Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

Podsumowanie

Zrozumienie neuronalnych substratów zachowania wymaga nagrania zespołu obwodów mózgowych. Ze względu na swoją podatność genetyczną, mysz oferuje model do rozwarstwiania obwodów i mimikry choroby. W tym miejscu opisano metodę projektowania i wytwarzania zminiaturyzowanych sond, która jest odpowiednia do celowania w głęboką strukturę mózgu u myszy.

Streszczenie

Liczba badań fizjologicznych u myszy, mus musculus, ostatnio wzrosła, równolegle z rozwojem metod genetycznego celowania w preparację mikroukładów i modelowanie chorób. Na przykład wprowadzenie optogenetyki pozwoliło na dwukierunkową manipulację genetycznie zidentyfikowanymi neuronami, w niespotykanej dotąd rozdzielczości czasowej. Aby wykorzystać te narzędzia i uzyskać wgląd w dynamiczne interakcje między mikroobwodami mózgu, niezbędna jest możliwość nagrywania z zespołów neuronów głęboko w mózgu tego małego gryzonia, zarówno w preparatach zaciśniętych na głowie, jak i swobodnie zachowujących się. Nagrywanie z głębokich struktur i odrębnych warstw komórek wymaga przygotowania, które umożliwia precyzyjny postęp elektrod w kierunku pożądanych obszarów mózgu. Aby rejestrować zespoły neuronowe, konieczne jest, aby każda elektroda była niezależnie ruchoma, co pozwala eksperymentatorowi na rozdzielenie pojedynczych komórek, pozostawiając sąsiednie elektrody niezakłócone. Aby zrobić jedno i drugie w swobodnie zachowującej się myszy, potrzebny jest napęd elektrod, który jest lekki, wytrzymały i wysoce konfigurowalny do celowania w określone struktury mózgu.

Przedstawiono technikę projektowania i wytwarzania miniaturowych, ultralekkich, mikronapędowych układów elektrod, które można indywidualnie dostosować i łatwo złożyć z dostępnych na rynku części. Urządzenia te są łatwo skalowalne i można je dostosować do docelowej struktury; Jest z powodzeniem stosowany do nagrywania z obszarów wzgórza i kory mózgowej u swobodnie zachowującego się zwierzęcia podczas naturalnego zachowania.

Wprowadzenie

Mus musculus, ze względu na swoją genetyczną podatność, szybko stał się modelem zwierzęcym wybieranym przez fizjologów zainteresowanych mikroanalizą genetycznie zidentyfikowanych neuronów oraz badaniem mysich modeli chorób ludzkich. Na przykład, niedawne wprowadzenie przyczynowych narzędzi genetycznych, takich jak optogenetyczne i chemiczne aktywatory genetyczne, pozwoliło eksperymentatorom przetestować konieczność i wystarczalność zidentyfikowanych obwodów neuronalnych w zachowaniu^1-4. Szeroka dostępność rekombinowanych transgenicznych linii sterujących myszy (Cre-lines) wzmocniła eksperymentalną łatwość, z jaką celowane są podtypy neuronów, zwiększając wartość myszy w tych eksperymentach.

Podobnie, genetyczne badania przesiewowe i powiązania powszechnych zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych w całym genomie ułatwiły identyfikację genetycznych czynników ryzyka chorób mózgu^6,7. Postępy te, w połączeniu z rosnącym zestawem narzędzi do manipulacji genetycznych i inżynierii genomu u myszy, sprawiły, że jest to organizm z wyboru do modelowania chorób ludzkich. Połączenie modeli chorób i narzędzi genetyki przyczynowej daje bezprecedensową możliwość zrozumienia chorób mózgu i zidentyfikowania celów interwencji na poziomie obwodu.

Aby w pełni wykorzystać te molekularne narzędzia i uzyskać wgląd w funkcje mikroukładów w zdrowiu i chorobie, konieczne jest połączenie ich z fizjologicznymi odczytami aktywności mózgu. Idealnie byłoby, gdyby eksperymentator był w stanie monitorować dużą liczbę neuronów przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości pojedynczej komórki. Taką możliwość dają zewnątrzkomórkowe, wieloelektrodowe nagrania u swobodnie zachowujących się zwierząt; Jednak zastosowanie tej technologii w myszy zostało ograniczone. Do rejestracji z małych celów (np. warstwy CA1 w hipokampie) konieczne jest użycie elektrod regulowanych, ponieważ niewielkie ruchy elektrod rejestrujących po implantacji chirurgicznej uniemożliwiają utrzymanie stabilności zapisu^8,9. Tradycyjnie, metody, które zostały zastosowane do przesuwania elektrod w mózgu, nakładają ograniczenia masy, gdy są stosowane u myszy, co utrudnia powiązanie rejestracji dużej liczby neuronów z zachowaniem w tym organizmie.

Tutaj wprowadzane są metody wytwarzania miniaturowych, ultralekkich układów mikroelektrod, które są indywidualnie dostosowywane do docelowego obszaru mózgu, kompatybilne z optogenetyką i łatwe do złożenia z dostępnych na rynku części. Każdy "mikronapęd" w wieloelektrodowym "hipernapędzie" wykorzystuje mechanizm sprężynowo-śrubowy do przesuwania elektrody oraz plastikową szynę, wbudowaną w korpus hipernapędu, aby przeciwdziałać momentowi obrotowemu ze. Po pierwsze, opisano proces projektowania korpusów hipernapędów i mikronapędów w programie CAD do druku 3D. Projektując korpusy hipernapędów, które są dostosowane do konkretnych struktur, możliwe jest zwiększenie precyzji celowania i dalsze zwiększenie wydajności preparatu. Po drugie, szczegółowo opisano proces produkcji, w którym układ wieloelektrodowy jest montowany ręcznie z części, które są dostępne na rynku. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do nagrywania z zespołów neuronów w hipokampie, wzgórzu i korze mózgowej u swobodnie zachowującego się zwierzęcia podczas naturalnych zadań związanych z żerowaniem i operacjami.

Protokół

1. Założenia projektowe

1. Zidentyfikuj wybrany obszar mózgu (jądro kolankowate boczne (LGN, wzgórze wzrokowe)) przewijając sekcje strzałkowe elektronicznego atlasu mózgu myszy.
2. Przy współrzędnych A/P (-2,3 – -2,7 mm) LGN jest najszerszy. Użyj tego regionu, aby zaprojektować spód dysku (dolne części).
   UWAGA: Do celowania w LGN można użyć łącznie 8 niezależnie ruchomych elektrod (4-6 elektrod dotrze do LGN, 2-4 elektrody są dodawane w celu zrównoważenia błędów implantacji, rysunek 1A).
3. W Solidworks narysuj szkic bryły projektu (Rysunek 1B) w płaszczyźnie czołowej. Kliknij szkic, a następnie użyj kombinacji linii i krzywych, aby narysować szkic, który będzie zawierał kontury podstawy napędu, uchwytów i półszczelin z poliamidu, jak pokazano. Upewnij się, że kontur nie zawiera żadnych otwartych przerw. Następnie kliknij przycisk Wyjdź ze szkicu.
4. Następnie wybierz zarówno przednią, jak i prawą płaszczyznę i kliknij "Utwórz oś". Następnie utwórz model bryły projektu 3D, obracając podświetlony niebieski kontur szkicu (Rysunek 1B) o 360°. W menu funkcji kliknij "Revolving Boss/Base". Wybierz linię środkową jako oś obrotu. W sekcji parametrów w obszarze kierunek 1 kliknij opcję Żaluzja, a w polu kąt wybierz 360,00 stopni. W sekcji wybrane kontury upewnij się, że zaznaczony na niebiesko kontur jest zaznaczony.
5. Utwórz jedną półszczelinę poliimidową, obracając podświetlone na czerwono kontury o 13° (Rysunek 1C, u góry po lewej). Kroki są identyczne jak w punkcie 1.4 powyżej, z wyjątkiem specyfikacji kąta
6. Utwórz jeden uchwyt napędu, obracając zielony kontur o 15° (Rysunek 1C, prawy górny róg).
7. Utwórz drugi uchwyt napędu za pomocą funkcji kołowego wzoru (Rysunek 1C, na dole po lewej). W menu funkcji kliknij "Okrągły wzór". W parametrach wybierz linię środkową jako oś obrotu. Wybierz 180,00 stopni jako kąt i 2 jako liczbę wystąpień. Upewnij się, że pierwszy uchwyt jest wybrany w sekcji "Cechy do wzorca".
8. Utwórz szesnaście półszczelin poliimidowych za pomocą funkcji wzoru kołowego (Rysunek 1C, na dole po lewej). Wykonuj ruchy podobne do 1.7, ale wybierz pierwszą półszczelinę poliimidową jako "Cechy do wzoru". Kąt wynosi 22,5°, a liczba wystąpień wynosi 16 (Uwaga: jest to tylko 360° podzielone przez liczbę przypadków, w których chcesz utworzyć wzór obiektu)
9. Utwórz nową płaszczyznę, na której narysujesz pojemnik poliimidowy. Aby to osiągnąć, kliknij "wstaw" w menu głównym. Kliknij "Geometria odniesienia", wybierz dwie strony półszczelin poliimidowych, a następnie kliknij "Utwórz nową płaszczyznę"; (Rysunek 1D, góra)
10. Utwórz gniazdo mikronapędu (otwór na, otwór poliimidowy i szyna zapobiegająca momentowi obrotowemu (Rysunek 1D, na dole). Osiągnij to, tworząc szkic, który obejmuje wszystkie te elementy na nowej płaszczyźnie utworzonej w wersji 1.9. Należy pamiętać, że w przypadku szyn zapobiegających momentowi obrotowemu należy zdefiniować linię środkową między dwiema stronami górnych szczelin z poliamidu. Następnie narysuj szyny zapobiegające momentowi obrotowemu, tworząc dwa okręgi prostopadłe do linii środkowej, których środki są oddalone od siebie o 1 promień, a następnie przycinając środkowy kontur.
11. W menu Funkcje kliknij "Extrude Boss/Base", aby utworzyć szynę antymomentową i wybrać wytłoczenie nieprzelotowe o szerokości 10 mm w górę i 2 mm w dół. W przypadku otworu na i otworu poliamidowego kliknij "Cięcie wytłaczające" i wybierz ślepe 6 mm i kilka mm idących w górę dla obu (Rysunek 1E, po lewej).
12. Ułóż gniazdo mikronapędu 16x, używając środka jako osi obrotu (22,5°, 16 instancji, równe odstępy), (Rysunek 1E, po prawej)
13. Na górze uchwytu narysuj pudełko o wymiarach 3 mm x 3 mm, zaczynając od środkowej końcówki uchwytu napędu, skierowanego w stronę osi środkowej. Wyciągnij to 2 mm w górę za pomocą funkcji "Extrude Boss". Narysuj okręgi o średnicy 1 mm w miejscach, w których będą wchodzić EIB. Następnie wykonaj 1,5 mm "Extrude Cut", aby zrobić otwór. Następnie ułóż ramkę i otwór dwukrotnie, korzystając z funkcji Wzór kołowy (nakładka tekstowa: 180°, 2 instancje, równy odstęp, wokół osi środkowej).
14. Użyj wymiarów (w milimetrach) na rysunku 1F, aby narysować szkic górnego elementu. Użyj opcji "Extrude Boss/Base", aby stworzyć model 3D.
    UWAGA: Po wykonaniu tych czynności projekt napędu jest gotowy. Fizyczny korpus dysku jest tworzony w procesie stereolitografii. Istnieje wiele firm, które oferują druk stereolitograficzny na podstawie plików STL. Polecamy usługi, które mogą drukować w twardym plastiku (takie jak Accura® 55), o minimalnej rozdzielczości co najmniej 0,1 mm.

2. Przygotowanie komponentów hipernapędu

1. Rozłóż mały kawałek taśmy dwustronnej na płaskiej powierzchni i przytnij niezbędną liczbę rurek poliimidowych 31 G na około 8 centymetrów (ID/OD:.0071''/.0116''; Ściana: .00225) (Rysunki 2A - 2B).
2. Ułóż pierwszą warstwę rur prowadzących na taśmie dwustronnej, uważając, aby rurki prowadzące były umieszczone jak najbliżej siebie na taśmie. Nanieś niewielką ilość cienkiego kleju cyjanoakrylowego na warstwę poliimidów. (Rysunek 2C)
3. Szybko ułóż drugą warstwę poliimidów (rysunek 2D).
4. Utwórz symbol zastępczy światłowodu za pomocą kaniuli 26 G. Upewnij się, że jest on nasmarowany smarem na bazie teflonu przed włączeniem go do zespołu (Rysunek 2E).
5. Nałożyć linię żywicy epoksydowej o długości 4-5 mm prostopadłą do wiązki poliimidu (rysunek 2F). Gdy żywica epoksydowa stwardnieje (2-3 godziny), usuń taśmę z dolnej warstwy i ponownie zaimpregnuj żywicę epoksydową po drugiej stronie. Po ponownym stwardnieniu żywicy epoksydowej można usunąć kaniulę 26 G i przeciąć konstrukcję w środku za pomocą żyletki (ryc. 2G), w wyniku czego powstają dwie matryce poliimidowe, z których każda może być użyta do jednego hipernapędu (ryc. 2H).
6. Wydrukuj szablon stożka na arkuszu przezroczystego papieru i wytnij odpowiedni arkusz wytrzymałej folii aluminiowej (rysunki 3A - 3C).
7. Nałóż warstwę żywicy epoksydowej na folię aluminiową i szybko nałóż przezroczysty papier. Za pomocą ciężkiego przedmiotu lub drewnianego kołka wygładź żywicę epoksydową, aby była równomiernie rozprowadzona (Rysunek 3D).
8. Wytnij szablon stożka i zaciśnij razem za pomocą zacisku krokodylkowego. Na koniec użyj kolejnej dawki żywicy epoksydowej, aby trwale przymocować kawałki (Rysunek 3E).

3. Końcowy montaż mikronapędu

1. Przymocuj EIB do korpusu napędu i ponownie włóż kaniulę 26 G przez matrycę rurki prowadzącej z poliimidu. Dopasuj matrycę poliimidową do korpusu napędu za pomocą otworu światłowodowego w EIB, aby upewnić się, że rury prowadzące są prostopadłe do EIB, a matryca epoksydowa do korpusu napędu, uważając, aby żadna żywica epoksydowa nie dostała się do rur prowadzących lub do korpusu napędu (rysunki 4A - 4C).
2. Przyporządkuj każdą rurkę prowadzącą w matrycy poliimidowej do odpowiedniego wspornika na wewnętrznej ścianie korpusu napędu. Nasuń mały pierścień z poliimidu 33 G na każdą rurkę prowadzącą i do wspornika i nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować każdą rurkę prowadzącą. (Rysunki 4D - 4E) Na koniec należy przyłożyć cały aparat do wewnętrznej ścianki korpusu napędu i przyciąć poliimidy tak, aby wystawały tuż nad wewnętrzną wargę (rysunki 4F - 4G).
3. Zbuduj zespół mikronapędu, wkładając jedną z niestandardowych przez środkowy otwór górnego elementu, a następnie jedną ze sprężyn 5 mm. Nasuń zewnętrzny otwór górnej części na jedną z szyn i delikatnie wkręć. Wkręć, aż sprężyna osiągnie minimalną długość ściśniętą. (Rysunki 4H - 4I) Powtórz ten proces dla każdej szyny/mikronapędu (Rysunek 4J).
4. Odwróć układ napędowy do góry nogami i zrób zdjęcie matrycy rurki prowadzącej. Rysunek ten zostanie wykorzystany do zmapowania położenia rurki prowadzącej odpowiadającej każdemu mikronapędowi (Rysunek 4K).
5. Włóż rurkę poliamidową (0.005') do każdej rury prowadzącej od spodu podstawy napędu. Niech rurka nośna wystaje 1-2 mm od górnej krawędzi całkowicie opuszczonego napędu mikronapędowego i zapisać na zdjęciu tożsamość odpowiedniego napędu mikronapędu. (Rysunki 4L - 4M)
6. Epoksydować rurkę poliimidową do wspornika mikronapędu, uważając, aby żywica epoksydowa nie przedostała się przez mikronapęd na sprężynę lub (rysunki 4N, 4P - 4Q).
7. Całkowicie opuść wszystkie napędy microdrive. Odetnij wszystkie rurki poliimidowe równo z dnem matrycy poliimidowej (rysunek 4O).
8. Zamontuj płytkę interfejsu elektrody do podstawy napędu za pomocą dwóch #00-90 x 3/16'' (Rysunek 4R).
   UWAGA: W tym momencie macierz napędowa jest gotowa do załadowania stereotrodami lub tetrodami. Szczegółowe informacje na temat budowy i obciążenia tetrody znajdują się w ^{punkcie 10}. Wydrukowana podstawa napędu i mikronapędy zostały zaprojektowane w oprogramowaniu CAD 3D SolidWorks 2011: proszę kliknij tutaj, aby pobrać plik SolidWorks.
9. Po załadowaniu odwróć napęd i ostrożnie opuść stożek ekranujący nad napędem, tak aby wystawał tylko dolny element. Przymocuj stożek ekranujący, epoksydując stożek do korpusu napędu.
10. Po przymocowaniu stożka zdejmij izolację z drutu ze stali nierdzewnej o niewielkiej długości (.008'' Goły, .011'' Powlekany) i przypnij do EIB. Zdrap wewnętrzną, aluminiową część stożka igłą i zmielić drut stalowy do stożka za pomocą srebrnej farby. Po wyschnięciu srebrnej farby wzmocnij ją odrobiną żywicy epoksydowej. Alternatywnie, drut stalowy można bezpośrednio przymocować do stożka za pomocą odrobiny przewodzącej żywicy epoksydowej (MG Chemicals, Surrey, Kanada).

Wyniki

Konstrukcja implantu jest procesem, który rozpoczyna się od zaprojektowania wydrukowanego w technologii 3D hyperdrive'u (Rycina 1), a następnie przechodzi do wykonania elementu dolnego (Rycina 2), stożka ekranującego (Rycina 3) i końcowego montażu hyperdrive'u poprzez indywidualną konstrukcję microdrive'ów (Rycina 4). Kolejnym etapem jest wyposażenie microdrive'ów w elektrody (patrz ¹⁰). Po tym kroku możliwe jest wykorzystanie tych urządzeń do rejestracji aktywności z wielu obszarów mózgu. Na Rycine 5 przedstawiono przykładowe przebiegi z jednoczesnej rejestracji z bocznego ciała kolankowatego (LGN) i hipokampa (HPC). Stabilność pojedynczych jednostek pokazanych na Rycine 5B była wyjątkowa, wykazując spójne kształty fal w ciągu kilku dni. Potwierdzono, że neurony te są neuronami LGN, ponieważ reagowały one na stymulację diodą emitującą światło, co obrazuje histogram czasu perystymulacyjnego (PSTH) na Rycine 5C. W tej samej preparacji zarejestrowano potencjał polowy HPC jako wskaźnik stanu behawioralnego. Przebiegi te wykazały obecność ostrych fal i ripli (sharp wave ripples) (Rycina 5D) podczas spoczynku behawioralnego, co jest zgodne z ich hipokampowym pochodzeniem.

Rysunek 1. Projektowanie mikronapędu w programie Solidworks. A. Schemat przekroju czołowego mózgu myszy w współrzędnych A/P od -2,3 do -2,7 mm od bregmy. Nad korą narysowano cztery oddzielne poliimidy (300 µm), ilustrując celowanie elektrodami w obszar LGN (kolor czerwony). B. Szkic bryły projektowej. Obrót niebieskiego konturu o 180° pozwala uzyskać model 3D bryły projektowej (wstawka). C. Dodanie gniazd poliimidowych i uchwytów napędu do bryły projektowej. Obrót czerwonych zaznaczonych konturów z rysunku B o 13° skutkuje powstaniem połowy gniazda poliimidowego (lewy górny róg). Jeden uchwyt napędu dodano poprzez obrót zielonego konturu z rysunku B o 15° (prawy górny róg). Drugi uchwyt dodano przy użyciu funkcji wzoru kołowego (lewy dolny róg). Tą samą funkcją można utworzyć 16 połowic gniazd poliimidowych (prawy dolny róg). D. Do projektu dodano nową płaszczyznę (góra), co pozwala na stworzenie nowego szkicu gniazda mikronapędu, składającego się z otworu na śrubę, otworu na poliimidy i szyny przeciwobrotowej (dół). E. Elementy te zostaną zaimplementowane w projekcie za pomocą funkcji wycięcia i ekstruzji, a następnie obrócone o 360°, aby utworzyć 16 gniazd. F. Wymiary szkicu górnej części (lewo) oraz modelu 3D (prawo). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Przygotowanie dolnej części hyperdrive'a. A. Pierwsza rurka polimidowa zostaje umieszczona na taśmie dwustronnej. B. Kolejne rurki są układane pojedynczo, z dbałością o zminimalizowanie odstępów między nimi. C. Po ułożeniu pierwszej warstwy nanoszona jest cienka warstwa kleju cyjanoakrylowego. D. Druga warstwa polimidów jest szybko dodawana przed wyschnięciem kleju. E. Na wierzchu wiązki polimidów umieszcza się kaniulę 26 G jako placeholder dla włókna optycznego. F. Cała konstrukcja zostaje stabilnie utrwalona kroplą żywicy epoksydowej. G. Po usunięciu kaniuli konstrukcja może zostać przecięta w połowie żyletką, co pozwala uzyskać dwie identyczne dolne części. H. Widok powierzchni cięcia gotowej dolnej części, przedstawiający dwa podwójne rzędy czterech polimidów oraz otwór na włókno optyczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Montaż hyperdrive'u. A. Macierz polimidowa zostaje włożona do korpusu napędu i wyrównana z elektroniczną płytką interfejsu (EIB) za pomocą kaniuli 26 G. B. Niewielka ilość żywicy epoksydowej służy do przymocowania macierzy polimidowej do korpusu napędu. C. Może być konieczne drugie nałożenie żywicy epoksydowej, po czym nadmiar żywicy należy usunąć za pomocą narzędzia typu Dremel. D. Widok z góry na korpus napędu z włożoną macierzą. E. Za pomocą małego kawałka rurki polimidowej 33 G zewnętrzne rurki prowadzące zostają przymocowane w odpowiednich szczelinach korpusu napędu. F. Wszystkie zewnętrzne rurki prowadzące powinny zostać przypisane do szyny, dbając o zminimalizowanie naprężeń rurek. G. Po przypisaniu wszystkich zewnętrznych rurek prowadzących należy je zabezpieczyć żywicą epoksydową i odciąć tuż nad wewnętrzną krawędzią. H. Zespół mikronapędu, składający się z niestandardowej śruby, sprężyny 5 mm i elementu górnego, powinien zostać zmontowany i umieszczony nad szyną odpowiadającą jednej z rurek prowadzących. I. Każdy zespół mikronapędu należy ostrożnie wkręcić w korpus napędu. J. Po montażu każda rurka prowadząca powinna mieć odpowiadający jej mikronapęd. K. Widok z dołu macierzy polimidowej. L - M. Rurki polimidowe (0.005') zostają włożone do każdej zewnętrznej rurki prowadzącej. N. Każda wewnętrzna rurka prowadząca powinna ściśle pasować do widelca odpowiadającego jej mikronapędu. O. Wewnętrzne rurki polimidowe zostają przymocowane żywicą epoksydową do odpowiedniego mikronapędu i odcięte tak krótko, jak to możliwe. Po przyklejeniu wszystkich wewnętrznych rurek prowadzących, rurki wystające z macierzy polimidowej powinny zostać odcięte równo z krawędzią macierzy. P. Odwrócony widok makro napędu podczas ładowania wewnętrznych rurek prowadzących. Q. Górny widok makro napędu podczas ładowania wewnętrznych rurek prowadzących. R. W pełni zmontowany hyperdrive z podłączoną płytką EIB, gotowy do załadowania elektrod. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4. Przygotowanie stożka ekranującego. A. Szablon stożka wydrukowany na folii przezroczystej. B - D. Arkusz folii aluminiowej zostaje przyklejony do szablonu za pomocą cienkiej warstwy żywicy epoksydowej. E. Po wycięciu szablonu stożek jest formowany i sklejany żywicą epoksydową.

Rysunek 5. Rejestracje wielomiejscowe z wykorzystaniem ultralekkiego hyperdrive'u. A. Zdjęcie swobodnie poruszającej się myszy z wszczepionym hyperdrive'em. B. Przykłady rejestracji przebiegów czasowych dwóch pojedynczych jednostek u tej myszy. C. Po lewej, przekrój koronarny mózgu myszy z zaznaczonym jądrem bocznym ciała kolankowatego, do którego wprowadzono niektóre elektrody. Po prawej, przykładowe histogramy czasu po stymulacji (PSTH) dwóch neuronów LGN zsynchronizowane ze stymulacją wizualną (żółty pasek). D. Po lewej, przekrój koronarny z zaznaczonym hipokampem (HPC), do którego wprowadzono inny zestaw elektrod. Po prawej, przykład rejestracji lokalnego potencjału polowego dla oscylacji typu ripple w hipokampie (zaznaczenie czerwone).

Rysunek 6. Przegląd komponentów napędu. (Po lewej) Kompleksowy przegląd komponentów hyperdrive. (Po prawej) Ilustracja pojedynczego zestawu mikronapędu.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia proces konstruowania ultralekkiej macierzy mikronapędów do celowania w jeden lub wiele regionów mózgu myszy. Po końcowych etapach budowy hipernapęd jest gotowy do wszczepienia przy użyciu standardowych technik implantacji chirurgicznej i przymocowania do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego. Po implantacji każda elektroda może być wysuwana niezależnie za pomocą małego śrubokręta, podczas gdy mysz jest przytrzymywana ręką. Odległość na obrót, jaką przesuwa się każda elektroda, zależy od skoku. Użycie, o których tutaj mowa, przesuwa każdą elektrodę o około 150 mm na obrót, chociaż w celu uzyskania większej rozdzielczości można użyć pół i ćwierć obrotu.

Wymiary szkicu na rysunku 1B określają całkowity rozmiar implantu, dlatego oczywistym sposobem dwukierunkowego skalowania implantów jest zmiana wymiarów na tym krytycznym szkicu. Dodatkowo długość można wydłużyć, aby celować w głębsze struktury mózgu. Polecamy tytanowe wykonane na zamówienie, ponieważ są one lekkie i mniej kruche niż stalowe. Zwróć uwagę, że szyny antymomentowe muszą skalować się liniowo wraz z długością, a w tym momencie nie określiliśmy maksymalnej długości, na jakiej można wydrukować te konstrukcje. Aby celować w wiele obszarów mózgu, kształt dolnej części można zmodyfikować. Dodanie podkładek o znanych rozmiarach (grubość 200 μm) może zapewnić potrzebne przekładki między poliimidami ukierunkowanymi na oddzielne struktury mózgu (na przykład hipokamp i korę przedczołową). Można je włączyć do etapów montażu dolnego elementu, a następnie odciąć po stwardnieniu żywicy epoksydowej.

Dużym ograniczeniem tej konstrukcji jest jej zależność od autorskiego oprogramowania (w tym przypadku Solidworks). Przyszły rozwój programów open source, które zapewniają przyjazne dla użytkownika interfejsy sprzyjające projektowaniu takiego sprzętu przy minimalnym zapleczu inżynieryjnym, przyniósłby ogromne korzyści społeczności neuronaukowej.

Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami. Po pierwsze, projekt jest prosty, zależny od bardzo niewielu szkiców (rysunek 1). Po drugie, jest ultralekki, nie wymaga cementu dentystycznego ani ciężkiego materiału do jego montażu. Ogółem waży około 1,7 g – prawie jedną trzecią wagi dostępnych na rynku implantów o podobnej funkcjonalności. Po trzecie, nie wymaga specjalistycznego sprzętu do wykonania – korpus implantu można wydrukować w 3D z wielu źródeł (na przykład approto.com, ale jest jeszcze kilka innych); mogą być wykonane na zamówienie (na przykład antrinonline.com); sprężyny są dostępne na rynku (na przykład leesprings.com); W rezultacie cały proces montażu może odbyć się w ciągu jednego dnia. Wreszcie, implanty te zostały wykorzystane do rejestrowania z wielu obszarów mózgu podczas naturalnego żerowania, ustrukturyzowanych zadań behawioralnych i snu (ryc. 5).

Przyszłe zastosowania tej metody obejmują implementację jej skalowalności. Jest prawdopodobne, że implant może być skalowany dwukierunkowo po prostu poprzez zmianę 1) rozmiaru szkicu na rysunku 1B i 2) liczby gniazd mikronapędu (rysunek 1D) wzorzystych. Na przykład, można go przeskalować w dół, aby zarejestrować swobodnie zachowujące się myszy we wczesnym okresie rozwoju, i przeskalować w górę, aby zarejestrować dane dotyczące szczurów, królików, fretek i być może naczelnych innych niż ludzie.

Ostatnim słowem jest przypomnienie czytelnikowi, że kluczowe znaczenie dla pomyślnego wdrożenia opisanej metody ma prototypowanie wszelkich modyfikacji, które wdrażają w załączonych plikach projektowych .stl. Czytelnik zauważy na przykład, że załączony projekt zawiera szynę antyrekwartową "rysunek 8". Był to najlepszy możliwy projekt, biorąc pod uwagę ograniczenia druku 3D, ponieważ często wymagane jest wywiercenie tych otworów. Gdyby był to okrąg, zagroziłoby stabilności, ale gdyby był to kształt kwadratowy lub kątowy, ograniczyłoby to możliwość naprawienia niedoskonałości druku 3D przez wiercenie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
mikronapędowe	Antrin		Half Circle 0,6 UNM tytanowe. Gwint 8 mm. Długość 9 mm od spodu łba.
Łatwość gwintowania	AGS CO.	#TA2	Stukanie
smaru Microdrives			Patrz . Plik STL
Korpus			Patrz . Plik STL
Zewnętrzna rurka prowadząca z poliimidu Elementy	inwazyjne	IWG Pozycja # 72113300022-012	Długość: 12' ', ID: 0.0071' ', OD: 0,0116' ', ŚCIANA: 0,00225' '
Wewnętrzna poliimidowa rurka prowadząca Elementy	inwazyjne	IWG Pozycja # 72113900001-012	Długość: 12' ', ID: 0.0035' ', OD: 0,0055' ', ŚCIANA: 0,001' '
Przewód uziemiający	A-M Systems, Inc.	Numer katalogowy # 791900	0.008'' Goły, 0.011'' Powlekany
smar Tri-Flow			na bazie teflonu - Aerosol
Microdrive Springs	Lee Spring	Part # CB0050B 07 E	Średnica zewnętrzna: 1.016 mm, Średnica otworu: 1.193 mm, Średnica drutu: 0.127 mm, Długość swobodna: 10.160 mm, Długość bryły: 3.581 mm
Z-poxy 5 minut	Technologia Pacer (Zap)	PT37
Srebrna farba	GC Elektronika	Część #: 22-023	Srebrny wydruk II
	Tri-Flow	20009
Rurka podskórna 26 G - małe części ze stali nierdzewnej		HTXX-26T-12-10	Długość: 12' ', ID: 0.012' ', OD: 0,018' '
EIB	Component Supply Co.	MX-0090-03SP	#00-90 x 3/16' '
Cienkie nożyczki - Toughcut	Fine Science Tools	14058-09
Papier przezroczysty	22 mm 3M	PP2500
Folia aluminiowa	Reynold's Wrap Heavy Duty		Extra Thick

dysku