Ekstrakcja DNA ze śliny może stanowić łatwo dostępne źródło DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, z niewielką lub żadną degradacją/fragmentacją. Protokół ten zapewnia zoptymalizowane parametry pobierania/przechowywania śliny i ekstrakcji DNA, aby były wystarczającej jakości i ilości dla dalszych testów DNA o wysokich wymaganiach jakościowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Preferowanym źródłem DNA w badaniach nad genetyką człowieka jest krew lub linie komórkowe pochodzące z krwi, ponieważ te źródła dostarczają dużych ilości DNA wysokiej jakości. Jednak ekstrakcja DNA ze śliny może dać wysokiej jakości DNA z niewielką lub żadną degradacją/fragmentacją, które jest odpowiednie dla różnych testów DNA bez kosztów flebotomisty i można je nawet uzyskać pocztą. Jednak w chwili obecnej w literaturze nie przedstawiono protokołów pobierania/ekstrakcji DNA ze śliny do sekwencjonowania nowej generacji. Protokół ten optymalizuje parametry pobierania/przechowywania śliny i ekstrakcji DNA, aby były wystarczającej jakości i ilości dla testów DNA o najwyższych standardach, w tym genotypowania mikromacierzy i sekwencjonowania nowej generacji.
Wprowadzenie
Uzyskanie wysokiej jakości DNA do badań genetycznych na ludziach jest niezbędne w procesie odkrywania genów choroby. Krew, choć wymaga inwazyjnej procedury, a także jest droższa niż pobieranie śliny, jest preferowana do tworzenia nieśmiertelnych linii komórkowych jako nieskończonego źródła DNA lub iPSC do badań funkcjonalnych, a czasami DNA krwi jest używane, gdy linie komórkowe nie są dostępne. Jednak uzyskanie krwi wymaga wyszkolonego flebotomi, a krew ma krótszy okres półtrwania niż ślina1. DNA ze śliny jest tańsze i łatwiejsze do uzyskania, ponieważ można je pobrać i wysłać pocztą bez konieczności korzystania z usług flebotomi, zwiększając w ten sposób potencjalne pule pacjentów daleko poza obszar oddziaływania szpitali i laboratoriów2. Rekrutacja do badania może ulec poprawie, gdy uczestnicy mają możliwość oddania próbki śliny zamiast krwi3, 4. Obawy dotyczące ilości i jakości DNA ze śliny mogły ograniczyć jego powszechne stosowanie, pomimo licznych badań, ostatnich badań wykazujących przydatność całej śliny, ze średnią 4,3 x 105 komórek na mililitr, do badań DNA nad starszymi metodami wymazów z policzka, które nie uzyskały znacznych ilości śliny2, 3, 4, 5, 6. Chociaż istnieje skromna literatura wskazująca na przydatność całego DNA pochodzącego ze śliny do zastosowań genotypowania, w tym metod opartych na mikromacierzach8, 9, 10, żadne badania nie analizowały sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Celem optymalizacji całego protokołu ekstrakcji DNA ze śliny była maksymalizacja ilości i jakości do zastosowań genetycznych w opłacalny sposób, który można łatwo wdrożyć w laboratoriach z powszechnie stosowanymi odczynnikami i materiałami eksploatacyjnymi.
Ekstrakcja DNA ze śliny wymaga kilku procedur: 1) zbieranie i przechowywanie, 2) liza komórek, 3) leczenie RNazą, 4) wytrącanie białka, 5) wytrącanie etanolu, 6) ponowne nawodnienie DNA. Roztwór buforu stabilizującego DNA, opisany wcześniej2, działa prawidłowo bez zmian. Nie podjęto żadnych prób optymalizacji etapów leczenia RNazą i ponownego nawodnienia DNA. Dla każdego pozostałego etapu zidentyfikowano kilka zmiennych, które mogą mieć wpływ na plon. Każda zmienna była manipulowana indywidualnie, a poprawa plonu i jakości była oceniana statystycznie. W przypadku zmiennych, które wykazały poprawę wydajności i/lub jakości DNA, optymalne wartości zostały uwzględnione w końcowym protokole.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Przed oddaniem próbek śliny wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę zgodnie z wytycznymi dotyczącymi leczenia ludzi w Nationwide Children's Hospital.
1. Pobieranie i przechowywanie śliny
- Przed pobraniem śliny upewnij się, że usta pacjenta są wolne od jedzenia lub innych obcych substancji, przepłukując usta wodą i unikając jedzenia lub picia przez 30 minut przed pobraniem próbki.
- Otwórz probówkę wirówkową o pojemności 15 ml z 2,5 ml buforu stabilizującego DNA2, upewniając się, że nie dotykasz wnętrza nasadki lub probówki, i poproś badanego, aby wypluł 2,5 ml śliny do roztworu buforowego. Uwaga: Pobranie więcej niż 2,5 ml śliny może prowadzić do degradacji próbki z powodu niewystarczającego stosunku próbki do buforu stabilizującego DNA. Zebranie zbyt małej ilości śliny zmniejszy oczekiwane plony z protokołu. Aby ocenić objętość zbierania, użyj ponumerowanych gradientów z boku tuby.
- Załóż nakrętkę i mieszaj przez odwrócenie, aż mieszanina się zhomogenizuje. Energiczne potrząsanie nie jest konieczne. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej w celu krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku długotrwałego przechowywania (>3 miesiące).
2. Wstępne przygotowania i liza komórek
- Przed rozpoczęciem ekstrakcji podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C i przygotuj wiadro na lód. Do każdej wyekstrahowanej próbki potrzebne będą trzy stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml. Trzy probówki będą używane do przechowywania komórki i osadu białkowego, końcowego wyekstrahowanego gDNA oraz supernatantów izopropanolu i etanolu.
- Pobrać próbki z magazynu i kilkakrotnie odwrócić próbki, a następnie wirować ze średnią prędkością przez 15 sekund.
- Dozować 2,5 ml próbki do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 5 ml roztworu do lizy komórek. Wymieszać próbkę 50 razy przez odwrócenie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
3. Usuwanie RNA
- Dodać 40 μl roztworu RNazy A o stężeniu 100 mg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
- Wyjąć próbkę z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i schłodzić na lodzie przez 3 minuty.
- Po inkubacji RNazy A zwiększyć temperaturę łaźni wodnej do 65 °C dla etapu rehydratacji DNA w protokole.
4. Usuwanie białek i lipidów
- Dodać 50 μl roztworu proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml, kilkakrotnie wymieszać przez inwersję i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Uwaga: Jest to możliwy punkt wstrzymania protokołu. Po dodaniu roztworu proteinazy K próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia ekstrakcji. Nie wykazano, aby przechowywanie w temperaturze 4 °C przez okres do 24 godzin miało znaczący wpływ na wydajność ekstrakcji lub jakość DNA. Długotrwałe przechowywanie na tym etapie nie zostało ocenione.
- Dodać 1,7 ml roztworu do wytrącania białek, energicznie wirować przez 20 sekund z dużą prędkością i umieścić na lodzie na 10 minut.
- Po schłodzeniu próbek na lodzie przez 10 minut, odwirować przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C. Wytrącone białka muszą uformować szczelną osadkę, aby kontynuować. Jeśli osad nie jest szczelny lub roztwór jest nadal mętny, próbki można schłodzić na lodzie jeszcze przez 5 minut i powtórzyć wirowanie. Próbki muszą być przechowywane na lodzie, aby zapewnić szczelne osady.
5. Izolacja i oczyszczanie gDNA
- Do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml odmierzyć pipetą 5 ml izopropanolu i 8 μl czystego roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/ml.
- Wlać supernatant zawierający gDNA z kroku 4.3 do probówki zawierającej roztwór izopropanolu i glikogenu, pozostawiając wytrącone osady białkowe. Po dodaniu supernatantu delikatnie wymieszać próbkę 50 razy przez odwrócenie i odwirować przez 30 minut w temperaturze 3 000 x g i w temperaturze 4 °C.
- Powoli wlewać supernatant do czystej probówki o pojemności 15 ml. Po usunięciu supernatantu dodać 1 ml 70% etanolu, aby umyć osad, kilkakrotnie powoli kołysząc i delikatnie przesuwając etanol po wytrąconym osadzie. Zatrzymać etanol w probówce.
- Po wstępnym przemyciu odwirować próbkę przez 1 minutę w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 20 °C. Ten etap wirowania może być przeprowadzony w temperaturze 4 °C lub 20 °C. Nie wykazano znaczącego wpływu temperatury na tym etapie.
- Po wstępnym przepłukaniu i odwirowaniu osadu, powoli wylać płuczkę etanolem z probówki i wyrzucić, a następnie wykonać drugie płukanie, powtarzając kroki 5.3 i 5.4.
- Po usunięciu supernatantu z drugiego przemycia, pozostawić granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut.
- Jeśli próbka nie wyschła całkowicie, suszyć na powietrzu przez kolejne 15 minut.
6. Rehydratacja gDNA
- Po wyschnięciu próbki dodaj 300 μl Tris-EDTA, aby ponownie uwodnić wysuszone granulki gDNA.
- Wirować próbkę przez 5 sekund ze średnią prędkością i umieścić w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 1 godzinę.
- Wyjąć próbki z łaźni wodnej i inkubować O/N w temperaturze RT.
UWAGA: Wszystkie użyte produkty i odczynniki są wymienione w Tabeli materiałów, a także w Tabeli 4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu określenia optymalnych parametrów ekstrakcji DNA przeprowadzono serię parzystych ekstrakcji DNA. Pojedynczą próbkę śliny podzielono, a każdą porcję przetestowano z jedną z dwóch możliwych wartości dla danej zmiennej. Wykonano co najmniej osiem powtórzeń każdego testu parzystego (np. pojedyncza próbka śliny została podzielona na aalikwoty w celu przetestowania ekstrakcji z początkową inkubacją w 50 °C oraz bez niej). Optymalizacja opierała się na czterech standardowych miernikach: całkowitej wydajności DNA...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecna procedura to zoptymalizowany protokół ekstrakcji DNA, który znacznie poprawił wydajność DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w porównaniu ze standardowymi metodami, bez uszczerbku dla jakości DNA. Krytycznym etapem, który miał największy wpływ na wydajność, był etap 5.2, który obejmuje dłuższy etap wirowania podczas wytrącania etanolu niż jakikolwiek opublikowany protokół omówiony tutaj, z wyjątkiem jednego, który nie był szeroko rozpowszechniony11. Nie wykryto żadnych zmian w jakości DNA związanych z tym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health R01 (wsparcie DC009453 dla CWB).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15 ml probówki wirówkowe | Fisher | 12-565-268 | |
| Roztwór do lizy komórek | Qiagen | 158908 | |
| Proteinaza K | Sigma | P6556 | |
| Roztwór do wytrącania białek | Qiagen | 158912 | |
| Izopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glikogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% etanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0,5 m) Roztwór | Fisher | 03-500-506 | |
| Dodecylosiarczan sodu | Fisher | BP166-100 | |
| Analogowy mikser wirowy | Fisher | 02-215-365 | |
| Wirówka 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Bibliografia
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
