Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Podsumowanie

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Streszczenie

Metabolomika to rozwijająca się dziedzina, która umożliwia profilowanie próbek z żywych organizmów w celu uzyskania wglądu w procesy biologiczne. Istotnym aspektem metabolomiki jest przygotowanie próbki, w wyniku którego niespójne techniki generują niewiarygodne wyniki. Technika ta obejmuje wytrącanie białek, ekstrakcję ciecz-ciecz i ekstrakcję do fazy stałej jako sposób frakcjonowania metabolitów na cztery odrębne klasy. Uzyskuje się lepsze wzbogacenie cząsteczek o niskiej obfitości z wynikającym ze wzrostem czułości, co ostatecznie skutkuje pewniejszą identyfikacją cząsteczek. Technika ta została zastosowana do próbek osocza, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i płynu mózgowo-rdzeniowego o objętości tak małej, jak 50 μl. Próbki mogą być używane do wielu dalszych zastosowań; Na przykład osad powstały w wyniku wytrącania białek może być przechowywany do późniejszej analizy. Supernatant z tego etapu poddawany jest ekstrakcji ciecz-ciecz przy użyciu wody i silnego rozpuszczalnika organicznego w celu oddzielenia związków hydrofilowych i hydrofobowych. Po frakcjonowaniu warstwa hydrofilowa może być przetworzona do późniejszej analizy lub wyrzucona, jeśli nie jest potrzebna. Frakcja hydrofobowa jest następnie traktowana szeregiem rozpuszczalników podczas trzech etapów ekstrakcji do fazy stałej w celu rozdzielenia jej na kwasy tłuszczowe, obojętne lipidy i fosfolipidy. Pozwala to technikowi na elastyczność w wyborze klasy związków, które są preferowane do analizy. Pomaga również w bardziej wiarygodnej identyfikacji metabolitów, ponieważ istnieje pewna wiedza na temat klasy chemicznej.

Wprowadzenie

Reakcje biologiczne generują metabolity jako produkty końcowe procesów komórkowych. Metabolomika to zbiór wszystkich związków obecnych w organizmie w wyniku tych procesów. Daje obraz fizjologii komórek i odzwierciedla reakcję organizmu na bodźce zewnętrzne lub wewnętrzne ^1,2. Takie bodźce mogą być środowiskowe, toksykologiczne, farmakologiczne, dietetyczne, hormonalne lub związane z chorobą. Wiele zastosowań metabolomicznych było i jest obecnie badanych przez naukowców i obejmuje odkrywanie biomarkerów³, badania żywieniowe⁴, nauki o żywności⁵ i testowanie leków⁶. Niezależnie od zastosowania, różnice w danych, zanieczyszczenie i obecność wyników fałszywie dodatnich muszą zostać zmniejszone lub najlepiej usunięte. W przypadku odkrywania biomarkerów lub w przypadku określania różnic między grupą kontrolną a grupą chorobową lub badania wpływu leków na badanych, płyn biologiczny jest wybierany na podstawie zadawanych pytań i rodzajów badanych metabolitów⁷. Na przykład, jeśli bada się natychmiastowy wpływ leku wziewnego na płuca astmatyków, preferowane byłoby badanie metabolitów w próbkach płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF) przed i po podaniu. Aby upewnić się, że obserwowane różnice wynikają z rzeczywistej zmienności biologicznej, a nie z niewłaściwej techniki przygotowania próbki, niezbędny jest ustandaryzowany i spójny protokół laboratoryjny⁸. Informacje o próbce muszą być starannie udokumentowane, aby zapewnić, że zmienne, takie jak płyn biologiczny, szczep zwierzęcia, czas pobierania próbek, wiek uczestnika, płeć, by wymienić tylko kilka, są brane pod uwagę i uwzględniane w badaniu⁹. Ponadto, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia lub wyników fałszywie dodatnich, zaleca się analizę ślepych prób rozpuszczalnika i ślepych prób narzędzi¹⁰.

Dla tego protokołu, termin "metabolity" będzie używany w odniesieniu do faktycznie zidentyfikowanych związków. Korzystając z oprogramowania dostawcy, do wykrywania pików widma masowego używany jest algorytm wstępnego znajdowania pików. Piki te są wyrównane na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z) i czasu retencji. Drugi algorytm jest następnie używany do łączenia wielu cech w jeden związek. Obejmuje to takie cechy, jak addukty sodu, potasu lub amonu w trybie jonizacji dodatniej oraz chlorki w trybie jonów ujemnych. Dodatkowe opcje w oprogramowaniu obejmują takie funkcje, jak dimery i inne addukty. Na przykładzie glukozy, z pikami na poziomie 181,0707 m/z (M+H), 198,0972 m/z (M+NH₄) i 203,05261 m/z (M+Na), przy użyciu pierwszego algorytmu byłyby trzy piki odpowiadające temu samemu związkowi. Jednak po zastosowaniu drugiego algorytmu, który opiera się na wzorze cząsteczkowym, te trzy addukty zostają zgrupowane razem, w wyniku czego powstaje jeden związek.

Metabolity mogą powodować zakłócenia w próbkach ze względu na złożoność obecnych związków. Obecność tysięcy metabolitów w jednej próbce powoduje supresję sygnału, szczególnie metabolitów o mniejszej liczebności. Oczyszczanie próbki w celu usunięcia białek zakłócających, a następnie rozdzielanie na wiele frakcji zmniejsza złożoność próbki, poprawiając w ten sposób separację pików, zwiększając rozdzielczość i zmniejszając koelucję metabolitów. W związku z tym wymagane jest oczyszczenie próbki i lepsza separacja związków. Wykazano, że samo wytrącanie białek, nawet przy użyciu różnych rozpuszczalników polarności, nie jest w stanie rozwiązać tego problemu^11,12. Jednak poprzez połączenie silnego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak MTBE, z kolejnym etapem frakcjonowania, zwiększa się pokrycie metabolitami. Yang i wsp.¹² pacjentów zgłosiło wzrost metabolitów z 1 851 lub 2 073 odpowiednio po samym wytrącaniu metanolu lub metanolu i etanolu do 3 806 metabolitów przy użyciu połączonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem MTBE, a następnie etapów ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Dzięki tej metodzie zaobserwowano zmniejszone nakładanie się metabolitów, lepszą separację pików i zwiększoną liczebność metabolitów.

Zanieczyszczenie niemetabolitami, takimi jak polimery, może wynikać z pobierania próbek, rozpuszczalników lub hałasu instrumentu, i może spowodować tłumienie sygnału potencjalnie istotnych metabolitów. Zaleca się, aby technicy i osoby pobierające próbki przed ich przygotowaniem konsekwentnie używali tej samej marki, typu i rozmiaru fiolek do pobierania próbek, końcówek do pipet i wszelkich innych probówek używanych podczas pobierania i przygotowywania próbek. Dzięki temu analityk danych ma pełną pewność, że obserwowane zmiany są realne, a nie wynikają z różnic w tle z innych źródeł. Skuteczność leczenia, różnice między grupą chorobową i kontrolną lub wszelkie inne analizy metaboliczne mogą być następnie badane z większą pewnością.

Omawiana tutaj metoda skupia się na połączonych metodach przygotowania próbek^13-15, które mogą być stosowane do próbek osocza, BALF lub płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) do nieukierunkowanego profilowania metabolomicznego dla analizy opartej na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LCMS). Zarówno techniki rozdzielania chromatografii cieczowej (LC), jak i ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) mogą być sprzężone z MS po tej procedurze. Wielu badaczy przeprowadzających badania metabolomiczne stosuje technikę wytrącania białek i/lub technikę ekstrakcji ciecz-ciecz^16,17. W naszych badaniach skutkowało to wykryciem mniejszej liczby metabolitów. Opisana tu metoda¹² umożliwia wykrycie i identyfikację większej liczby metabolitów, obejmujących szerszy zakres metabolomu. Wzrost ten wynika z wyższej czystości próbek i zmniejszonego wpływu matrycy spowodowanego wcześniejszym oddzieleniem klas metabolitów.

Początkowy etap wytrącania białka jest wykonywany przy użyciu zimnego metanolu (MeOH) w celu usunięcia białka z próbki. Ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) przy użyciu eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE) i wody służy do oddzielania związków hydrofilowych i hydrofobowych. Następnie na warstwie hydrofobowej przeprowadza się ekstrakcję do fazy stałej (SPE) w celu rozdzielenia związków hydrofobowych na trzy klasy – kwasy tłuszczowe, lipidy obojętne i fosfolipidy. Frakcje hydrofobowe rozpuszcza się w 100% metanolu, natomiast frakcję hydrofilową rozpuszcza się w 5% acetonitrylu w wodzie. Etap ekstrakcji do fazy stałej (SPE) zapewnia dodatkowy poziom pewności wyników poprzez zmniejszenie liczby związków koeluujących, które w przeciwnym razie byłyby obecne, gdyby nie przeprowadzono etapu separacji.

Protokół

1. Wstępne rozważania, przygotowanie instrumentów i standardów

1. Do przechowywania (szklane probówki, szklane fiolki z automatycznym samplerem) lub przenoszenia (szklane pipety) lipidów i rozpuszczalników organicznych należy zawsze używać szkła (szklane probówki).
2. Zminimalizuj narażenie wszystkich próbek lipidów i wzorców na działanie powietrza. Szczelnie uszczelnij nakrętki z politetrafluoroetylenu (PFTE), aby uniknąć kontaktu z powietrzem i parowania. Wysuszone lipidy należy natychmiast ponownie zawiesić w następnym rozpuszczalniku lub utrzymywać je w stałym strumieniu azotu.
3. Użyć 100 μl próbki. W przypadkach, gdy dostępna jest większa (lub mniejsza) próbki, odpowiednio dostosuj objętość. Jednakże podczas frakcjonowania lipidów w kolumnie NH₂ SPE podane objętości muszą pozostać takie, jak wskazane.
4. Włączyć wirówkę i ustawić temperaturę 0 °C przed rozpoczęciem przygotowania próbki.
5. Technika ta wykorzystuje wiele lotnych rozpuszczalników, więc wszystkie rozpuszczalniki powinny być zakorkowane podczas przygotowywania próbki.
6. Przygotuj dwa typy standardów dla każdego zalecenia.
7. Przygotować kontrolę ujemną składającą się z dodanych wzorców, wszystkie w stałym stężeniu. Jest on dodawany do wszystkich próbek, a także do próbki zbiorczej, która jest używana jako kontrola jakości partii (próbka zbiorcza z wzbogaconymi próbkami używana do monitorowania odtwarzalności przygotowania próbki w oddzielnych dniach) i kontrola jakości instrumentu (wzbogacone próbki zbiorcze wcześniej przygotowane, podporcjowane i używane do monitorowania warunków/wahań przyrządu podczas analizy i w oddzielnych dniach).
   1. Przygotuj kontrole pozytywne przy 1x, 2x i 4x standardowych kolcach. Kontrole dodatnie są dodawane do wszystkich próbek, jak również do zbiorczej próbki osocza i są stosowane jako związki kontroli jakości zarówno na etapach przygotowania próbki, jak i na etapach analizy instrumentalnej w celu analizy i identyfikacji różnic w zmianie krotności podczas analizy danych, aby zapewnić, że wszystkie aspekty przygotowania i analizy instrumentalnej zostały przeprowadzone prawidłowo.
8. Wzorce należy przechowywać w temperaturze -20 °C, a próbki w temperaturze -80 °C. Niektóre wzorce wewnętrzne, które są podatne na degradację w wyniku długotrwałego przechowywania, należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
9. Procedura ta wymaga użycia niebezpiecznych, łatwopalnych lub lotnych rozpuszczalników, takich jak MTBE. Wykonaj wszystkie czynności w dygestorium.

2. Standardy wewnętrzne

1. Wybierz standardy wewnętrzne (ISTD) w oparciu o indywidualne projekty i ich specyficzny projekt eksperymentalny. W przypadku płynów biologicznych, takich jak osocze, BALF lub mocz, idealne byłyby znakowane izotopowo ISTD, które mają podobny charakter do tych występujących biologicznie w tych próbkach. Należą do nich między innymi aminokwasy, hormony lub lipidy. W przypadku próbek metabolomicznych roślin można stosować znakowane wzorce, takie jak flawonoidy lub karotenoidy. To samo dotyczy innych badań metabolomicznych, w których badacz powinien wybrać wzorzec wewnętrzny, który jest reprezentatywny dla rodzaju analizowanej próbki.
2. Upewnij się, że wybrany ISTD obejmuje szeroki zakres chromatogramu; na przykład, jeśli czas akwizycji wynosi 20 minut, można zastosować wzorce, które eluują co 5 minut.
3. Tworzyć hydrofilowe roztwory podstawowe w stężeniu 2 mg/ml przy użyciu różnych wzorców znakowanych izotopowo i/lub innych związków polarnych, które są egzogenne w stosunku do analizowanej próbki. Z każdego roztworu podstawowego utwórz jeden roztwór w stosunku 1:1 metanol:woda ze wszystkimi wzorcami do końcowego stężenia 25 μg/ml kreatyniny-D₃, 100 μg/ml lizyny-D₄ i 200 μg/ml waliny-D₈.
4. Twórz hydrofobowe roztwory podstawowe przy użyciu różnych izotopowo znakowanych wzorców i/lub innych związków niepolarnych, które są egzogenne w stosunku do analizowanej próbki; podstawowe stężenia kwasu tłuszczowego 17:0 (4 mg/ml), kwasu tłuszczowego 19:1 (4 mg/ml), ceramidów 17:0 (2 mg/ml), 17:0 PE (1,75 mg/ml), 15:0 PC (2 mg/ml) i testosteronu-D₂ (1 mg/ml). Z każdego wywaru utwórz jeden roztwór w chloroformie: metanolu 1:1 ze wszystkimi wzorcami do końcowego stężenia 50 μg/ml 17:0 ceramidu, 100 μg/ml 15:0 PC, 100 μg/ml testosteronu-D₂, 200 μg/ml kwasu tłuszczowego 17:0, 200 μg/ml kwasu tłuszczowego 19:1 i 200 μg/ml 17:0 PE w standardowej mieszance.
5. Przetestuj stopień jonizacji każdego wzorca z wyprzedzeniem, używając co najmniej pięciu różnych stężeń dla każdego wzorca, aby określić granicę wykrywalności i liniowość przyrządu dla tych związków. Stężenie roztworu podstawowego dla każdego indywidualnego wzorca będzie się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego, a stężenie każdego wzorca w połączonym wzorcu wzbogaconym może wynosić od 20 μg/ml do 2 mg/ml w zależności od tego, jak dobrze jonizują.
6. Stwórz mieszankę kolców kontroli dodatnich i dodaj je do próbek przy poziomach stężenia 1x, 2x lub 4x, aby monitorować ilościowo moc przygotowania próbki i dokładność danych instrumentalnych. Końcowe stężenie kontroli pozytywnych może wynosić: 2 mg/ml D-glukozy, 100 μg/ml alaniny-D₃, 200 μg/ml kwasu metylomalonowego-D3, 20 μg/ml triglicerydu-D5 i/lub inne wzorce hydrofobowe i hydrofilowe. Dostosuj standardowe stężenia w oparciu o czułość oprzyrządowania MS i HPLC użytego do analizy.

3. Wytrącanie białka

1. Rozmrozić próbki do RT i dodać 10 μl ISTD do każdej próbki, jak opisano poniżej.
2. Do każdej próbki należy dodać 10 μl zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych roztworów wzorcowych (utworzonych z podstaw w krokach 2.3 i 2.4). W razie potrzeby dostosować standardowe stężenia w oparciu o czułość oprzyrządowania MS i HPLC użytego do analizy
   1. Do każdej próbki należy dodać 10 μl 1x, 2x lub 4x roztworu kontroli dodatniej (utworzonego z podstawowego roztworu w kroku 2.6). W razie potrzeby dostosować standardowe stężenia w oparciu o czułość oprzyrządowania MS i HPLC użytego do analizy
   2. Wirować każdą próbkę przez 10 sekund przed etapem wytrącania białka
3. Do każdej próbki dodać 400 μl lodowatego metanolu (przechowywanego w temperaturze -20 °C).
4. Wiruj przez 10 sekund na probówkę.
5. Wirować w temperaturze 0 °C przez 15 minut przy 18 000 x g.
6. Przenieść cały sklarowany sklarent do nowej szklanej probówki hodowlanej, a następnie wysuszyć pod_N2.
7. Analizując frakcję granulek białkowych, przejdź do kroków 3.8-3.11. Jeśli nie analizujesz osadu białka, przejdź do sekcji 4.
   Uwaga: Osad białkowy może zawierać związki o wysokiej hydrofobowości, które byłyby przydatne podczas przeprowadzania badań leków¹⁸, analiz żywności z udziałem flawonoidów hydrofobowych¹⁹ lub badań metabolomicznych związanych z chorobami, w których gromadzą się bardzo hydrofobowe związki, takimi jak ceroidowe lipofuscynozy^{neuronalne 20} i lizosomalne choroby spichrzeniowe^{lipidów 21}.
8. Dodać 1 ml MTBE do białego (lub białawego) granulatu białkowego, wirować przez 30 sekund na probówkę, następnie odwirować w temperaturze 0 °C przez 15 minut przy 18 000 x g. Zdekantować warstwę MTBE do nowej szklanej probówki hodowlanej.
   Jest to krytyczny krok, ponieważ błędy w tym przypadku drastycznie wpłyną na wyniki (patrz wykres 5 w reprezentatywnych wynikach).
   1. Konsekwentnie odsysaj tę samą ilość MTBE dla WSZYSTKICH próbek, ponieważ rozmiar osadu będzie się różnić w zależności od próbki. W związku z tym, jeżeli dla próbki z najmniejszą ilością supernatantu można zdekantować tylko 900 μl, należy zdekantować 900 μl dla wszystkich próbek.
9. Powtórzyć krok 3.9 i połączyć warstwę organiczną z tą samą szklaną probówką hodowlaną przygotowaną w kroku 3.7.
10. Suche próbki za pomocą przepływu_N2 i ponownie zawiesić w 200 μl chloroformu:metanolu w stosunku 1:1. Wiruj krótko.
11. Przenieść do probówki wirówkowej. Wirować w temperaturze 0 °C przez 15 minut przy 18 000 x g, a następnie przenieść supernatant do fiolek z nakrętkami automatycznego podajnika próbek za pomocą szklanych pipet.

4. Ekstrakcja ciecz-ciecz

1. Za pomocą szklanej pipety dodać 3 ml MTBE do wysuszonej pozostałości metanolu (z sekcji 3, krok 6), wirować przez 30 sekund, dodać 750 μl wody, a następnie wirować 10 sekund na probówkę.
2. Wirować ~200 x g przez 10 minut w wirówce w temperaturze pokojowej.
3. Odessać 2,5 ml warstwy MTBE (bez pobierania wody) i przenieść do czystej szklanej probówki hodowlanej.
   Uwaga: Jest to krytyczny krok, ponieważ różnice w tym miejscu wpłyną na wyniki. 2,5 ml MTBE należy ostrożnie zdekantować z wierzchniej warstwy, ponieważ pozwala to na zdekantowanie ustalonej objętości bez pipetowania warstwy wodnej znajdującej się poniżej. Jeżeli objętość próbki na początku doświadczenia była mniejsza niż wskazane dla tej metody 100 μl, należy przeskalować objętość MTBE tak, aby proporcjonalnie odzwierciedlała tę początkową objętość próbki.
4. Dodać 3 ml MTBE do pozostałej części wodnej próbki i wirować 10 sekund na probówkę.
5. Wirować ~200 x g przez 10 minut w wirówce w temperaturze RT.
6. Odessać 3 ml MTBE (bez pobierania wody) i połączyć z probówką MTBE.
7. Pozostałą warstwę wodną zagęścić przez suszenie pod_N2.
8. Zawiesić pozostałość w 100 μl wody.
9. Dodać 400 μl lodowatego MeOH do szklanej probówki hodowlanej, krótko zwirować, a następnie przenieść do probówki mikrowirówkowej.
10. Pozostawić w temperaturze -80 °C na 20-30 min. Wirować w temperaturze 0 °C przez 15 min w temperaturze 18 000 x g.
    Uwaga: Zaleca się umieszczenie całego stojaka na próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C, ponieważ pozwoli to na wytrącenie się pozostałego białka w metanolu. Jeśli zamrażarka o temperaturze -80 °C nie jest dostępna, inne opcje to: przechowywanie w temperaturze -20 °C, umieszczenie próbek na suchym lodzie lub przechowywanie ich w pojemniku na lód. Ważne jest, aby konsekwentnie przechowywać próbki w zimnym środowisku i w tej samej temperaturze, aby umożliwić wytrącanie się.
11. Odessać 450 μl supernatantu i przenieść do czystej probówki do mikrowirówki. Wysuszyć całkowicie w próżniowym koncentratorze odśrodkowym w temperaturze nie wyższej niż 45 °C. (Trwa około 1-2 godzin).
12. Zawiesić wysuszony sklarowany sklarat w 200 μl 5% acetonitrylu/wody. Wiruj krótko. Zamrażać w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja do fazy stałej

1. Wysuszyć frakcję MTBE pod azotem w temperaturze 35 °C przy dobrym przepływie azotu (trwa około 10-15 min).
2. Po całkowitym wyschnięciu zatrzymać przepływ azotu i szybko ponownie zawiesić w 1 ml chloroformu (_{CHCl 3}) za pomocą szklanej pipety. Wir krótko.
   Uwaga: Rozpuszczalniki, takie jak CHCl₃, mają niską lepkość. Podczas pipetowania niskie napięcie powierzchniowe powoduje utratę rozpuszczalnika z pipety. Zaleca się, aby końcówka pipety była wstępnie zwilżona co najmniej dwa razy, aby umożliwić równowagę między pipetowanym rozpuszczalnikiem a przestrzenią w pipecie. Można również użyć gazoszczelnej strzykawki, jeśli jest dostępna.
3. Skonfiguruj kolektor próżniowy SPE i kolumny NH₂ SPE do frakcjonowania.
4. Próbki należy ogrzewać do temperatury regulowanej i zawsze utrzymywać w zawieszeniu pod stałym przepływem_N2. Ogrzewanie do temperatury słonecznej pozwoli na ponowne zawieszenie lipidów, a azot zapobiegnie utlenianiu i polimeryzacji lipidów.
5. Umyj i kondycjonuj wkład SPE 2x z 400 μl heksanu. Wyrzuć odpady i zastąp je nową szklaną rurką zbiorczą.
6. Dodać próbkę do kolumny SPE, zebrać przepływ w szklanych probówkach.
7. Za pomocą szklanej pipety dodać 1 ml 2:1 CHCl₃:IPA, zebrać płyn w tych samych szklanych probówkach (jest to frakcja neutralna).
8. Wysuszyć frakcję obojętną pod_N2, aby zminimalizować utlenianie (trwa około 10-15 minut).
9. Za pomocą szklanej pipety dodać 1 ml 5% kwasu octowego w eterze dietylowym, zebrać przepływ w nowych szklanych probówkach (jest to frakcja kwasów tłuszczowych).
10. Wysuszyć frakcję kwasów tłuszczowych pod_N2, aby zminimalizować utlenianie (trwa około 10-15 minut).
11. Za pomocą plastikowych końcówek dodaj 800 μl metanolu do wkładu SPE i zbierz przepływ w 15 ml plastikowych stożkowych probówkach (jest to frakcja fosfolipidowa).
12. Przenieść frakcję fosfolipidową do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć próbki za pomocą próżniowego koncentratora odśrodkowego w temperaturze 45 °C (trwa to około 1-1,5 godziny).
13. Zawiesić każdą z próbek z trzech frakcji w 200 μl 100% metanolu, wirować i przenieść do fiolki z automatycznym samplerem zakrętki w celu przechowywania.

6. Warunki przechowywania próbki

1. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do analizy instrumentalnej.
   Uwaga: Wyekstrahowane próbki, rozpuszczone w rozpuszczalniku organicznym, mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C. Nie jest to jednak zalecane, ponieważ potencjalne metabolity będące przedmiotem zainteresowania ulegną degradacji w tej temperaturze. Przechowywanie ciekłego azotu również nie jest zalecane, ponieważ badacze zgłaszali problemy z zanieczyszczeniem, potrzebne są specjalne fiolki do przechowywania, a brak jednorodności w komorze powoduje duże wahania temperatury.
2. Jeśli objętość próbki jest mała (<100 μl), należy użyć wkładek do fiolek, aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika w przestrzeni nad roztworem podczas przechowywania.
3. Unikać zamrażania i rozmrażania próbek. Próbki należy rozmrozić tylko raz, tuż przed analizą instrumentu. Powtarzające się zamrażanie i rozmrażanie powoduje degradację próbki.

7. Warunki chromatografii cieczowej

1. Do analizy frakcji hydrofobowej należy użyć kolumny analitycznej C-18 2,1 mm x 50 mm (1,8 μm) z kolumną ochronną C-18 2,1 mm x 12,5 mm (5 μm).
2. Ustaw temperaturę automatycznego podajnika próbek na 4 °C, temperaturę kolumny na 60 °C, objętość wtrysku na 2 μl i szybkość przepływu na 0,25 ml/min.
3. Użyj 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie dla ruchomej fazy A i 0,1% kwasu mrówkowego w izopropanolu: acetonitrylu: wodzie (60:36:4) dla ruchomej fazy B.
4. Uruchom następujący gradientowy profil elucji: Zacznij od 30% B i zwiększ do 70% B od 0 do 1 minuty, następnie zwiększ do 100% B od 1 do 15 minut i przytrzymaj przez 5 minut, a następnie 5 minut mycia 10% B i 5 minut po biegu.
5. Do analizy frakcji hydrofilowej należy użyć kolumny analitycznej HILIC 2,1 mm x 50 mm (2,6 μm) z kolumną ochronną.
6. Ustaw temperaturę automatycznego podajnika próbek na 4 °C, temperaturę kolumny na 20 °C, objętość wtrysku na 2 μl i natężenie przepływu na 0,5 ml/min.
7. Użyj 50% acetonitrylu w 10 mM octanu amonu, pH 5,8 dla fazy ruchomej A i 90% acetonitrylu w 10 mM octanie amonu o pH 5,8 dla fazy ruchomej B.
8. Uruchom następujący gradientowy profil elucji: Zacznij od 100% B od 0 do 2 minut, następnie zmniejsz do 50% B od 2 do 15 minut, a następnie 5 minut mycia 0% B i 10 minut po uruchomieniu.

Wyniki

Cała technika przygotowania próbki została wykonana zgodnie z powyższym opisem, a najważniejsze i/lub istotne aspekty przedstawiono poniżej. Hydrofilowe i hydrofobowe wzorce wewnętrzne zostały wzbogacone w zbiorcze próbki osocza w celu przeprowadzenia bezpośrednich porównań wzorców wewnętrznych i obfitości endogennych metabolitów przy użyciu różnych metod ekstrakcji. Dane z chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) przeanalizowano przy użyciu oprogramowania jakościowego i ilościowego, co zaowocowało doskonałym odzyskiem i separacją zarówno związków endogennych, jak i wzorców wewnętrznych. Rysunek 1 przedstawia skuteczność metody MTBE-SPE w ekstrakcji zarówno wzorców lipidowych (A), jak i związków endogennych (B).

Ogólnie rzecz biorąc, uzyskano lepszą ekstrakcję i pokrycie metabolitów w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekstrakcja metanolem lub ekstrakcja 'tylko MTBE', gdy liczba cech została porównana za pomocą oprogramowania jakościowego i ilościowego po analizie LC-MS. Na przykład, stosując tylko ekstrakcję metanolem, zmienność kreatyniny-D₃ wynosiła 15,2%. Jednak w przypadku LLE MTBE wartość ta została zmniejszona do 1,04% CV. Przy zastosowaniu MTBE odtwarzalność lipidów i związków wodnych wynosiła odpowiednio <8% i <5% w porównaniu z prostszą ekstrakcją metanolem, która skutkowała większą zmiennością odpowiednio 29% i 15% dla lipidów i związków wodnych. Wewnętrzne wzorce stosowane do monitorowania odzysku lipidów – testosteron-D₂, ceramid C17, 15:0 PC i 17:0 PE wzrosły odpowiednio o 26%, 200%, 100%, 400% w porównaniu do stosowania samego metanolu. Podobny wzrost zaobserwowano dla wewnętrznych wzorców kwasów tłuszczowych oraz endogennych metabolitów fosfotydylocholiny i fosfotydyloetanoloaminy. Inne endogenne metabolity, takie jak sfingozyny, ceramidy, diacyloglicerole, triacyloglicerole, cholesterol i sfingomielina, albo nie były wykrywane przy użyciu metanolu, albo były wykrywane w znikomych stężeniach. Jednak te endogenne lipidy można było łatwo wykryć za pomocą ekstrakcji MTBE.

W naszej analizie porównującej standardowe protokoły, uzyskano następujące wyniki: samo wytrącanie metanolu dało 1 851 metabolitów, wytrącanie metanolu i etanolu dało 2 073 metabolity, MTBE z ekstrakcją ciecz-ciecz dało 3 125, a MTBE z ekstrakcją ciecz-ciecz i fazą stałą odzyskało 3 806 metabolitów. W związku z tym podejście to prowadzi do ekstrakcji większej liczby metabolitów, najprawdopodobniej z powodu zmniejszonej supresji jonów i czystszych próbek przed LC-MS.

Rysunek 2 pokazuje skuteczność w rozdzielaniu hydrofobowych metabolitów na odpowiednie klasy chemiczne dla pewniejszej identyfikacji metabolitów. Związki zidentyfikowane w trzech frakcjach lipidowych po SPE w minimalnym stopniu się pokrywają. Na poparcie tego wykresu 3 przedstawiono odzyskiwanie wzorców wewnętrznych, co pokazuje, że ISTD zostały wymyte we frakcji odpowiadającej ich klasie chemicznej.

Próbki kontroli jakości są używane do oceny jakości przygotowania próbki, do określenia efektów partii, gdy wymagane są wielodniowe analizy dla dużego zestawu próbek, oraz do monitorowania odtwarzalności instrumentu. Chromatogramy są badane w celu zapewnienia, że wzbogacone wzorce są odzyskiwane w ponad 90% z błędem masy mniejszym niż ± 3 ppm i oknem czasu retencji mniejszym niż ±5%. Jeżeli kryteria te nie są spełnione, wyniki są odrzucane, a próbki są ponownie analizowane. W przypadku efektów wsadowych, w wyniku których obserwuje się zmianę retencji dla jednej partii, oprogramowanie do analizy danych może to skorygować. Wcześniej przygotowana partia zbiorczych próbek osocza została poddana przygotowaniu próbki. Frakcje zostały następnie podporcjowane do fiolek z automatycznym samplerem i przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w warunkach urządzenia monitorującego podczas każdej analizy próbki. Tabela 1 przedstawia wyniki tych norm skokowych. Frakcja w trybie jonizacji ujemnej kwasów tłuszczowych (dane nie pokazane w tabeli) nie została wykorzystana do analizy, ponieważ % CV wzorców skokowych dla próbki QC było większe niż 10%. W związku z tym zbiór danych dla tej frakcji został odrzucony, a instrument poddany kontroli i konserwacji. Tabela 2 przedstawia wyniki dotyczące endogennych metabolitów w próbkach po trzech różnych dniach przygotowania próbki i trzykrotnego wstrzyknięcia narzędzia. Wszystkie endogenne metabolity w próbkach kontroli jakości preparatu próbki są powtarzalne, co oznacza siłę przygotowania próbki, jak również odtwarzalność iniekcji instrumentu.

Gdy jednak kroki przygotowania próbki nie są prawidłowo przestrzegane, uzyskuje się niewiarygodne i niespójne wyniki. Rysunek 4 przedstawia wyniki, w przypadku gdy etap wytrącania białka w ramach metody nie jest przestrzegany zgodnie z opisem. Trzej operatorzy, A, B i C, przeprowadzili tę samą procedurę przygotowania próbki na zbiorczych próbkach osocza. Operator A, zamiast pipetować wymaganą ilość supernatantu zgodnie z protokołem doświadczalnym, zamiast tego pipetował >1 ml dla obu płukań z częścią osadu. Spowodowało to nie tylko większą liczbę wyników fałszywie dodatnich dla tej frakcji, ale także zwiększyło zmienność danych.

Chromatograficzną powtarzalność danych można zobaczyć na rysunku 7. Zbiorcze próbki osocza przygotowywano w trzech egzemplarzach w oddzielnych dniach, stosując wytrącanie białek, ekstrakcję ciecz-ciecz i ekstrakcję do fazy stałej, jak opisano w niniejszym protokole. Każda frakcja była analizowana przy użyciu separacji chromatograficznej opisanej w punkcie 7 protokołu. Próbki zostały następnie wstrzyknięte w trzech egzemplarzach na LC-MS w celu oceny odtwarzalności instrumentu i przygotowania próbki. To konsekwentne nakładanie się na siebie świadczy zarówno o sile odtwarzalności preparatu próbki przygotowanej w trzech różnych dniach, jak i o sile metody chromatograficznej w uzyskiwaniu powtarzalnych wyników. Obserwuje się wzrost szumu chemicznego dla ujemnego trybu jonizacji frakcji kwasów tłuszczowych. Może się to zdarzyć z powodu zanieczyszczeń w rozpuszczalnikach LC-MS i może skutkować niespójnymi ilościowymi wynikami metabolomicznymi. W związku z tym analizowano tylko metabolity, które zostały wymyte przed 9 min.

Podczas wykonywania długich list roboczych, z czasem może dojść do utraty czułości instrumentu i zmiany w stężeniach, co skutkuje zmniejszeniem intensywności sygnału i przesunięciem czasu retencji. Jeśli zmienność nakładania się czasu przechowywania jest mniejsza niż 5%, a zmiana intensywności sygnału jest mniejsza niż 10%, dane nadal mieszczą się w standardowych granicach laboratoryjnych. Oprogramowanie analityczne może być używane do wyrównywania i normalizacji danych w celu skorygowania dryfu czasu przyrządu i retencji. Jeśli jednak różnica jest duża, należy ustalić przyczynę. Po usunięciu tych objawów próbki można poddać ponownej analizie.

Rysunek 1. Obfitość lipidowych ISTD (A) i endogennych metabolitów (B) po ekstrakcji i chromatografii z odwróconymi fazami (RPC)¹². Przeprowadzono ekstrakcję, a otrzymane próbki oddzielono za pomocą RPC i przeanalizowano za pomocą LC-MS w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Yang i wsp., Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Rysunek 2. Porównanie frakcji MTBE-SPE¹². Metabolity zidentyfikowane w każdej frakcji porównano w celu określenia stopnia nakładania się podczas części SPE przygotowania. Liczby na diagramie Venna odzwierciedlają liczbę metabolitów wykrytych w każdej frakcji. W tym przypadku obserwuje się niewielkie nakładanie się trzech frakcji, co oznacza udaną ekstrakcję związku i separację klas metabolitów na etapie SPE. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Yang i wsp., Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Rysunek 3. Odzysk ISTD we frakcjach przy użyciu metody MTBE-SPE¹². Przeprowadzono ekstrakcję, a otrzymane próbki oddzielono za pomocą RPC i przeanalizowano za pomocą LCMS w trybie dodatnim i ujemnym, jak opisano w tekście. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Yang i wsp., Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Rysunek 4. Wyniki z frakcji granulek przygotowanej przez trzech operatorów. Trzej operatorzy przygotowania próbek A, B i C wykonali ten sam etap przygotowania białka na zbiorczych próbkach osocza. Liczby na diagramie Venna odzwierciedlają liczbę metabolitów wykrytych przez każdy operator. Operatorzy B i C pipetowali wymaganą objętość zgodnie z protokołem przygotowania próbki, podczas gdy operator A pipetował cały supernatant i część osadu, w wyniku czego uzyskano ponad 500 dodatkowych metabolitów, z których większość była fałszywie dodatnia dla tej konkretnej frakcji.

Rysunek 5. Tworzenie się osadu białkowego podczas etapu wytrącania białka. A) 100 μl osocza ludzkiego przed przygotowaniem próbki; B) osocze po dodaniu metanolu chłodnego jak lód; (C) osad białkowy utworzony na dnie probówki po odwirowaniu w temperaturze 0 °C przez 15 minut w temperaturze 18 000 x g.

Rysunek 6. Separacja warstw hydrofilowych i hydrofobowych podczas etapu ekstrakcji ciecz-ciecz (LLE). Rozpuszczalnik organiczny eter metylowo-tert-butylowy (MTBE) i woda zostały użyte do oddzielenia metabolitów hydrofilowych i hydrofobowych. Warstwa MTBE rozpuściła związki niepolarne, a warstwa wody rozpuściła związki polarne. A) supernatant osocza po usunięciu białka; B) osocze po wysuszeniu w azocie; C) osocza po dodaniu MTBE; (D) dodanie wody do osocza i MTBE; E) Warstwa MTBE-woda utworzona po odwirowaniu; (F) usunięcie wierzchniej warstwy MTBE; (G) głównie warstwa hydrofilowa pozostała po usunięciu MTBE.

Rysunek 7. Chromatogramy frakcji z wybranego zbioru danych. Przygotowanie próbki przeprowadzono na trzech oddzielnych zbiorczych próbkach kontroli jakości osocza, a każdą próbkę wstrzyknięto w trzech egzemplarzach na urządzeniu LC-MS. Przedstawiono chromatogramy jonów całkowitych próbek osocza uzyskanych przy użyciu parametrów LC-MS wskazanych w sekcji 7 protokołu metody. Chromatograficzna reprezentacja innych płynów biologicznych będzie się różnić ze względu na różnice w składzie metabolitów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. . .

Ułamek	Tryb jonizacji	Standard wewnętrzny	n	Średnia powierzchnia szczytu	Powierzchnia szczytu % CV
Wodny	Plus	Kreatynina-D3	Rozdział 31	2217311	3,8 proc.
Neutralny lipid	Plus	Trójgliceryd-D5	Rozdział 31	4837032	9,9 proc
		C17 Ceramid	Rozdział 31	12736707	7,9 proc
Fosfolipid	Plus	Komputer PC 15:0	Rozdział 32	1248929	9,3 proc.
		17:0 PE	Rozdział 32	517234	7,9 proc

Tabela 1. Kontrola jakości wynika z podwyższonych standardów wewnętrznych. Zbiorcze próbki osocza z zestawu danych mysiego modelu rozedmy płuc zostały przeanalizowane w celu codziennego monitorowania warunków urządzenia w tym wielotygodniowym badaniu. Do wyznaczenia obszarów pików wzorców wewnętrznych wykorzystano oprogramowanie do analizy ilościowej (n = liczba wstrzyknięć QC instrumentu).

. . . . .

Ułamek	Tryb jonizacji	Metabolity endogenne	Średnia powierzchnia szczytu	Powierzchnia szczytu % CV
Wodny	Plus	kreatynina	2554574	2,3%
		walina	3712151	3,3 proc
		glukoza	2669190	6,9 %
Neutralny lipid	Plus	3-Dehydrosfinganina	226644	3,9 proc.
		DG(16:0/16:1/0:0)	Numer katalogowy: 11301	8,2 proc
		DG(P-14:0/18:1)	364119	1,9 proc
Fosfolipid	Plus	Komputer PC(24:0/0:0)	Numer katalogowy: 27599	0,9 %
		PC16:0/22:6)	2873326	4,5 proc.
		PI(16:0/18:1)	112998	4,4 proc.
Kwas tłuszczowy	Plus	Kwas 10-okso-5,8-dekadienowy	1363284	2,3%
		Kwas 16-okso-heptadekanowy	Numer katalogowy: 83700	2,9 proc
		Kwas 2-metylowo-walerianowy	285782	5,7 proc.
Kwas tłuszczowy	Minus	Kwas 10-hydroksy-8-oktadecenowy	Numer katalogowy 10042	4,9 proc.
		Kwas (R)-laballenowy	173929	6,5 proc
		Kwas 2-ketowalerianowy	Numer katalogowy: 35488	6,0 %

Tabela 2. Wyniki kontroli jakości dotyczące metabolitów endogennych. Zbiorcze próbki osocza ze zbioru danych dotyczących chorób u ludzi przeanalizowano w celu monitorowania odtwarzalności przygotowania próbki w różnych dniach. Próbki przygotowywano w trzech egzemplarzach przez trzy dni (n = 9 wstrzyknięć QC w celu przygotowania preparatu).

Dyskusja

Jednym z celów klinicznych badań metabolomicznych jest identyfikacja zmian w metabolomie związanych z chorobą lub leczeniem. W związku z tym techniki przygotowywania próbek muszą być solidne, spójne i możliwe do przeniesienia z technika na technika i z laboratorium^{do laboratorium 22}. Uzyskane dane muszą być reprezentatywne dla próby, a zidentyfikowane zmiany muszą odzwierciedlać zestaw próbek, a nie błędy w przygotowaniu próbki. Dlatego konieczne jest dokładne pipetowanie, właściwa temperatura, skuteczne dekantowanie niemieszających się warstw, suszenie w atmosferze azotu oraz stosowanie naczyń szklanych i końcówek tych samych marek i rozmiarów.

Na etapie wytrącania białka ważne jest, aby z każdej granulki zdekantować taką samą ilość roztworu. Zmniejsza to zmienność objętości, a tym samym zmniejsza zmienność danych próbki. Ten etap wytrącania białek jest niezbędny do badań metabolomicznych i nie można go pominąć, ponieważ usuwa białko z próbek przed analizą profilowania małych cząsteczek na spektrometrze mas. Eliminuje patogeny i duże makrocząsteczki oraz uwalnia związane metabolity z białek⁷. Brak akumulacji białek w próbkach wydłuża żywotność kolumny HPLC oraz zwiększa dokładność i jakość wyników. Rysunek 5 przedstawia osad białkowy powstały podczas wykonywania tej techniki na próbkach osocza. Pozwala to na wykrycie małych cząsteczek, zwiększa obfitość jonów i zmniejsza efekty matrycy białek w próbce. Ponadto, ponieważ zakłada się, że wszystkie białka są usuwane na tym etapie, aminokwasy wykryte podczas analizy LC-MS pochodziłyby ze zmian metabolicznych, a nie z rozpadu białek.

Etap ekstrakcji ciecz-ciecz ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozdziela metabolity hydrofilowe i hydrofobowe na dwie niemieszające się warstwy. Rysunek 6 przedstawia procedurę LLE i reprezentację warstwy LLE. Niewłaściwe rozdzielenie dwóch warstw powoduje utratę metabolitów lub ich elucję w obu frakcjach. Staranne zastosowanie tego kroku zmniejsza ilość związków hydrofilowych, które pojawiają się we frakcji hydrofobowej. Wyniki dla tych związków stają się niewiarygodne, ponieważ nie można określić, która frakcja zawiera reprezentatywne wyniki. Przy prawidłowym wykonaniu nakładanie się metabolitów jest zmniejszone.

Aby zapobiec degradacji oksydacyjnej, szczególnie w lipidach, ale także w małych cząsteczkach, które mogą zawierać na przykład grupy tiolowe, narażenie na tlen musi być ograniczone do minimum. Dlatego procedura ta jest zawsze wykonywana w atmosferze azotu, aby zmniejszyć/zapobiec utlenianiu związków zawierających lipidy lub tiol. Ponadto przenoszenie próbki i/lub roztworu jest szybkie (w ciągu pierwszej minuty) w celu zmniejszenia narażenia na tlen, a następnie próbki są szybko umieszczane pod stałym strumieniem azotu w celu wyschnięcia. Po wysuszeniu są one natychmiast ponownie zawieszane w 100% metanolu z wyżej omówionych powodów.

Laboratoria mogą czerpać korzyści z tej kompleksowej metody na wiele sposobów; Naukowcy, którzy chcą wyizolować jedną klasę związków, mogą wybrać tę część metody, która najlepiej odpowiada ich potrzebom. Ci, którzy chcą przeprowadzić jedynie wytrącanie białek w celu uzyskania puli metabolitów, mogą to zrobić. Jeśli pożądane są metabolity hydrofilowe, takie jak wiele leków farmaceutycznych, aminokwasów i cukrów, lub jeśli pożądane są tylko metabolity hydrofobowe, takie jak na przykład trójglicerydy, epoksydy, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i fosfolipidy, naukowcy mogą przeprowadzić etap ekstrakcji ciecz-ciecz po wytrąceniu białka i odrzucić niepożądaną frakcję. Badacze, którzy wymagają dalszej podklasyfikacji związków hydrofobowych (obojętne lipidy, kwasy tłuszczowe i fosfolipidy), mogą przejść do etapu frakcjonowania.

Kwestie związane z przechowywaniem są ważne dla utrzymania żywotności próbek do późniejszej analizy. Jeśli próbki są przechowywane nieprawidłowo, może dojść do degradacji lub rozkładu. Idealnie byłoby, gdyby próbki były przechowywane w zakręcanych bursztynowych fiolkach z dala od światła, aby zapobiec degradacji gatunków wrażliwych na światło. Próbki należy również przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80°C, aby zapobiec degradacji metabolitów^23-25. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo omówione, próbki są zawsze przechowywane w temperaturze 4°C na tacy automatycznego podajnika próbek podczas analizy LC-MS. Gwarantuje to, że wszystkie próbki są utrzymywane w stałej temperaturze, a zmiany temperatury otoczenia nie wpływają na lepkość, rozpuszczalność ani stabilność próbek. Zaleca się ćwiczenie manualnych aspektów tej procedury, takich jak LLE i SPE, w celu uzyskania pewności i komfortu związanych z wykonywanymi krokami.

Istnieje kilka ograniczeń dotyczących tej techniki. Dyskretne oddzielenie metabolitów hydrofobowych i hydrofilowych nie jest gwarantowane, ponieważ niektóre związki z natury dzielą się na obie frakcje ze względu na ich skład chemiczny i stan naładowania. Ponadto, jak pokazano na rysunku 4, niewłaściwa technika na etapie ekstrakcji osadów białkowych może skutkować słabą odtwarzalnością metabolitów zarówno w próbkach, jak i podczas kontroli jakości. Ma to wpływ na statystyki, zwłaszcza w przypadku małych zbiorów danych, ponieważ moc statystyczna nie jest dostępna. Dlatego tak ważne jest, aby ten etap był wykonywany dokładnie tak samo za każdym razem dla każdej próbki. Kolejnym ograniczeniem jest czas. Chociaż w całym protokole znajdują się punkty zatrzymania, w których próbki mogą być zamrożone, a przygotowanie kontynuowane następnego dnia, należy przeznaczyć cały dzień na wykonanie tej procedury. Po trzecie, nie każdy związek w próbce biologicznej może być oceniany pod kątem supresji jonów. Ponieważ nie jest możliwe określenie, w jaki sposób matryca wpływa na każdy pojedynczy metabolit, obecną opcją jest ocena wewnętrznych wzorców, które teoretycznie naśladują niektóre klasy endogennych metabolitów. Wreszcie, identyfikacja bezwzględna nie może być przeprowadzona wyłącznie za pomocą tej metody. Tandem MS we współpracy z przeszukiwaniem baz danych i wzorcami jest niezbędny do bezwzględnej identyfikacji metabolitów.

Ważną częścią metabolomiki jest identyfikacja związków. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo omówione, próbki kontroli jakości analizowano za pomocą LC-MS. Przygotowano wiele ślepych prób do przygotowania i ślepych prób instrumentalnych do wykorzystania jako odejmowanie tła w celu zmniejszenia odsetka wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniami, co dało bardziej wiarygodne trafienia metabolitów. Po tym kroku liczba "cech molekularnych" została pogrupowana w oparciu o m/z, czas retencji, stosunek izotopów i addukty, aby stworzyć listę rzeczywistych związków. Chociaż lista związków została znacznie zmniejszona, wyniki były bardziej wiarygodne, ponieważ nie opierały się na wielu adduktach z tego samego związku. Pełna metoda jest kompleksowa i pozwala na izolację metabolitów hydrofobowych, takich jak obojętne lipidy, fosfolipidy, kwasy tłuszczowe, trójglicerydy i steroidy, przy jednoczesnym wyizolowaniu klas hydrofilowych we frakcji wodnej, z których zidentyfikowano eikozanoidy, cukry, flawonoidy i aminokwasy^12,26.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitryl	Fisher Scientific	A955-4
Metanol	Fisher Scientific	L-6815
Chloroform	Fisher Scientific	C606-1
Hexane	Sigma Aldrich	34859
Kwas octowy	Sigma Aldrich	49199-50ML-F
Eter metylowy tert-butylowy	J.T. Baker	9042-03
Alkohol izopropylowy	Sigma Aldrich	34965-2.5L
	Woda Honeywell Burdick Jackson	365-4
System grzewczy OA-SYS	Organomation Associates, Inc		Służy do utrzymywania próbek pod stałym przepływem azotu w temperaturze 35 ° C
12-pozycyjny rozdzielacz próżniowy	Phenomenex
Strata NH2 (55 µ M, 70Å ;) Wkłady SPE 100 mg/ml	Phenomenex	8B-S009-EAK
Szklane końcówki do pipet	Fisher Scientific	13-678-20C	Służy do przenoszenia próbki do kolumny SPE
Plastikowe końcówki do pipet	USA Scientific	1182-1830	Używane, gdy szklane końcówki nie są potrzebne
Probówki do mikrowirówek	Fisher Scientific	02-681-320
Pipety szklane z podziałką	Fisher Naukowy	13-678-27B	Służy do przenoszenia rozpuszczalników organicznych podczas przygotowywania próbek
Probówki hodowlane ze szkła pyrexowego	Corning Incorporated	99499-16X	Służy do przechowywania frakcji wodnych i lipidowych do następnego kroku
Fiolki z automatycznym podajnikiem próbek	Agilent Technologies	5182-0545
Fiolki zatrzaskowe do fiolek z automatycznym samplerem	Agilent Technologies	5182-0541
Szkło wkładki	Agilent Technologies	5183-2085	Używane do małych objętości próbek
Oprogramowanie do analizy jakościowej Mass Hunter	Agilent Technologies	Wersja B.06.00	Służy do monitorowania czasów retencji i krzywych ciśnienia
Oprogramowanie do analizy ilościowej Mass Hunter	Agilent	Technologies Wersja B.05.02	Służy do analizy danych kontroli jakości i próbek
Mass Profiler Professional oprogramowanie	Agilent Technologies	Wersja B.12.50	Służy do określania statystyk, zmian fałdowania i identyfikacji metabolitów