę samą procedurę przygotowania próbek na połączonych próbkach osocza. Operator A, zamiast pipetować wymaganą ilość supernatantu zgodnie z protokołem doświadczalnym, pobrał >1 ml podczas obu płukań, wliczając w to część osadu. Doprowadziło to nie tylko do większej liczby wyników fałszywie dodatnich dla tej frakcji, ale także zwiększyło zmienność danych.

Powtarzalność chromatograficzną danych przedstawiono na Rysunku 7. Połączone próbki osocza przygotowano w trzech powtórzeniach w oddzielne dni, stosując wytrącanie białek, ekstrakcję ciecz-ciecz oraz ekstrakcję do fazy stałej zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Każdą frakcję analizowano przy użyciu rozdziału chromatograficznego opisanego w sekcji 7 protokołu. Następnie próbki wstrzyknięto w trzech powtórzeniach do układu LC-MS w celu oceny powtarzalności instrumentu oraz przygotowania próbek. Ta spójna zgodność wykazuje zarówno wysoką powtarzalność przygotowania próbek w trzech różnych dniach, jak i skuteczność metody chromatograficznej w uzyskiwaniu powtarzalnych wyników. W przypadku frakcji kwasów tłuszczowych w trybie jonizacji negatywnej zaobserwowano wzrost szumu chemicznego. Może to wynikać z obecności zanieczyszczeń w rozpuszczalnikach LC-MS i może prowadzić do niespójnych wyników ilościowych metabolomiki. Dlatego analizowano wyłącznie metabolity, które eluowały przed 9 min.

Podczas realizacji długich list zadań z czasem może dojść do utraty czułości instrumentu oraz zmiany stężeń buforów, co skutkuje obniżeniem intensywności sygnału i przesunięciem czasu retencji. Jeśli wariancja nakładania się czasów retencji wynosi mniej niż 5%, a wariancja intensywności sygnału jest mniejsza niż 10%, dane nadal mieszczą się w standardowych granicach laboratoryjnych. Oprogramowanie analityczne może zostać wykorzystane do wyrównania i normalizacji danych w celu skorygowania dryftu instrumentu oraz czasu retencji. Jeśli jednak wariancja jest znaczna, należy ustalić jej przyczynę. Po rozwiązaniu problemu można ponownie przeanalizować próbki.

Porównanie ekstrakcji lipidów; wykres słupkowy; wyniki dla metanolu i MTBE; zawartość w liczbach; analiza LC-MS.
Rysunek 1. Zawartość lipidowych ISTD (A) oraz endogennych metabolitów (B) po ekstrakcji i chromatografii przeciwprądowej (RPC)12. Przeprowadzono ekstrakcję, a uzyskane próbki rozdzielono za pomocą RPC i przeanalizowano metodą LC-MS w dodatnim i ujemnym trybie jonizacji. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Diagram Venna dla klas lipidów: neutralne, kwasy tłuszczowe, fosfolipidy z obszarami nakładania się.

Rysunek 2. Porównanie frakcji MTBE-SPE12. Metabolity zidentyfikowane w każdej frakcji porównano w celu ustalenia stopnia ich nakładania się podczas etapu SPE preparatyki. Liczby w diagramie Venna odpowiadają liczbie metabolitów wykrytych w każdej frakcji. Zaobserwowano niewielkie nakładanie się trzech frakcji, co świadczy o skutecznej ekstrakcji związków i rozdzieleniu klas metabolitów podczas etapu SPE. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Wykres słupkowy analizy lipidów; zawartość testosterone-d2, ceramidu i fosfolipidów w badaniu MS.
Rycina 3. Odzysk ISTD w frakcjach przy użyciu metody MTBE-SPE12. Przeprowadzono ekstrakcję, a otrzymane próbki rozdzielono za pomocą RPC i przeanalizowano metodą LCMS w trybie pozytywnym i negatywnym, zgodnie z opisem w tekście. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Diagram Venna z zbiorami A, B, C; liczby wskazują obszary wspólne.
Rysunek 4. Wyniki z frakcji osadu przygotowanej przez trzech operatorów. Trzej operatorzy przygotowania próbek A, B i C przeprowadzili ten sam etap przygotowania białek w połączonych próbkach osocza. Liczby na diagramie Venna odzwierciedlają liczbę metabolitów wykrytych przez każdego operatora. Operatorzy B i C pipetowali wymaganą objętość zgodnie z protokołem przygotowania próbek, podczas gdy operator A pipetował cały nadsącz oraz część osadu, co skutkowało wykryciem ponad 500 dodatkowych metabolitów, z których większość stanowiły wyniki fałszywie dodatnie dla tej konkretnej frakcji.

Schemat procesu wirowania; oczyszczanie białek; etapy sedymentacji w mikroprobówkach.
Rysunek 5. Powstawanie osadu białkowego podczas etapu wytrącania białek. (A) 100 µl osocza ludzkiego przed przygotowaniem próbki; (B) osocze po dodaniu lodowatego metanolu; (C) osad białkowy utworzony na dnie probówki po wirowaniu w 0 °C przez 15 min przy 18,000 x g.

Sekwencja reakcji chemicznych w probówkach; schemat procesu; etapy A-G przedstawiające zmiany roztworów.
Rysunek 6. Rozdzielenie warstw hydrofilowej i hydrofobowej podczas etapu ekstrakcji ciecz-ciecz (LLE). Do rozdzielenia metabolitów hydrofilowych i hydrofobowych zastosowano organiczny rozpuszczalnik, którym jest metylowy eter tert-butylu (MTBE), oraz wodę. Warstwa MTBE zawiera rozpuszczone związki niepolarne, a warstwa wodna zawiera rozpuszczone związki polarne. (A) nadosad z osocza po usunięciu białek; (B) osocze po suszeniu w strumieniu azotu; (C) osocze po dodaniu MTBE; (D) dodanie wody do osocza i MTBE; (E) warstwy MTBE-woda powstałe po wirowaniu; (F) usunięcie górnej warstwy MTBE; (G) pozostała warstwa głównie hydrofilowa po usunięciu MTBE.

Wyniki chromatografii cieczowej; wiele wykresów frakcjonowania; intensywność w funkcji czasu retencji.
Rycina 7. Chromatogramy frakcji z wybranego zbioru danych. Przygotowanie próbek przeprowadzono na trzech oddzielnych połączonych próbkach kontroli jakości (QC) osocza, a każdą próbkę wstrzyknięto trzykrotnie do urządzenia LC-MS. Przedstawiono całkowite chromatogramy jonowe próbek osocza uzyskane przy użyciu parametrów LC-MS wskazanych w sekcji 7 protokołu metody. Przedstawienie chromatograficzne innych płynów ustrojowych będzie się różnić ze względu na różnice w składzie metabolitów. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

FrakcjaTryb jonizacjiWzorzec wewnętrznynŚrednia powierzchnia piku% CV powierzchni piku
WodnyDodatniKreatynina-D33122173113.8%
Lipidy obojętneDodatniTriglicerydy-D53148370329.9%
Ceramida C1731127367077.9%
FosfolipidDodatni15:0 PC3212489299.3%
17:0 PE325172347.9%

Tabela 1. Wyniki kontroli jakości dla wzbogaconych standardów wewnętrznych. Połączone próbki osocza z zestawu danych modelu mysiego z rozedmą analizowano codziennie w celu monitorowania stanu instrumentu podczas tego wielotygodniowego badania. Do wyznaczenia powierzchni pików standardów wewnętrznych wykorzystano oprogramowanie do analizy ilościowej (n = liczba wstrzyknięć kontroli jakości instrumentu).

FrakcjaTryb jonizacjiMetabolity endogenneŚrednia powierzchnia piku% CV powierzchni piku
WodnaPozytywnyKreatynina25545742.3%
Walina37121513.3%
Glukoza26691906.9%
Lipid neutralnyPozytywny3-dehydrosfinganina2266443.9%
DG(16:0/16:1/0:0)113018.2%
DG(P-14:0/18:1)3641191.9%
FosfolipidPozytywnyPC(24:0/0:0)275990.9%
PC16:0/22:6)28733264.5%
PI(16:0/18:1)1129984.4%
Kwas tłuszczowyPozytywnykwas 10-okso-5,8-decadienowy13632842.3%
kwas 16-okso-heptadekanowy837002.9%
kwas 2-metylowelerynowy2857825.7%
Kwas tłuszczowyNegatywnykwas 10-hydroksy-8-oktadecenowy100424.9%
kwas (R)-laballenowy1739296.5%
kwas 2-ketowelerynowy354886.0%

Tabela 2. Wyniki kontroli jakości dla metabolitów endogennych. Przeanalizowano połączone próbki osocza z zestawu danych dotyczących ludzkich schorzeń w celu monitorowania powtarzalności przygotowania próbek w różne dni. Próbki przygotowywano w trzech powtórzeniach przez trzy dni (n = 9 wstrzyknięć QC przygotowania).

Dyskusja

Jednym z celów klinicznych badań metabolomicznych jest identyfikacja zmian w metabolomie związanych z chorobą lub leczeniem. W związku z tym techniki przygotowywania próbek muszą być solidne, spójne i możliwe do przeniesienia z technika na technika i z laboratoriumdo laboratorium 22. Uzyskane dane muszą być reprezentatywne dla próby, a zidentyfikowane zmiany muszą odzwierciedlać zestaw próbek, a nie błędy w przygotowaniu próbki. Dlatego konieczne jest dokładne pipetowanie, właściwa temperatura, skuteczne dekantowanie niemieszających się warstw, suszenie w atmosferze azotu oraz stosowanie naczyń szklanych i końcówek tych samych marek i rozmiarów.

Na etapie wytrącania białka ważne jest, aby z każdej granulki zdekantować taką samą ilość roztworu. Zmniejsza to zmienność objętości, a tym samym zmniejsza zmienność danych próbki. Ten etap wytrącania białek jest niezbędny do badań metabolomicznych i nie można go pominąć, ponieważ usuwa białko z próbek przed analizą profilowania małych cząsteczek na spektrometrze mas. Eliminuje patogeny i duże makrocząsteczki oraz uwalnia związane metabolity z białek7. Brak akumulacji białek w próbkach wydłuża żywotność kolumny HPLC oraz zwiększa dokładność i jakość wyników. Rysunek 5 przedstawia osad białkowy powstały podczas wykonywania tej techniki na próbkach osocza. Pozwala to na wykrycie małych cząsteczek, zwiększa obfitość jonów i zmniejsza efekty matrycy białek w próbce. Ponadto, ponieważ zakłada się, że wszystkie białka są usuwane na tym etapie, aminokwasy wykryte podczas analizy LC-MS pochodziłyby ze zmian metabolicznych, a nie z rozpadu białek.

Etap ekstrakcji ciecz-ciecz ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozdziela metabolity hydrofilowe i hydrofobowe na dwie niemieszające się warstwy. Rysunek 6 przedstawia procedurę LLE i reprezentację warstwy LLE. Niewłaściwe rozdzielenie dwóch warstw powoduje utratę metabolitów lub ich elucję w obu frakcjach. Staranne zastosowanie tego kroku zmniejsza ilość związków hydrofilowych, które pojawiają się we frakcji hydrofobowej. Wyniki dla tych związków stają się niewiarygodne, ponieważ nie można określić, która frakcja zawiera reprezentatywne wyniki. Przy prawidłowym wykonaniu nakładanie się metabolitów jest zmniejszone.

Aby zapobiec degradacji oksydacyjnej, szczególnie w lipidach, ale także w małych cząsteczkach, które mogą zawierać na przykład grupy tiolowe, narażenie na tlen musi być ograniczone do minimum. Dlatego procedura ta jest zawsze wykonywana w atmosferze azotu, aby zmniejszyć/zapobiec utlenianiu związków zawierających lipidy lub tiol. Ponadto przenoszenie próbki i/lub roztworu jest szybkie (w ciągu pierwszej minuty) w celu zmniejszenia narażenia na tlen, a następnie próbki są szybko umieszczane pod stałym strumieniem azotu w celu wyschnięcia. Po wysuszeniu są one natychmiast ponownie zawieszane w 100% metanolu z wyżej omówionych powodów.

Laboratoria mogą czerpać korzyści z tej kompleksowej metody na wiele sposobów; Naukowcy, którzy chcą wyizolować jedną klasę związków, mogą wybrać tę część metody, która najlepiej odpowiada ich potrzebom. Ci, którzy chcą przeprowadzić jedynie wytrącanie białek w celu uzyskania puli metabolitów, mogą to zrobić. Jeśli pożądane są metabolity hydrofilowe, takie jak wiele leków farmaceutycznych, aminokwasów i cukrów, lub jeśli pożądane są tylko metabolity hydrofobowe, takie jak na przykład trójglicerydy, epoksydy, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i fosfolipidy, naukowcy mogą przeprowadzić etap ekstrakcji ciecz-ciecz po wytrąceniu białka i odrzucić niepożądaną frakcję. Badacze, którzy wymagają dalszej podklasyfikacji związków hydrofobowych (obojętne lipidy, kwasy tłuszczowe i fosfolipidy), mogą przejść do etapu frakcjonowania.

Kwestie związane z przechowywaniem są ważne dla utrzymania żywotności próbek do późniejszej analizy. Jeśli próbki są przechowywane nieprawidłowo, może dojść do degradacji lub rozkładu. Idealnie byłoby, gdyby próbki były przechowywane w zakręcanych bursztynowych fiolkach z dala od światła, aby zapobiec degradacji gatunków wrażliwych na światło. Próbki należy również przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80°C, aby zapobiec degradacji metabolitów23-25. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo omówione, próbki są zawsze przechowywane w temperaturze 4°C na tacy automatycznego podajnika próbek podczas analizy LC-MS. Gwarantuje to, że wszystkie próbki są utrzymywane w stałej temperaturze, a zmiany temperatury otoczenia nie wpływają na lepkość, rozpuszczalność ani stabilność próbek. Zaleca się ćwiczenie manualnych aspektów tej procedury, takich jak LLE i SPE, w celu uzyskania pewności i komfortu związanych z wykonywanymi krokami.

Istnieje kilka ograniczeń dotyczących tej techniki. Dyskretne oddzielenie metabolitów hydrofobowych i hydrofilowych nie jest gwarantowane, ponieważ niektóre związki z natury dzielą się na obie frakcje ze względu na ich skład chemiczny i stan naładowania. Ponadto, jak pokazano na rysunku 4, niewłaściwa technika na etapie ekstrakcji osadów białkowych może skutkować słabą odtwarzalnością metabolitów zarówno w próbkach, jak i podczas kontroli jakości. Ma to wpływ na statystyki, zwłaszcza w przypadku małych zbiorów danych, ponieważ moc statystyczna nie jest dostępna. Dlatego tak ważne jest, aby ten etap był wykonywany dokładnie tak samo za każdym razem dla każdej próbki. Kolejnym ograniczeniem jest czas. Chociaż w całym protokole znajdują się punkty zatrzymania, w których próbki mogą być zamrożone, a przygotowanie kontynuowane następnego dnia, należy przeznaczyć cały dzień na wykonanie tej procedury. Po trzecie, nie każdy związek w próbce biologicznej może być oceniany pod kątem supresji jonów. Ponieważ nie jest możliwe określenie, w jaki sposób matryca wpływa na każdy pojedynczy metabolit, obecną opcją jest ocena wewnętrznych wzorców, które teoretycznie naśladują niektóre klasy endogennych metabolitów. Wreszcie, identyfikacja bezwzględna nie może być przeprowadzona wyłącznie za pomocą tej metody. Tandem MS we współpracy z przeszukiwaniem baz danych i wzorcami jest niezbędny do bezwzględnej identyfikacji metabolitów.

Ważną częścią metabolomiki jest identyfikacja związków. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo omówione, próbki kontroli jakości analizowano za pomocą LC-MS. Przygotowano wiele ślepych prób do przygotowania i ślepych prób instrumentalnych do wykorzystania jako odejmowanie tła w celu zmniejszenia odsetka wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniami, co dało bardziej wiarygodne trafienia metabolitów. Po tym kroku liczba "cech molekularnych" została pogrupowana w oparciu o m/z, czas retencji, stosunek izotopów i addukty, aby stworzyć listę rzeczywistych związków. Chociaż lista związków została znacznie zmniejszona, wyniki były bardziej wiarygodne, ponieważ nie opierały się na wielu adduktach z tego samego związku. Pełna metoda jest kompleksowa i pozwala na izolację metabolitów hydrofobowych, takich jak obojętne lipidy, fosfolipidy, kwasy tłuszczowe, trójglicerydy i steroidy, przy jednoczesnym wyizolowaniu klas hydrofilowych we frakcji wodnej, z których zidentyfikowano eikozanoidy, cukry, flawonoidy i aminokwasy12,26.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Prezentowany tutorial został wykonany i opracowany w Głównym Ośrodku Spektrometrii Mas w National Jewish Health. Zakład NJH MS jest częściowo wspierany przez CCSTI UL1 TR000154. Finansowanie z grantów NIH P20 HL-113445 i R01 HL-095432 również wsparło te prace.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylFisher ScientificA955-4
MetanolFisher ScientificL-6815
ChloroformFisher ScientificC606-1
HexaneSigma Aldrich34859
Kwas octowySigma Aldrich49199-50ML-F
Eter metylowy tert-butylowyJ.T. Baker9042-03
Alkohol izopropylowySigma Aldrich34965-2.5L
Woda Honeywell Burdick Jackson365-4
System grzewczy OA-SYSOrganomation Associates, IncSłuży do utrzymywania próbek pod stałym przepływem azotu w temperaturze 35 ° C
12-pozycyjny rozdzielacz próżniowyPhenomenex
Strata NH2 (55 µ M, 70Å ;) Wkłady SPE 100 mg/mlPhenomenex8B-S009-EAK
Szklane końcówki do pipetFisher Scientific13-678-20CSłuży do przenoszenia próbki do kolumny SPE
Plastikowe końcówki do pipetUSA Scientific1182-1830Używane, gdy szklane końcówki nie są potrzebne
Probówki do mikrowirówekFisher Scientific02-681-320
Pipety szklane z podziałkąFisher Naukowy13-678-27BSłuży do przenoszenia rozpuszczalników organicznych podczas przygotowywania próbek
Probówki hodowlane ze szkła pyrexowegoCorning Incorporated99499-16XSłuży do przechowywania frakcji wodnych i lipidowych do następnego kroku
Fiolki z automatycznym podajnikiem próbekAgilent Technologies5182-0545
Fiolki zatrzaskowe do fiolek z automatycznym sampleremAgilent Technologies5182-0541
Szkło wkładkiAgilent Technologies5183-2085Używane do małych objętości próbek
Oprogramowanie do analizy jakościowej Mass HunterAgilent TechnologiesWersja B.06.00Służy do monitorowania czasów retencji i krzywych ciśnienia
Oprogramowanie do analizy ilościowej Mass HunterAgilentTechnologies Wersja B.05.02Służy do analizy danych kontroli jakości i próbek
Mass Profiler Professional oprogramowanieAgilent TechnologiesWersja B.12.50Służy do określania statystyk, zmian fałdowania i identyfikacji metabolitów

Bibliografia

  1. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).
  2. Clarke, C. J., Haselden, J. N. Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity. Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).
  3. Wang, X., Zhang, A., Sun, H. Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma. Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).
  4. Collino, S., Martin, F. -P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics. Nutrients. 1, 101-110 (2009).
  5. Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. Metabolomic analysis in food science: a review. Trends in Food Scienc., & Technology. 20, 557-566 (2009).
  6. Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).
  7. Wishart, D., et al. Metabolome Analysis: An Introduction. , John Wile., & Sons, Inc. 253-288 (2006).
  8. Vuckovic, D. Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography–mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).
  9. Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition. NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).
  10. Dong, M. W. Modern HPLC for Practicing Scientists. , John Wile., & Sons, Inc. (2006).
  11. Want, E. J., et al. Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).
  12. Yang, Y., et al. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  14. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).
  15. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).
  16. Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).
  17. Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction. Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).
  18. Kerns, E. H., Di, L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
  19. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., Jiménez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).
  20. Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease. NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).
  21. Schulze, H., Sandhoff, K. Lysosomal lipid storage diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  22. Kuhn, E., et al. Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma. Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).
  23. Rist, M. J., et al. Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics. Metabolites. 3, 243-258 (2013).
  24. Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin‘t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine. Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).
  25. Wood, J. T., et al. Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters. Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).
  26. Bahr, T. M., et al. Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

U amkowanie metabolit wwytr canie bia ekekstrakcja ciecz cieczekstrakcja do fazy sta ejanaliza metabolit wzakres metabolit wseparacja lipid wprzygotowanie pr bekstandardy wewn trzneklasy chemiczne
Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.