Artykuł metodologiczny

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51679

⸱

1 sierpnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

Streszczenie

Ten raport demonstruje użycie głównych dekstramerów klasy II kompleksu zgodności tkankowej (MHC) do wykrywania autoreaktywnych limfocytów T CD4 in situ w białku proteolipidowym mieliny (PLP) indukowanym przez 139-151 eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE) u myszy SJL oraz eksperymentalnym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mięśnia sercowego (EAM) wywołanym przez mi α ozynę serca serca (Myhc) 334-352 u myszy A/J. Zastosowano dwa zestawy koktajli odczynników dekstramerowych, w których komórki dekstramerów+ analizowano za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSCM): EAE,IA s/PLP 139-151 dekstramery (specyficzne)/anty-CD4 i IAs/wirus mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) 70-86 dekstramery (kontrola)/anty-CD4; oraz EAM, IAk/Myhc 334-352 dekstramery/anty-CD4 i IAk/rybonukleaza bydlęca (RNaza) 43-56 dekstramery (kontrola)/anty-CD4. Analiza LSCM skrawków mózgu uzyskanych od myszy EAE wykazała obecność komórek dodatnich dla dekstramerów CD4 i PLP 139-151, ale nie dekstramerów TMEV 70-86, co sugeruje, że barwienie uzyskane za pomocą dekstramerów PLP 139-151 było specyficzne. Podobnie, skrawki serca przygotowane od myszy EAM również wykazały obecność Myhc 334-352, ale nie komórek RNazy 43-56-dekstrymer+, jak oczekiwano. Ponadto opracowano kompleksową metodę ilościowej analizy częstości występowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 w obrazach seryjnych "Z".

Wprowadzenie

Użycie tetramerów klasy II głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) do wykrywania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 było wyzwaniem 1-7. Aby zwiększyć czułość wykrywania tetramerów MHC klasy II, zespół badawczy stworzył tetramery nowej generacji, oznaczone jako "dekstramery" 8. Ekstrymery zawierają szkielety dekstranu, w których sprzężonych jest wiele ugrupowań streptawidyna-fluorofor, tak że do jednej cząsteczki dekstranu można przyłączyć kilka biotynylowanych monomerów MHC związanych peptydami9. W ten sposób duże agregaty deksmerów MHC, które zawierają kilka kompleksów peptydowych MHC, mogą wchodzić w interakcje z wieloma receptorami limfocytów T (TCR).

Ta grupa niedawno wygenerowała deksmery dla różnych własnych antygenów i wykazała, że czułość wykrywania deksmerów była około pięciokrotnie większa niż tetramerów 8. Systemy eksperymentalne obejmują eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) indukowane białkiem proteolipidowym (PLP) 139-151 u myszy SJL; EAE indukowane glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55 u myszy C57Bl / 6; oraz eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mięśnia sercowego (EAM) wywołane sercowym α ciężkim łańcuchem miozyny (Myhc) 334-352 u myszy A / J. Badanie to demonstruje zastosowanie dekstrymerów PLP 139-151- i Myhc 334-352 do wykrywania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 in situ ze swoistością poprzez opracowanie protokołu bezpośredniego barwienia, eliminując w ten sposób potrzebę wzmacniania sygnałów przy użyciu przeciwciał fluoroforowych, podejścia powszechnie stosowanego przy użyciu tetramerów. Ponadto opracowano kompleksową metodę oceny tkanek, aby wiarygodnie zliczyć częstość występowania limfocytów T CD4 specyficznych dla antygenu in situ 10. Wykrywanie in situ limfocytów T specyficznych dla antygenu pozwala na odróżnienie zdarzeń spowodowanych przez określone bodźce antygenowe od tych spowodowanych aktywacją osoby postronnej. Podobnie, technika in situ daje również możliwość śledzenia kinetyki nacieków limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach docelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne:

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

1. Wprowadzenie EAE

  1. W celu wywołania EAE należy przygotować peptyd/kompletną emulsję adiuwantową Freunda (CFA) zgodnie z opisem w 11 z następującymi modyfikacjami: Krok 1.1: przygotować PLP 139-151 w stężeniu 1 mg/ml w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Krok 1.4: użyć 200 μl emulsji CFA zawierającej 100 μg PLP 139-151 na zwierzę. Krok 1.4.1: aby uodpornić dziesięć zwierząt, przygotuj 2 ml emulsji, mieszając 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml w 1x PBS) i równą objętość CFA. Krok 1.5: wstrzyknąć 200 μl emulsji w dawkach podzielonych podskórnie w dwie okolice pachwinowe (~ 75 μl każdy) i okolicę mostka (~ 50 μl) u samic myszy SJL / J w wieku od pięciu do sześciu tygodni. Kroki 1.7 i 1.8 nie mają zastosowania do indukcji EAE.

2. Ocena kliniczna myszy EAE i pobieranie mózgów

  1. Monitoruj zwierzęta pod kątem pojawienia się objawów klinicznych i oceniaj nasilenie choroby codziennie od 9 dnia po szczepieniu w następujący sposób: 0 - zdrowe; 1 - osłabienie wiotkiego ogona lub kończyn tylnych, ale nie obu; 2 - osłabienie wiotkiego ogona i kończyn tylnych; 3 - częściowy paraliż kończyn tylnych; 4 - całkowity paraliż kończyn tylnych; 5 - konający lub martwy 12.
  2. Poddaj myszy eutanazji, gdy osiągną wynik neurologiczny 3 lub 4 za pomocą CO2 . Aby poddać eutanazji myszy, należy najpierw wstępnie napełnić komorę eutanazyjną CO2 , obracając regulator zbiornika CO2 o ciśnieniu nieprzekraczającym 6 psi i pozwolić zwierzętom pozostać w komorze przez około 5 minut, aby osiągnąć całkowite uduszenie. Namocz uśpione zwierzęta w 70% alkoholu. Natychmiast umieść zwierzęta na podkładce chłonnej i za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek odsłonij serca, przecinając jamę piersiową. Nakłuć prawe małżowiny uszne i wykonać perfuzję, wstrzykując 10 ml zimnego 1x PBS do lewej komory serca.
  3. Wykop czaszkę, przecinając czaszkę w okrągły sposób za pomocą zakrzywionych nożyczek i ostrożnie, odwróć kości czaszki kleszczami. Zbierz mózg przez rozbiór i za pomocą czystego skalpela oddziel mózg od móżdżku. Umieść mózg w probówce zawierającej zimny 1x PBS i pozostaw probówkę na lodzie do czasu przetworzenia.

3. Barwienie in situ sekcji mózgowych za pomocą dekstramerów MHC klasy II (IAs)/PLP 139-151

  1. Przygotować 4% niskotopliwą agarozę buforowaną PBS, rozpuść przez ogrzewanie w temperaturze 50 °C i pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C do czasu użycia.
  2. Umieść mózg w jednorazowej kasecie histologicznej z głęboką podstawą trzymaną na lodzie i wlej stopioną (40 °C) agarozę. Natychmiast delikatnie dociśnij mózg kleszczami, aby zanurzyć tkankę. Pozostaw kasetę na lodzie na 15-20 minut, aż do całkowitego zestalenia.
  3. Napełnij wannę wibratomową schłodzonym 1x PBS. Wypełnij przestrzeń wokół wanny wibratonowej kostkami lodu, aby utrzymać temperaturę PBS w zakresie od 0 do 2 °C. Zamocuj czystą żyletkę w wibratomie i ustaw kąt ostrza na 15°.
  4. Umieszczenie tkanki w wibratomie. Przytnij nadmiar agarozy ze wszystkich stron osadzonej tkanki i lekko odsłonij brzuszną powierzchnię mózgu.
    1. Posmaruj blok tkanki wibratomu super klejem i przenieś tkankę zatopioną w agarozie na sklejoną powierzchnię, umieszczając odsłoniętą brzuszną powierzchnię mózgu na kleju w celu przekroju poprzecznego. Nie przesuwaj tkanki, gdy tkanka zostanie umieszczona nad blokiem.
    2. Umieść blok wibratomu zawierający tkankę zatopioną w agarozie na lodzie i pozostaw klej do wyschnięcia na 15 minut.
  5. W międzyczasie umieść komory na tkanki po jednej na każdym dołku na 24-dołkowej płytce. Napełnij studzienki zawierające komory na chusteczki 1 ml zimnego 1x PBS i pozostaw płytkę na lodzie.
    1. Przygotować komory na chusteczki poprzez przymocowanie cienkiej siatki nylonowej do odciętego końca pipety polipropylenowej o pojemności 25 ml za pomocą super kleju; po przycięciu nadmiaru siatki wokół pipety, przyciąć pipetę na długość 1 cm od siatki.
  6. Opuść ostrze wibratomu do poziomu górnej powierzchni tkanki; ustaw prędkość wibratomu na 0,22 mm/s i rozpocznij cięcie ruchem do przodu, aby uzyskać skrawki o grubości 200 μm. Przenieś jeden fragment mózgu na studzienkę za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego do komór tkankowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki. Utrzymuj płytkę na lodzie do czasu zakończenia cięcia, aby zapobiec degradacji tkanek. Uwaga: Wykonaj poniższe czynności, aby uzyskać w sumie trzy sparowane odcinki z trzech różnych obszarów grzbietu mózgu do powierzchni brzusznej (ryc. 2). Jeden wycinek z każdej pary (w sumie trzy sekcje) umieszczony w trzech oddzielnych komorach tkankowych przeznaczony jest do barwienia określonymi dekstrymerami (IAs/PLP 139-151) i anty-CD4. Podobnie, kolejny zestaw trzech sekcji, które są umieszczone w trzech oddzielnych komorach tkankowych, jest przeznaczony do barwienia dekstramerami kontrolnymi (IAs/TMEV 70-86) i anty-CD4.
  7. Przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia określonymi dekstrymerami do trzech studzienek na 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, w której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego dekstramery PLP 139-151 sprzężone z allofikocyjaniną (APC) (2,5 μg/ml) i anty-CD4-fikoerytrynę (PE; 5 μg/ml) w roztworze blokującym (1x PBS z 2% normalną surowicą kozią). Przykryj studzienki pokrywką.
  8. Podobnie, przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia deksmerami kontrolnymi do trzech dołków w 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, do której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego deksmery TMEV 70-86 sprzężone z APC (2,5 μg/ml) i anty-CD4-PE (5 μg/ml) w roztworze blokującym. Przykryj studzienki pokrywką. Uwaga: Patrz Massilamany et al., 8 w celu przygotowania dekstramerów, a cząsteczki dekstranu do przygotowania dekstramerów zostały uprzejmie dostarczone przez Immudex, Kopenhaga, Dania.
  9. Oznacz dołki, owiń płytkę folią aluminiową i umieść płytkę na kołyszącej się platformie ustawionej na delikatne obroty przez 1,5 godziny w ciemności przy temperaturze pokojowej.
  10. Po okresie inkubacji umyj skrawki tkanek na platformie bujanej, przenosząc komory na tkanki do świeżej studzienki zawierającej 1 ml zimnego 1x PBS i unikaj kapania zawartości jednego dołka do drugiego. Powtórz pranie trzykrotnie, pozostawiając co najmniej 10 minut na pranie. Upewnij się, że skrawki tkanki nie wyschną, ponieważ mogą przyklejać się do boków komory.
  11. Utrwal skrawki, przenosząc komory tkankowe do świeżej studzienki na 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml przefiltrowanego 4% buforowanego PBS paraformaldehydu (pH 7,4) na platformie bujającej przez 2 godziny z delikatnymi obrotami.
  12. Powtórz pranie trzy razy, jak opisano w kroku 3.10.
  13. Umieść poplamione i utrwalone sekcje na czystym szkiełku mikroskopowym za pomocą miękkiego pędzla do akwareli. Wytrzyj nadmiar wody bez dotykania sekcji i zamontuj sekcję za pomocą medium montażowego. Przykryj mikroskopijnym szkiełkiem nakrywkowym i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze RT O/N w ciemnym pomieszczeniu.
  14. Szkiełka należy przechowywać w odpornym na światło pojemniku do przechowywania szkiełek w temperaturze 4 °C.

4. Wprowadzenie EAM i Zbiórka Serc

  1. Wywołać EAM zgodnie z opisem w odnośniku 11.
  2. Poddaj myszy eutanazji w 21 dniu po szczepieniu za pomocą czystej komory wyposażonej w butlę z gazem CO2 i namocz zwierzęta w 70% alkoholu. Natychmiast umieść zwierzęta na podkładce chłonnej i za pomocą kleszczy i nożyczek odsłoń serca, przecinając klatkę piersiową. Nakłuć prawe małżowiny uszne i wykonać perfuzję, wstrzykując 10 ml zimnego 1x PBS do lewej komory serca. Zbierz serca i umieść w probówkach zawierających 1x PBS.

5. Barwienie in situ wycinków serca za pomocą dekstramerów MHC klasy II (IAk)/Myhc 334-352

  1. Przygotować 4% niskotopliwą agarozę buforowaną PBS, rozpuść przez ogrzewanie w temperaturze 50 °C i pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C do czasu użycia.
  2. Umieścić serce w jednorazowej kasecie histologicznej z głęboką podstawą trzymaną na lodzie i wlewać stopioną agarozę o temperaturze 40 °C, aż tkanki zostaną całkowicie zanurzone, jak opisano w kroku 3.2.
  3. Wykonaj krok 3.3.
  4. Przytnij nadmiar agarozy ze wszystkich stron osadzonej tkanki i lekko odsłonij podstawę serca. Posmaruj blok tkanki wibratomu super klejem i przenieś tkankę zatopioną w agarozie na sklejoną powierzchnię, umieszczając odsłoniętą powierzchnię serca na kleju. Nie przesuwaj tkanki, gdy tkanka zostanie umieszczona nad blokiem.
    1. Umieść blok wibratomu zawierający tkankę zatopioną w agarozie na lodzie i pozostaw klej do wyschnięcia na 15 minut.
  5. Wykonaj kroki 3.5 i 3.6.
  6. Przenieś skrawki serca za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego do komór tkankowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki. Trzymaj płytkę na lodzie do czasu zakończenia cięcia, aby zapobiec degradacji tkanki. Uwaga: Wykonaj poniższe czynności, aby uzyskać w sumie osiem sparowanych odcinków od wierzchołka do podstawy serca (ryc. 2). Umieść wszystkie sekcje w komorach na tkanki, przydzielając do 3 sekcji na komorę. Jedna sekcja z każdej pary (w sumie osiem sekcji) jest przeznaczona do barwienia określonymi dekstrymerami (IAk/Myhc 334-352) i anty-CD4. Podobnie, kolejny zestaw ośmiu sekcji jest przeznaczony do barwienia deksmerami kontrolnymi (IAk/RNaza 43-56) i anty-CD4.
  7. Przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia określonymi deksmerami do trzech dołków w 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, do której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego dekstrymery Myhc 334-352 sprzężone z APC (2,5 μg/ml) i anty-CD4-PE (5 μg/ml) w roztworze blokującym. Przykryj studzienki pokrywką.
    1. Podobnie, przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia deksmerami kontrolnymi do trzech dołków w 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, do której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego deksmery RNase 43-56 sprzężone z APC (2,5 μg/ml) i anty-CD4-PE (5 μg/ml) w roztworze blokującym. Przykryj studzienki pokrywką.
  8. Oznacz dołki, owiń płytkę folią aluminiową i umieść płytkę na kołyszącej się platformie ustawionej na delikatne obroty przez 1,5 godziny w ciemności przy temperaturze pokojowej.
  9. Wykonaj kroki od 3.10 do 3.11
  10. Powtórz pranie trzy razy, jak opisano w kroku 3.10.
  11. Umieść poplamione i utrwalone sekcje (do trzech sekcji/szkiełko) na czystym szkiełku mikroskopowym za pomocą miękkiego pędzla do akwareli. Wytrzyj nadmiar wody bez dotykania sekcji i zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego. Przykryj mikroskopijnym szkiełkiem nakrywkowym i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze RT O/N w ciemnym pomieszczeniu.
  12. Szkiełka należy przechowywać w odpornym na światło pojemniku do przechowywania szkiełek w temperaturze 4 °C.

6. Analiza limfocytów T Dextramer+ (dext+) CD4+ za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSCM) (wspólnego zarówno dla części mózgu, jak i serca)

  1. Użyj systemu mikroskopu konfokalnego Nikon A1-Eclipse 90i do rutynowego skanowania i pozyskiwania obrazów. Aby uruchomić program Click open, należy zainstalować oprogramowanie NIS Elements AR (wersja 4.13).
    1. Wybierz kanały "TRITC" i "Cy5" z panelu. Długości fal wzbudzenia/emisji odpowiednio dla kanałów TRITC i Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm i 640,7 nm / 663-738 nm pojawiają się domyślnie.
    2. Przypisz pseudokolory "zielony" i "czerwony" odpowiednio dla kanałów TRITC (CD4-PE) i Cy5 (dextramer-APC).
    3. Umieść szkiełko do badania na stoliku mikroskopowym i ustaw ostrość ręcznie pod 100-krotnym powiększeniem. Ustaw "HV" na 110 i przesunięcie na "0". Kliknij "Ostrość" i dostosuj "napięcie", aby zoptymalizować lasery.
    4. Kliknij "Ostrość"; zeskanuj sekcję od góry do dołu i ustaw poziom "Z" do akwizycji obrazu. Kliknij "Seria CH" i uzyskaj obraz sekwencyjnie. Zidentyfikuj limfocyty T dext + CD4 + pojawiające się jako żółte komórki punktowe na podstawie kolokalizacji sygnałów generowanych zarówno z kanału czerwonego (deksmery), jak i zielonego (CD4).
  2. Użyj mikroskopu konfokalnego Olympus FV500-BX60 do łatwego ilościowego wyliczania limfocytów T dext+ CD4+. Aby rozpocząć, kliknij otwórz, oprogramowanie FLUOVIEW (wersja 4.3).
    1. Z menu rozwijanego wybierz barwniki "Cy3" i "Cy5" i kliknij "zastosuj", aby załadować odpowiednie lasery. Uwaga: długości fal wzbudzenia/emisji dla Cy3 (543 nm/pseudokolorowy "zielony"; CD4-PE) i Cy5 (633 nm/pseudokolorowy "czerwony"; dekstramer-APC).
    2. Umieść szkiełko do badania na szkiełku mikroskopowym i ustaw je ręcznie pod małym powiększeniem (4X lub 10X). Kliknij "Focus" (Ostrość), gdy laser Cy3 jest włączony i skoncentruj się na ognisku zapalnym.
    3. Zmień obiektyw na 100-krotne powiększenie. Ustaw rozmiar pliku na "512/512" z menu rozwijanego. Kliknij "Ostrość" i dostosuj wartości parametrów "PMT", "Wzmocnienie" i "Przesunięcie", aby zoptymalizować lasery osobno dla Cy3 i Cy5.
    4. Kliknij "Ze stage", a następnie kliknij "Focus", gdy oba lasery są włączone. Ustaw grubość "stolika Z", klikając strzałki "w górę" i "w dół". Ustaw interwał "Z" na 2 μm.
    5. Kliknij "Stop" i wybierz "Seq123". Następnie kliknij "XYZ" i rozpocznij pobieranie obrazów z serii "Z" dla wybranego obszaru w ognisku zapalnym. Zapisz "Obrazy szeregowe Z" jako pliki AVI. Aby zapisać pliki obrazów, wybierz obraz z "Z serial image", a następnie zapisz w formacie "tiff".
  3. Zbadaj trzy sparowane sekcje mózgu, z których jedna została wybarwiona deksmeramiIA / PLP 139-151 / anty-CD4, a druga grupa trzech sekcji dekstramerami / anty-CD4 IAs / TMEV 70-86 / anty-CD4 w celu przeprowadzenia analizy ilościowej.
    1. Podobnie przeanalizuj osiem sparowanych sekcji dla serca, w których jeden zestaw ośmiu sekcji został wybarwiony dekstramerami IAk/Myhc 334-352/anty-CD4, a drugi zestaw ośmiu sekcji dekstramerami/anty-CD4 RNaza 43-56/anty-CD4.
  4. Zbadaj od 10 do 15 ognisk zapalnych na sekcję w mózgu i w każdym ognisku uzyskaj sekwencyjnie zestaw od 15 do 25 seryjnych obrazów.
    1. Zbadaj łącznie 20 ognisk zapalnych ze wszystkich ośmiu sekcji serca i z każdego ogniska uzyskaj sekwencyjnie od 10 do 15 seryjnych obrazów. Wykonaj zdjęcia seryjne "Z", skanując slajdy w ruchu "poziomo-pionowo-poziomo-pionowo-pionowo-w dół", aby uniknąć powtórzeń serii "Z" w tej samej ostrości.
    2. Po przechwyceniu obrazów seryjnych "Z" nazwij pliki, identyfikując numery slajdów, nazwy sekcji i liczbę wykonanych zdjęć seryjnych "Z".
      1. Użyj oprogramowania "ImageJ", aby policzyć limfocyty T dext+ CD4+ w stosunku do całkowitej liczby limfocytów T CD4+. Wybierz "typ licznika" w "ImageJ", zaznacz "pokaż wszystko" i rozpocznij liczenie, klikając środek każdej komórki i kontynuuj liczenie na różnych obrazach seryjnych "Z" za pomocą bocznych strzałek. Po zliczeniu wszystkich limfocytów T CD4 wybierz inny rodzaj licznika i policz limfocyty T CD4 + dext +. Kliknij kartę wyników, aby uzyskać łączną liczbę komórek zliczonych przy użyciu dwóch różnych liczników.
      2. Aby uzyskać całkowitą liczbę, dodaj liczbę komórek na wszystkich obrazach seryjnych "Z" reprezentujących wszystkie trzy sekcje mózgu lub wszystkie osiem sekcji serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym raporcie opisano detekcję in situ antygenowo specyficznych, autoreaktywnych limfocytów T CD4 poprzez bezpośrednie barwienie dekstramerami MHC klasy II. Świeżo wycięte przekroje mózgu pobrano od myszy z EAE i zabarwiono koktajlami zawierającymi dekstramery PLP 139-151 (specyficzne) lub TMEV 70-86 (kontrolne) oraz przeciwciała anty-CD4. Górne panele na Rysunku 1 przedstawiają analizę LSCM przekrojów mózgu poddanych podwójnemu barwieniu dekstramerami PLP 139-151 (czerwone) i przeciwcia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przeciwieństwie do tetramerów MHC klasy I, zastosowanie tetramerów MHC klasy II do rutynowych zastosowań nadal stanowi wyzwanie, zwłaszcza w celu wyliczenia częstości prekursorów autoreaktywnych limfocytów T CD4 o niskim powinowactwie, częściowo ze względu na ich zależność od aktywacji 6,15-17. Ostatnio problem ten został rozwiązany poprzez stworzenie nowej generacji tetramerów, zwanych "dekstramerami", co pozwoliło nam wykryć specyficzne dla antygenu limfocyty T CD4 dla wielu autoantygenów, takich jak PLP 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez American Heart Association i Children's Cardiomyopathy Foundation (SDG2462390204001) oraz National Institutes of Health (HL114669). CM jest laureatem grantu na stypendium podoktoranckie przyznanego przez Myocarditis Foundation, NJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CFASigma Aldrich, St Louis, MO5881Sklep pod adresem 4 ° C
MTB  Ekstrakt z H37Rv Difco Laboratories, Detroit, MI231141Sklep pod adresem 4 ° C
PTList Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Sklep pod adresem 4 ° C
1x PBS Corning, Manassas, VA21-040-CVSklep pod adresem 4 & # 176; C
Samice myszy A/J Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Samica myszy SJL/JJackson Laboratories, Bar Harbor, ME686
Leur-lok sterylna strzykawka 1 mlBD, Franklin Lakes, NJ309628
Leur-lok sterylna strzykawka 3 mlBD, Franklin Lakes, NJ309657
Sterylna igła, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ305195
Sterylna igła, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
3-drogowy kran odcinający Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OHMX5311L
Kerlix Rolki bandaży z gazy Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Agaroza, Niska temperatura topnienia, klasa analitycznaPromega corporation, Madison, WIV2111
Immunopure normalna surowica koziaThermo Scientific, Waltham, MA31873Przechowywać pod adresem -20 i #176; C
Anty-mysi CD4 sprzężony z barwnikiem PEeBioscience, San Diego, CA 12004185Sklep pod adresem 4 ° C
ParaformaldehydowaMikroskopia Elektronowa Sciences, Hatfield, PA19202Sklep pod adresem 4 ° C
Wodne podłoże montażowe FaramountDako, Carpinteria, CA10073021
Probówka stożkowa (15 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352099
Probówka stożkowa (50 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352070
24-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli tkankowychBD Biosciences, San Jose, Kalifornia356775
Pędzledo akwareli #2Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
Zwykłe szkiełka mikroskopowe, rozmiar: 3" x 1" x 1,2 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA1255010
Premium Szkło nakrywkowe, 22 x 22-1Fisher Scientific, Pittsburgh, PA12548B
Jednorazowe kasety histologiczne do głębokiej pleśniProdukt laboratoryjny, Rochester, NYM-475-10
Klej Loctite SuperHenkel Corporation, Westlake, OH1471879
ŻyletkiGillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptyd, Cambridge, MASklep pod adresem 4 ° C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)Neopeptyd, Cambridge, MASklep pod adresem 4 ° C
MHC klasa II/IAs PLP 139-151 lub dekstramery TMEV 70-86 sprzężone z barwnikiemPrzechowywać w 4 ° C
MHC klasa II/IAk Myhc 334-352 lub  lub dekstrymery RNazy 40-56 sprzężone z barwnikiemPrzechowywać w 4 ° C
Dextran sprzężony z SA-APCImmundex, Kopenhaga, DemarkStore at 4 ° C
Sterylne nożyczki chirurgiczne i kleszczeNarzędzie INOX Corporation
MikropiekarnikGE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 VibratomeLeica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyOlympus America, Inc. Center Valley, PA
Mikroskop konfokalny Nikon A1-Eclipse 90iNikon Inc. Melville, Nowy Jork
APC APC

Bibliografia

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654(2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11(2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dekstramery MHC klasy IImikroskopia konfokalnasekcjonowanie tkanekeksperymentalna autoimmunologiczna encefalomyelitiseksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mi nia sercowegodetekcja limfocyt w T specyficznych dla antygenulaserowa skaningowa mikroskopia konfokalnaanaliza obraz w Z stackbarwienie w komorze tkankowej

Powiązane artykuły