Wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków

Podsumowanie

Ten protokół wideo demonstruje metodę badania wpływu płynu nasiennego na ślimaki, przy użyciu hermafrodytycznego ślimaka słodkowodnego Lymnaea stagnalis.

Streszczenie

Podczas wewnętrznego zapładniania zwierząt, płyn nasienny jest zwykle dodawany do plemników, tworząc razem nasienie lub ejakulat. Oprócz odżywiania i aktywacji plemników, składniki płynu nasiennego mogą również wpływać na fizjologię kobiety, zwiększając sukces zapłodnienia dawcy nasienia. Podczas gdy wiele badań wykazało takie efekty u gatunków o różnych płciach, niewiele badań dotyczyło tego u zwierząt hermafrodytycznych jednocześnie. Ten protokół wideo przedstawia metodę badania wpływu płynu nasiennego na ślimaki, wykorzystując jednocześnie hermafrodytycznego ślimaka słodkowodnego, wielkiego ślimaka stawowego Lymnaea stagnalis, jako organizm modelowy. Podczas gdy procedura jest pokazana przy użyciu kompletnych ekstraktów z gruczołu krokowego, poszczególne składniki (tj. białka, peptydy i inne związki) płynu nasiennego można przetestować w ten sam sposób. Wpływ przyjmowania składników ejakulatu na składanie jaj można określić ilościowo pod względem częstotliwości składania jaj i bardziej subtelnych szacunków wydajności reprodukcyjnej samic, takich jak liczba jaj w każdej masie jajowej. Wyniki pokazują, że białka płynu nasiennego wpływają na wydajność reprodukcyjną samic w tym jednoczesnym hermafrodycie, co podkreśla ich znaczenie dla doboru płciowego.

Wprowadzenie

Po przeniesieniu, plemnikom zazwyczaj towarzyszy płyn nasienny wytwarzany przez męskie gruczoły dodatkowe. Podczas gdy niektóre składniki ejakulatu odgrywają rolę w odżywianiu i aktywacji plemników¹, inne wpływają na fizjologię kobiety w celu zwiększenia powodzenia zapłodnienia dawcy^{nasienia 2-4}. Takie efekty są szczególnie selekcjonowane, poprzez dobór płciowy, gdy gatunek jest bardzo rozwiązły i ma efektywne magazynowanie plemników i trawienie plemników. W takich warunkach dawcy nasienia intensywnie konkurują o zapłodnienie komórek jajowych⁵. Chociaż istnieje wiele dowodów korelacyjnych na znaczenie substancji płynnych w nasieniu dla powodzenia zapłodnienia u mężczyzn, bezpośrednie dowody są rzadsze i niewiele badań zagłębiło się w szczegóły zmian fizjologicznych i / lub zaangażowanych substancji⁶.

U gatunków o odrębnej płci (tj. samce i samice; gonochoryści) istnieje kilka dobrze zbadanych gatunków modelowych, jeśli chodzi o skład płynu nasiennego i ich skutki. Przykładami są muszka owocowa Drosophila melanogaster⁶, komar malarii Anopheles gambiae⁷ i chrząszcz mączny Tribolium castaneum⁸. Takie badania płynów nasiennych są znacznie rzadsze, jeśli chodzi o gatunki, które są jednocześnie hermafrodytyczne (tj. osobniki są funkcjonalnie męskie i żeńskie w tym samym czasie), mimo że ten sposób rozmnażania jest powszechny w całym królestwie^zwierząt. Najbardziej godnym uwagi hermafrodytycznym przykładem przeniesienia substancji gruczołu dodatkowego jest prawdopodobnie strzelanie do tak zwanych strzałek miłosnych u ślimaków lądowych^2,10, gdzie substancja jest przenoszona przez dawcę nasienia poprzez iniekcję podskórną^11,12, tj. nie wraz z plemnikami. Istnieje jednak wiele jednoczesnych hermafrodytów, które przenoszą produkty męskich gruczołów akcesoryjnych wraz z plemnikami, takich jak zastosowany tutaj gatunek modelowy, wielki ślimak stawowy Lymnaea stagnalis. Wcześniejsze badania wykazały już, że otrzymanie płynu nasiennego wpływa na wydajność reprodukcyjną samic tego gatunku^13-15, a kilka z zaangażowanych białek płynu nasiennego zostało zidentyfikowanych^16,17.

Ogólnym celem tego protokołu, który jest rozszerzeniem metod opisanych w Koene et al¹⁶, jest przetestowanie wpływu białek płynu nasiennego na różne parametry składania jaj u ślimaków. Osiąga się to poprzez rozwarstwienie gruczołu krokowego (tj. męskiego gruczołu dodatkowego wytwarzającego płyn nasienny) izolowanych płciowo ślimaków dawców ze standaryzowanej hodowli laboratoryjnej. Po drugie, nasienie dawcy jest pobierane z pęcherzyków nasiennych i sporządzane są różne roztwory lecznicze. Następnie ślimaki testowe są znieczulane i wstrzykiwane dopochwowo roztwór testowy (na przykład sam ekstrakt z gruczołu krokowego, ekstrakt z gruczołu krokowego z nasieniem, samo nasienie, samo podłoże nośnikowe). Te testowe ślimaki są następnie monitorowane przez kolejne dni lub tygodnie, w standardowych warunkach, w celu zarejestrowania składania jaj. Masy jajowe są zbierane, skanowane cyfrowo w celu zliczenia i zmierzenia różnych parametrów, a następnie umieszczane w indywidualnych fiolkach do wylęgu. Po około dwóch tygodniach pisklęta są liczone i skanowane cyfrowo. Wszystkie skany, zarówno masy jaj, jak i piskląt, są następnie analizowane za pomocą bezpłatnego pakietu oprogramowania do analizy obrazu.

Do tego protokołu używany jest laboratoryjny szczep wielkiego ślimaka stawowego, Lymnaea stagnalis, który jest hodowany na Uniwersytecie VU w Amsterdamie. Gatunek ten służy jako system modelowy do badania pytań dotyczących doboru płciowego i rozmnażania u hermafrodytów. Stosunkowo duże rozmiary zwierzęcia sprawiają, że doświadczalnie jest ono bardzo dostępne. Ponadto, ponieważ jest używany jako gatunek modelowy w wielu dyscyplinach biologicznych, wiemy już dużo o podstawowej biologii tych zwierząt. Metoda ta pomoże w badaniu pytań dotyczących procesów doboru płciowego, w których pośredniczą białka płynu nasiennego. Ponadto, ponieważ są to jednoczesne hermafrodyty, możliwe jest ustalenie, czy takie białka działają w podobny i/lub różny sposób, jak u gatunków, w których płcie są rozdzielone^16,17.

Protokół

1. Obiekt hodowlany

1. Uzyskać dorosłe próbki Lymnaea stagnalis (L.) z hodowli laboratoryjnej, takiej jak ta na Uniwersytecie VU.
2. Utrzymywać wodę o niskiej zawartości miedzi na poziomie 20 °C zarówno w obiekcie hodowlanym (), jak i w zbiornikach doświadczalnych, które mają ciągłą wymianę wody.
3. Ustaw cykl jasny/ciemny na 12 godzin: 12 godzin.
4. Do hodowli karm dorosłe ślimaki sałatą wolną od pestycydów ad libitum, młode młode osobniki karm płatkami TetraPhyll (pokarm dla ryb). Utrzymuj ślimaki w oddzielnych zbiornikach w zależności od ich wieku, zaczynając od mas jajowych, które są składane w ciągu 24 godzin.
5. Po usunięciu ślimaków ze zbiorników hodowlanych nie są one zwracane, aby uniknąć skutków przetrzymywania w nieco innych warunkach, a także zapobiec pseudoreplikacji.

2. Sekcja

1. Izoluj ślimaki przez 1 tydzień i karm je ad libitum, aby upewnić się, że mają pełne zapasy nasienia i płynu nasiennego.
2. Przygotuj mikroskop stereoskopowy, płytkę separacyjną z szpilkami, małe nożyczki chirurgiczne, grube i cienkie kleszcze, strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną roztworem 50 mM MgCl₂, igły do wstrzykiwań (0,3 mm x 13 mm) i kilka ręczników papierowych.
3. Poddaj ślimaka eutanazji przez wstrzyknięcie roztworu MgCl₂ (zwykle 3 ml lub więcej w przypadku dorosłych ślimaków o długości skorupy 31,6 ± 2,1 mm i mokrej masie 2,89 ± 0,55 g). Wbić się w stopę igłą do wstrzykiwań pod kątem 45° i wstrzykiwać, delikatnie naciskając, w sposób ciągły, aż ślimak rozluźni się i pozostanie rozciągnięty (w ciągu kilku sekund). Wyjąć igłę do wstrzykiwań i sprawdzić, czy ślimak został poddany eutanazji (na przykład sprawdzając, czy nie ma odruchu wycofania macki).
4. Ostrożnie usuń skorupę zgodnie z jej krzywizną za pomocą grubych kleszczy. W połowie delikatnie odłącz mięsień kolumienkowy od skorupy, zeskrobując kleszczami. Delikatnie wykręć ślimaka z muszli, podążając za kierunkiem nawijania muszli.
5. Umieść ślimaka na płytce preparacyjnej i przypnij tylny koniec stopy. Następnie umieść szpilkę w głowie i napnij ślimaka, aby ułatwić sekcję.
6. Zlokalizuj żeńskie gonopory, które później będą punktem odniesienia do sekcji.
7. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i cienkich kleszczy wykonaj pierwsze nacięcie, tuż pod krawędzią płaszcza i przetnij w kierunku żeńskiego gonoporu. Gdy jedno z ostrzy nożyczek zostanie wepchnięte pod ścianę ciała, podnieś je lekko, aby upewnić się, że przecięta została tylko ściana ciała, a nie żaden z narządów wewnętrznych. Kontynuuj cięcie powyżej gonoporu w kierunku głowy i tnij w linii prostej.
8. Zlokalizuj gruczoł krokowy (tylny) i pęcherzyki nasienne (przedni). Dokładnie je rozbioruj i trzymaj na lodzie. Użyj ich do przygotowania roztworów testowych zawierających płyn nasienny i/lub plemniki. Jako podłoże nośnikowe należy stosować fizjologiczną sól fizjologiczną Lymnaea (5,83 mmol/L CaCl₂·2H₂O, 3,76 mmol/L MgCl₂·6H₂O, 42,69 mmol/L NaCl, 37,53 mmol/L KCl).
9. Zbierz płyn nasienny, który jest obecny w świetle gruczołu krokowego, a także plemniki z pęcherzyków nasiennych. Następnie zawiesić oba w soli fizjologicznej w oddzielnych fiolkach, delikatnie odciągając ich zawartość i usuwając tkankę narządu za pomocą kleszczy. Trzymaj na lodzie i zużyj tego samego dnia. Później wymieszaj te zawiesiny, aby stworzyć różne roztwory lecznicze.

3. Wstrzyknięcie dopochwowe

1. Przed rozpoczęciem procedury iniekcji dopochwowej należy przygotować silikonową otoczkę (dopasowaną do końcówki otoczki), strzykawki 1 mm, silikonową rurkę o średnicy 1 mm i średnicy 1 mm, stępione igły iniekcyjne (0,3 mm x 13 mm), grube kleszczyki i taką samą strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną roztworem 50 mM MgCl₂ wyposażoną w ostrą igłę do wstrzykiwań.
2. Zebrać plemniki, potrzebne do dodania do płynu nasiennego (lub pojedynczych białek płynu nasiennego) w niektórych zabiegach; biologicznie istotna dawka równa się 1/3 gruczołu krokowego i pęcherzyka nasiennego na wstrzyknięcie.
   UWAGA: W sekcji reprezentatywnych wyników (ryc. 1) przedstawiono wyniki eksperymentu z trzema różnymi metodami leczenia: kontrolą (podłoże nośnikowe, tj. sól fizjologiczna), samą owipostatyną (jednym ze zidentyfikowanych białek płynu nasiennego) i owipostatyną w towarzystwie plemników. Ponadto, aby oszacować biologicznie istotną dawkę u innych gatunków, należy określić różnicę w masie gruczołu krokowego osobników, które niedawno się kojarzyły, i osobników, które pozostały w izolacji płciowej¹⁶.
3. Przygotować strzykawki o pojemności 1 ml dla każdego z przygotowanych roztworów testowych. Napełnić każdą strzykawkę jednym roztworem i upewnić się, że w środku nie ma pęcherzyków powietrza.
4. Na każdej strzykawce należy umieścić igłę do wstrzykiwań.
5. Do wstrzykiwań należy użyć silikonowej rurki o średnicy 1 mm i minimalnej długości 10 cm.
6. Ostrożnie nasunąć silikonową rurkę na igłę do wstrzykiwań, uważając, aby nie przebić rurki, a następnie usunąć powietrze z rurki, delikatnie wywierając nacisk na strzykawkę.
7. Znieczulić ślimaka, postępując zgodnie z tym samym protokołem, co w ppkt 2.3. Tym razem należy upewnić się, że nie wstrzykujesz więcej niż 2-3 ml 50 mM MgCl₂.
8. Połóż ślimaka w foremce muszlowej, aby utrzymać go w stabilnej pozycji.
9. Zlokalizuj samicę gonopora, która jest wyraźnie widoczna jako biała plama po prawej stronie zwierzęcia, przed prawą macką i samcem gonopora (ta lokalizacja dotyczy również innych gatunków ślimaków słodkowodnych). Upewnij się, że masz niezakłócony dostęp.
10. Za pomocą kleszczyków przytrzymaj koniec rurki silikonowej i delikatnie włóż około 2-4 mm rurki silikonowej do żeńskiego gonopory.
11. Ostrożnie docisnąć strzykawkę i wstrzyknąć 0,03 ml roztworu testowego. Odczekaj pół minuty, aby ciśnienie w rurce rozprzestrzeniło się do przewodu pokarmowego kobiety przed wyjęciem rurki.
12. Ślimak poddany działaniu środka należy umieścić z powrotem w pojemniku izolacyjnym, gdzie można go monitorować, i pozwolić mu dojść do siebie po sedacji w zbiorniku doświadczalnym.

4. Test biologiczny

1. Oznacz każdego ślimaka w celu identyfikacji i zmierz długość jego muszli. Ten ostatni jest dobrym wskaźnikiem wielkości, co jest istotne przy ilościowym określaniu wydajności reprodukcyjnej.
2. Trzymaj każdego ślimaka oddzielnie w pojemniku o pojemności 460 ml, który jest perforowany, aby umożliwić wymianę wody w zbiorniku eksperymentalnym. Ważne jest, aby wszystkie pojemniki ustawić we właściwej orientacji, z perforacją w kierunku przepływu wody, aby umożliwić sprawną wymianę wody.
3. Podczas testu biologicznego regularnie karm ślimaki standardową ilością sałaty. Użyj okrągłego, metalowego dziurkacza do krojenia sałaty. W tym protokole używane są krążki sałaty o długości 19,6^cm2, co w przybliżeniu odpowiada ilości, jaką maksymalnie mogą zjeść w ciągu jednego dnia.
4. Zbierz masę jajową za pomocą płaskiej strony szpatułki i zeskrob masę jajeczną ze ścianki pojemnika. Użyj strony łyżki, aby zebrać masę jajeczną.
   UWAGA: Nieprzezroczyste masy jajowe, które właśnie zostały złożone, nie mogą być używane do skanowania (stają się przezroczyste w ciągu kilku godzin po złożeniu). W przypadku gatunku modelowego w tym protokole, Lymnaea stagnalis, codziennie sprawdzaj masę jaj, ponieważ produkują one 2-3 masy jaj tygodniowo. Może się to różnić u innych gatunków.
5. Zeskanuj zebrane masy jajowe cyfrowo, za pomocą komputera (laptopa) zawierającego sterownik skanera, skanera płaskiego, standardowej skali milimetrowej, szpatułki, płytek transferowych i płytek szklanych.
6. Umieść każdą masę jajeczną na płytkach do przenoszenia i powtarzaj, aż talerze będą pełne. Następnie wytrzyj masy jajowe do sucha na ręczniku papierowym i przenieś je na szklane płytki w tej samej kolejności, co na płytkach transferowych.
7. Odwróć każdą płytkę do góry nogami (masy jaj przykleją się do szklanej płytki) i ostrożnie umieść ją na skanerze płaskim, tuż pod skalą milimetrową. Zastosuj lekki nacisk, aby spłaszczyć masy jajowe, co spowoduje równomierne rozprowadzenie jaj, tak aby wszystkie były widoczne w tej samej płaszczyźnie ostrości. Dopasuj płytki za pomocą znormalizowanej ilości taśmy wokół dwóch krawędzi, aby upewnić się, że wszystkie jajka są równomiernie spłaszczone.
8. Dostosuj ustawienia skanera. Ważne jest, aby ustawić rozdzielczość do maksimum, wykonać podgląd skanu, przyciąć obszar roboczy oraz dostosować jasność i kontrast. Zeskanuj masy jajowe.
9. Umieść każdą masę jajową w oddzielnie oznakowanej szklanej fiolce o pojemności 20 ml w celu dalszego rozwoju i wylęgu.
10. Odświeżaj wodę w fiolkach wylęgowych co drugi dzień, aby była odpowiednio natleniona. Zrób to zgodnie z liczbą i wielkością piskląt w następującej kolejności: dekantacja/wylanie (brak piskląt), przelanie (początek wyklucia) i odciągnięcie wody pipetą (wiele piskląt).

5. Mierzenie i liczenie jaj

1. Zainstaluj bezpłatnie dostępne oprogramowanie do analizy obrazu ImageJ (NIH, USA) i wtyczkę licznika komórek.
2. Otwórz ImageJ, a także program arkusza kalkulacyjnego, do którego chcesz przenieść dane. Następnie otwórz zeskanowany obraz mas jajowych w ImageJ.
3. Ustaw skalę za pomocą narzędzia do powiększania, aby przejść do skali milimetrowej. Powiększ i dostosuj okno o 1 mm, aby wypełnić ekran. Narysuj linię za pomocą narzędzia Linia między dwiema liniami wskazującymi 1 mm. Przejdź do pozycji Analizuj i Ustaw skalę. W menu podręcznym pojawi się opcja zmierzonej długości, dostosuj Znana odległość do 1 i jednostkę długości na mm. Zaznacz pole Globalne i zamknij okno.
4. Ustaw preferowane wymiary (długość, szerokość, obwód), przechodząc do opcji Analizuj, a ustaw pomiary, wybierając opcję Obszar i Średnica Fereta (długość i szerokość). Kliknij przycisk OK, aby potwierdzić i kontynuować analizę obrazu.
5. Aby zmierzyć jaja, powiększ jajko o pierwszej masie jajowej, którą należy zmierzyć. Zalecany jest zoom 800%. Następnie, za pomocą narzędzia eliptycznego, narysuj owal dokładnie wokół jajka, naciśnij ctrl+D, aby narysować obwód na obrazie (aby zapobiec dwukrotnemu mierzeniu tego samego jajka). Następnie naciśnij ctrl+M, aby zapisać miarę właściwości owalu (długość, szerokość, obwód); Otworzy się wyskakujący ekran z wyświetlaniem Measurements.
   UWAGA: Stosowanie narzędzia eliptycznego do mierzenia jaj nie dotyczy wszystkich gatunków. W przypadku gatunków o jajach o niejednorodnym kształcie należy zamiast tego użyć selekcji odręcznej.
6. Zmierz tyle jaj, ile to konieczne, a następnie zapisz miary jako .xls arkuszu. Opcjonalnie skopiuj dane bezpośrednio do arkusza.
7. Następnie policz jajka w masie jajecznej, korzystając z okienka licznika i ręcznie wprowadź liczby do arkusza.
8. Alternatywnie, policz poszczególne jaja na masę jaj za pomocą wtyczki licznika komórek. W tym celu przejdź do Wtyczki, a następnie Analizuj i wybierz Licznik komórek. Pojawi się okno licznika komórek, zaznacz pole "zachowaj oryginał" i naciśnij "zainicjuj". Pojawi się nowe okno licznika, wybierz narzędzie krzyżyk z paska narzędzi i wybierz typ licznika z menu licznika komórek. Policz poszczególne jaja, klikając je w oknie licznika komórek. Obserwuj łączną liczbę obok typu licznika w menu licznika komórek. Skopiuj tę liczbę ręcznie do arkusza kalkulacyjnego lub uzyskaj wyniki, naciskając przycisk Wyniki.
9. Policz wiele mas jaj w jednym zliczaniu, dodając typy liczników, jeśli to konieczne.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia procent zwierząt składających jaja po wstrzyknięciu do pochwy substancji kontrolnej (soli fizjologicznej), owipostatyny lub owipostatyny wraz z plemnikami. N = 15 dla każdej grupy badawczej; szczegóły i statystyki znajdują się w pracy Koene et al.¹⁶ (Źródło: Rysunek 3 z publikacji Koene et al. 2010, PLoS ONE).

Rycina 1. Wpływ owipostatyny na produkcję mas jajowych u Lymnaea stagnalis. Wykres przedstawia procent zwierząt składających jaja po wewnątrzpochwowych zastrzykach substancji kontrolnej (soli fizjologicznej), owipostatyny lub owipostatyny wraz z plemnikami. N=15 dla każdej grupy; szczegóły i statystyki znajdują się w pracy Koene et al. 2010. Przedruk za zgodą Koene et al. 2010 PLoS ONE 5: e10117.

Dyskusja

Przedstawiony protokół pokazuje, w jaki sposób pobrać płyn nasienny i jak to przetestować w sposób biologicznie miarodajny. Chociaż ta procedura jest pokazana przy użyciu ekstraktu z gruczołu krokowego, działanie pojedynczego oczyszczonego białka płynu nasiennego można również przetestować zgodnie z tą samą procedurą. Oczywiście, w takich badaniach zawsze kluczowe jest uwzględnienie odpowiednich kontroli (zabiegów pozorowanych), aby upewnić się, że procedura i/lub podłoże nośne nie wpływają na parametry w pytaniach^14,16. Stosując tę metodę, wykazano już, że istnieje pojedyncze białko płynu nasiennego, a mianowicie Jajodatyna, która pośredniczy w zmniejszeniu nieśności jaj^14,16. Białko to, wytwarzane w gruczole krokowym i przenoszone podczas krycia wraz z plemnikami, stanowi pierwszy w pełni scharakteryzowany składnik płynu nasiennego w jednoczesnym hermafrodycie i jak dotąd nie wykazuje żadnego podobieństwa do znanych białek.

Odkrycie, że owipostatyna zmniejsza produkcję masy jajowej u biorcy, potwierdza wcześniejsze prace wskazujące, że substancje zawarte w nasieniu mogą wpływać na składanie jaj^13-15. Przenosząc biologicznie istotne ilości (patrz 3.2¹⁶), można przekonująco wykazać, że to białko płynu nasiennego, a nie obecność samych plemników, pośredniczy w obserwowanym zmniejszeniu składania jaj (ryc. 1). Biorąc pod uwagę, że wielokrotne otrzymywanie płynu nasiennego poprzez naturalne kojarzenie zwiększa inwestycję na jajo¹⁵, obecnie bardzo istotne staje się ilościowe określenie innych parametrów składania jaj. Przedstawiony protokół przewiduje obecnie niezbędne do tego metody. Chociaż nie stwierdzono wpływu owipostatyny na powodzenie wylęgu jaj złożonych przez biorcę¹⁶, mogą istnieć inne białka płynu nasiennego, które działają w zgodzie z tym białkiem. W związku z tym parametry, które należy określić ilościowo w tym kontekście - obok częstotliwości składania jaj i liczby jaj - obejmują wielkość jaj, czas wylęgu, rozwój piskląt i wielkość piskląt. Ponadto możliwe jest przyjrzenie się wpływowi na inne procesy żeńskie niż składanie jaj, takie jak przechowywanie i wykorzystanie nasienia, a także alokacja zasobów rozrodczych w kierunku funkcji żeńskiej i męskiej^14,17. Nie ulega wątpliwości, że przedstawiona metoda odgrywa zasadniczą rolę w rozwiązywaniu tych problemów następczych, zarówno w przypadku Lymnaea stagnalis , jak i innych ślimaków słodkowodnych.

Podsumowując, eksperymenty z wykorzystaniem tego protokołu pokazują, że przenoszone białka płynu nasiennego wpływają na wydajność rozrodczą samic biorcy w tych jednoczesnych hermafrodytach. Biorąc pod uwagę, że niewiele badań dotyczyło tego problemu, prawdopodobnie jest to znacznie bardziej powszechne w wewnętrznym zapładnianiu hermafrodytów, niż jest to obecnie odzwierciedlone w literaturze naukowej. Zwłaszcza, gdy zdamy sobie sprawę, że wykazano, iż prekopulacyjny wybór partnera i konkurencja plemników odgrywają ważną rolę w tych hermafrodytach¹⁴, co podkreśla potencjał takich męskich białek gruczołów dodatkowych do selekcji płciowej w tym systemie. Wreszcie, badania te pomagają wesprzeć rozwijający się pogląd, że białka płynu nasiennego mają takie samo znaczenie dla jednoczesnych hermafrodytów, jak dla gatunków o różnej płci.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płatki pokarmowe dla ryb	TetraPhyll
Mikroskop stereoskopowy
Małe nożyczki chirurgiczne	WPI
Kleszcze gruboziarniste i drobne
			10 ml
Igły iniekcyjne (0,3 mm x 13 mm)
50 mM MgCl2
5,83 mmol/L CaCl2· 2H2O
3,76 mmol/L MgCl2· 6H2O
42,69 mmol/L NaCl
37,53 mmol/L KCl
Dwuskładnikowe
Silicon	Sylgard
Rurka silikonowa (średnica 1 mm)
igły iniekcyjne (0,3 mm x 13 mm)
Probówki	Eppendorff
460 ml Pojemniki
Metalowy dziurkacz do liści (19,6 cm2)
Szpatułka/łyżka
(Laptop) komputer
Skaner
Skala	milimetrowa
Płytki przenoszące
Płytki szklane
Fiolki szklane

Strzykawka WPIstrzykawki 1 mm perforowanepłaski 20 ml