Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Summary

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Abstract

Elektroporacja cieszy się coraz większym zainteresowaniem w ostatnich latach, ponieważ jest to bardzo skuteczna technika fizycznego wprowadzania do komórek egzogennych sond molekularnych. W ramach tej pracy opisano platformę elektroporacji mikroprzepływowej zdolną do dostarczania wielu cząsteczek do komórek ssaków z precyzyjną i zależną od molekularności kontrolą parametrów. Zdolność systemu do izolowania ogniw o jednolitym rozkładzie wielkości pozwala na mniejsze różnice w wydajności elektroporacji w zależności od danego natężenia pola elektrycznego; w związku z tym zwiększona żywotność próbki. Co więcej, funkcja wizualizacji procesu pozwala na obserwację procesu wychwytu molekularnego fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym, co pozwala na szybką korektę parametrów dostarczania molekularnego in situ w celu zwiększenia wydajności. Aby pokazać ogromne możliwości opisywanej platformy, makrocząsteczki o różnych rozmiarach i ładunkach elektrycznych (np. Dekstran o MW 3 000 i 70 000 Da) zostały dostarczone do komórek przerzutowego raka piersi z wysoką wydajnością dostarczania (>70%) dla wszystkich badanych cząsteczek. Opracowana platforma dowiodła swojego potencjału do wykorzystania w rozszerzaniu dziedzin badawczych, w których korzystne mogą być techniki elektroporacji w układzie scalonym.

Introduction

W ostatnich latach wykorzystanie impulsów elektrycznych do ułatwienia cytozolowego dostarczania cząsteczek zewnątrzkomórkowych stało się atrakcyjnym sposobem manipulowania komórkami ssaków. ¹ Proces ten, znany również jako elektroporacja, odwracalnie przenika błonę komórkową, umożliwiając cząsteczkom z natury nieprzepuszczalnym dla błony dostęp do wewnątrzkomórkowego środowiska komórek. Ponieważ praktycznie każda cząsteczka może zostać wprowadzona do cytozolu przez tymczasowo utworzone pory w błonie dowolnego typu komórek za pomocą elektroporacji, technika ta została opisana jako bardziej powtarzalna, uniwersalna i bardziej wydajna niż inne metody, w tym podejścia za pośrednictwem wirusa, chemiczne i optyczne. ^2-3 Technika ta została wykorzystana do wprowadzenia cząsteczek fluorescencyjnych,4 ^{leków 5} i kwasów nukleinowych^6-7 przy jednoczesnym utrzymaniu komórek przy życiu i nienaruszonym. Biorąc pod uwagę te korzyści, elektroporacja została przyjęta jako powszechna technika laboratoryjna do transfekcji DNA, terapii genowej in vivo ⁸ i badań nad szczepieniami komórek. Jednak konwencjonalnym systemom elektroporacji nadal trudno jest jednocześnie osiągnąć praktyczną wydajność i żywotność w przypadku próbek o dużej niejednorodności wielkości, ponieważ natężenie pola elektrycznego wymagane do udanej elektroporacji jest ściśle skorelowane ze średnicą ogniwa. Co więcej, systemy te nie pozwalają na precyzyjną kontrolę wielu dostarczanych ilości molekularnych ze względu na zależność od masowego stochastycznego procesu dostarczania molekularnego. ⁹ Aby rozwiązać te problemy, wiele grup opracowało platformy elektroporacji mikroprzepływowej, oferujące zalety niższych napięć poracji, lepszej wydajności transfekcji, znacznego zmniejszenia śmiertelności komórek i zdolności do dostarczania wielu cząsteczek. ^10-13 Korzyści te były możliwe dzięki niewielkim rozmiarom mikroskalowych systemów elektroporacji, których długość podziałki elektrod wynosi submilimetry, co znacznie obniża napięcia wymagane do pomyślnego dostarczenia. Co więcej, te mikroskalowe systemy elektroporacji mogą osiągać równomierny rozkład pola elektrycznego i szybko rozpraszać wytworzone ciepło, co skutkuje zmniejszoną śmiertelnością komórek przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności dostarczania. Wykorzystanie przezroczystych materiałów w tych mikroczipach pozwala dodatkowo na obserwację procesu elektroporacji in situ w celu szybkiej modyfikacji parametrów. ^2,12 Jednak precyzyjna kontrola dawki oraz kontrola parametrów zależnych od molekularnych i komórkowych, wymagana w pojawiających się badaniach i zastosowaniach ^{terapeutycznych,6,14-16} nadal pozostaje nierozwiązana.

Ta praca przedstawia mikroprzepływowy system elektroporacji wspomagany wirami, zdolny do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do wcześniej wybranej identycznej populacji komórek docelowych. Ogniwa o jednolitym rozkładzie wielkości są izolowane przed elektroporacją przy użyciu wcześniej opisanego mechanizmu pułapkowania selektywnego pod względem wielkości. ^17-18 Dzięki jednolitemu rozkładowi wielkości uzyskano mniejsze różnice w wydajności elektroporacji i zwiększoną żywotność przy danym natężeniu pola elektrycznego. ¹⁹ Co więcej, ciągłe mieszanie uwięzionych komórek za pomocą wirów w mikroskali pozwoliło na równomierne dostarczanie cząsteczek przez cały cytozol, zgodnie z wynikami zgłoszonymi wcześniej przy użyciu innej platformy elektroporacji wspomaganej wirami. ²⁰ Aby wykazać, że system ten będzie miał zastosowanie do szerokiego zakresu cząsteczek powszechnie wykorzystywanych w zastosowaniach biologicznych, makrocząsteczki o szerokim zakresie mas cząsteczkowych dostarczono do komórek raka piersi z przerzutami. Ponadto, dzięki monitorowaniu procesów w czasie rzeczywistym, praca ta dostarcza więcej dowodów, które mogą położyć kres długotrwałej debacie na temat mechanizmu dostarczania molekularnego podczas elektracji, który jest głównie zapośredniczony przez elektroforezę, a nie za pośrednictwem dyfuzji. ¹⁴ W przeciwieństwie do innych systemów elektroporacji, platforma ta w unikalny sposób zapewnia połączone zalety precyzyjnego dostarczania wielu cząsteczek, wysokiej wydajności dostarczania molekularnego, minimalnej śmiertelności komórek, szerokiego zakresu rozmiarów i ładunków dostarczanych cząsteczek, a także wizualizacji procesu elektroporacji w czasie rzeczywistym. Biorąc pod uwagę te możliwości, opracowany system elektroporacji ma praktyczny potencjał jako wszechstronne narzędzie do badań nad przeprogramowaniem ^{komórek,6,14,21-22} zastosowań dostarczania leków^10,19 oraz zastosowań wymagających dogłębnego zrozumienia mechanizmów dostarczania molekularnego elektroporacji.

Protocol

1. Przygotowanie komórek

1. Płytka 1×10⁵ komórek/ml linii komórkowej przerzutowego raka piersi MDA-MB-231 w objętości 10 ml na kulturę tkankową kolba T75 w pożywce L-15 firmy Leibovitz uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.
2. Inkubować komórki MDA-MB-231 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 0% CO_{2 .}
3. Zbierz komórki do eksperymentów 2 dni po wysianiu, traktując komórki 0,25% trypsyną-EDTA przez 2 minuty i dezaktywuj aktywność enzymatyczną trypsyny, dodając 8 ml pożywki wzrostowej.
4. Granulki przez odwirowanie przez 5 minut przy 200 × g i ponowne zawieszenie w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS, 1x, bez Ca²⁺ i Mg²⁺) do końcowego stężenia 5 × 10⁵ komórek/ml.

2. Projektowanie i produkcja urządzeń

UWAGA: Maska, produkcja formy wzorcowej i proces zamykania mikrokanałów mają być prowadzone w czystym pomieszczeniu, podczas gdy proces odlewania mikrokanałów z polidimetylosiloksanu (PDMS) można przeprowadzić na zwykłym stole laboratoryjnym.

1. Zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe, jak pokazano na rysunku 1, za pomocą programu AutoCAD. Urządzenie powinno składać się z wlotu z wieloma portami wtryskowymi, filtrami zgrubnymi i dwoma równoległymi prostymi prostokątnymi kanałami inercyjnymi ogniskowania (L = 7 mm, W = 40 μm i H = 70 μm). Indywidualny kanał prosty składa się z 5 komór elektroporacyjnych, które są oddalone od siebie o 800 μm (W_C = 400 μm) z dwoma otworami przelotowymi na elektrody aluminiowe. Dwie poprzecznie przylegające komory elektroporacyjne dzielą otwór na elektrodę ujemną. Dwa proste kanały łączą się w wylot w dolnej części obszaru elektroporacji.
2. Przekonwertuj plik CAD z mikrowzorami na plik GDSII za pomocą programu LinkCAD. Napisz mikrowzory na półfabrykacie fotomaski o wymiarach 5 x 5 cali za pomocą laserowego edytora masek. Opracuj maskę, postępując zgodnie z protokołem producenta. UWAGA: Proces opracowywania maski obejmuje wywoływanie fotorezystu, trawienie chromu i usuwanie oporu. Alternatywnie, mikrowzory wydrukowane na przezroczystości o wysokiej rozdzielczości (>20 000 dpi) można kupić od zewnętrznego producenta i wykorzystać jako fotomaskę. Końcowe cechy mikroskali na fotomasce powinny być przezroczyste, aby pasowały do polaryzacji ujemnego fotorezystu.
3. Wykonaj odlew konstrukcji urządzenia przy użyciu standardowych technik miękkiej litografii²³ z ujemną powłoką fotorezystu na 4-calowej płytce krzemowej przy 2,000 obr./min, aby uzyskać ostateczną grubość 70 μm.
4. Wstępnie piecz wafel z ujemnym fotorezystem przez 20 minut w temperaturze 95 °C.
5. Skontaktuj maskę z waflem i wystaw na działanie źródła UV (17,4 mJ/^cm2) przez 80 sekund za pomocą nakładki na maskę.
6. Rozwijaj odsłoniętą płytkę przez 4 minuty w wywoływaczu SU-8.
7. Zmierz rozwiniętą grubość fotorezystu za pomocą profilometru powierzchniowego.
8. Rygorystycznie wymieszaj elastomer w stosunku 10:1 do utwardzacza (zestaw elastomerów silikonowych) i wlej mieszaninę na formę odlewniczą, aby wygenerować repliki PDMS. Odgazować elastomer odlewniczy przez 30 minut i utwardzić formę odlewniczą odgazowanym elastomerem w piecu w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.
9. Rozwarstwiona utwardzona replika PDMS z wzorami mikrokanalików z formy i otworami na wloty, wyloty i wkłucia elektrod za pomocą imadła kołkowego. UWAGA: Normalna średnica krawędzi skrawającej imadła sworzniowego powinna wynosić 0.76 mm, co jest wystarczające do szczelnego trzymania rurki PEEK (OD 1/32") i elektrod aluminiowych (OD 0.029") na miejscu.
10. Stwórz zamknięte kanały mikroprzepływowe, przyklejając repliki PDMS do szkiełka podstawowego poddanego działaniu myjki tlenowo-plazmowej na 7 sekund przy mocy częstotliwości radiowej i ciśnieniu parcjalnym tlenu wynoszącym odpowiednio 75 W i 500 mTorr.

3. Eksperymenty z przepływem

1. Włóż aluminiowe elektrody (średnica zewnętrzna 0.029") i rurkę wylotową PEEK (średnica zewnętrzna 1/32") w wyznaczone miejsca przez otwory w mikrokanaliku (patrz rysunek 3B).
2. Podłączyć sprzęt elektryczny¹⁸ odpowiedzialny za generowanie krótkich impulsów prostokątnych o wysokim napięciu do elektrod aluminiowych (patrz rysunek 3C), które stykają się z przepływającymi roztworami w formie PDMS. UWAGA: Sprzęt powinien składać się z generatora impulsów i zbudowanego we własnym zakresie wzmacniacza wysokiego napięcia. ^{Rozdział 18}
3. Przygotować cztery probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające pojedynczo DPBS, roztwory z komórkami i biomolekuły, a następnie przymocować każdą probówkę do odpowiedniego uchwytu na fiolki podłączonego do pneumatycznego układu kontroli przepływu (patrz rysunek 3A). ^{Rozdział 18}
4. Podłącz rurkę wlotową PEEK z uchwytów na fiolki do odpowiednich otworów wlotowych w urządzeniu mikroprzepływowym.
5. Ustaw wielkość impulsów fali prostokątnej, V, na 100 V, aby natężenie pola elektrycznego, E = V/L_e, w komorze elektroporacyjnej było równe 0,7 kV/cm. UWAGA: Tutaj L_e jest odległością między dwoma punktami, w których elektrody dodatnia i ujemna stykają się z przepływającym roztworem (patrz rysunek 1).
6. Ustaw regulator ciśnienia na 40 psi. UWAGA: Pojedyncze, ręcznie regulowane źródło azotu służy do równomiernego zwiększania ciśnienia we wszystkich fiolkach z próbkami, a kolektor o dużej prędkości jest wykorzystywany do terminowej aktywacji poszczególnych portów roztworu za pomocą niestandardowego oprogramowania LabVIEW. ^{Rozdział 18}
7. Aby sterować zaworem, otwórz niestandardowe oprogramowanie LabVIEW oznaczone jako Valve Runner i kliknij uruchom w menu rozwijanym zatytułowanym operate.
8. Włącz zawory, klikając każdą odpowiednią ikonę zaworu. UWAGA: Ikona zaworu powinna zmienić kolor na zielony, gdy jest aktywowany. Kliknięcie aktywnej ikony spowoduje dezaktywację i zamknięcie zaworu. Ikona zamkniętego zaworu powinna zmienić kolor na szary.
9. Otwórz zawór zbiornika DPBS (tj. roztworu myjącego), aby zalać prędkość przepływu wymaganą do stabilnego wytwarzania wirów zatrzymujących komórki przez 1.5 minuty.
10. Przełącz port roztworu aktywnego z roztworu myjącego na roztwór ogniwa, aby uwięzić ogniwa w komorze elektroporacyjnej na 30 sekund (tj. etap wychwytywania komórek).
11. Przepływaj zarówno roztwory myjące, jak i komórkowe jednocześnie przez urządzenie przez 10 sekund przed etapem wychwytywania komórek, aby zapewnić niezakłócony przepływ podczas etapu przełączania roztworu. UWAGA: Ten krótki krok współprzepływu należy powtarzać na każdym kroku zmiany rozwiązania.
12. Włącz port mycia i przepłucz urządzenie przez 20 sekund w celu usunięcia nieuwięzionych komórek zanieczyszczających.
13. Wstrzyknąć roztwór zawierający pierwszą cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania (0,2 mg/ml 3 000 Da obojętnych i anionowych cząsteczek dekstranu lub 1,5 mg/ml 70 000 Da obojętnych cząsteczek dekstranu) do urządzenia.
14. Zastosuj pięć krótkich impulsów (Δt = 30 ms w odstępach 2 sekund) natychmiast po wstrzyknięciu roztworu molekularnego i monitoruj wielkość i czas trwania zastosowanych impulsów elektrycznych w czasie rzeczywistym za pomocą oscyloskopu.
15. Powtórz krok 3.10 tyle razy, ile wynosi liczba dodatkowych cząsteczek do dostarczenia. Przy każdej dostawie molekularnej inkubuj komórki przez 100 s w roztworze molekularnym, a następnie przepłucz urządzenie roztworem myjącym przez 100 s, aby usunąć nadmiar cząsteczek.
16. Uwolnij komórki w 96-dołkowej płytce do dalszej analizy, obniżając ciśnienie robocze poniżej 5 psi. UWAGA: Z każdego uwolnienia pobiera się około 100 μl roztworu ze 100 komórkami.
17. Uruchom kroki eksperymentalne od 3.9 do 3.16 trzy razy, aby zebrać wystarczającą liczbę komórek do cytometrii przepływowej.
18. Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą przetworzone komórki przez 5 minut w temperaturze 228 × g.
19. Usunąć supernatant zawierający nadmiar cząsteczek fluorescencyjnych.
20. Ponownie zawiesić komórki w DPBS w celu analizy cytometrii przepływowej.
21. Ogniwa obciążnikowe w cytometrze przepływowym do analizy wydajności absorpcji molekularnej.

Results

Opracowany równoległy elektroporator mikroprzepływowy dostarczał makrocząsteczki o różnych rozmiarach i ładunkach elektrycznych do żywych komórek raka piersi z przerzutami. Pomyślne dostarczenie molekularne zostało jakościowo określone poprzez monitorowanie zmian intensywności fluorescencji elektroporowanych komórek orbitujących in situ i potwierdzone pomiarami ilościowymi za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Rysunek 4A pokazuje, że 90% leczonych komórek wychwytuje neutralny dekstran o war...

Discussion

Dzięki nowej, równoległej platformie do elektroporacji, oprócz wszystkich zalet, jakie zapewnia wcześniej opracowany system jednokomorowy, osiągnięto 10-krotne zwiększenie przepustowości i wydajności dostarczania wielu cząsteczek. ¹⁸ Wcześniej dostępne zalety obejmują (i) wstępne oczyszczanie komórek docelowych o jednolitym rozkładzie wielkości w celu zwiększenia żywotności, (ii) precyzyjną i indywidualną kontrolę dawki molekularnej oraz (iii) niski operacyjny prąd elektryczny. Znakowane fluorescencyjnie dekst...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 linia komórek nowotworowych	Amerykańska kolekcja kultur typu (ATCC)	HTB-26
Leibovitz' s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicylina-streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Cytometr przepływowy easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Tlenowy środek do czyszczenia plazmy Technics	Micro-RIE
Dektak 6M profilarka powierzchni	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 ELASTOMER SILIKONOWY ZESTAW	Dow Corning
Sprężony azot gazowy	Airgas	NI 300
Reduktor wysokiego ciśnienia	McMaster-Carr	6162K22
Reduktor wylotowy	McMaster-Carr	4000K563
Wyspa zaworowa o dużej prędkości 3/2-drożnej 8	Festo
Inline Idex	Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Rury poliuretanowe	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0,17" ID Rury poliuretanowe	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK	Rurki Festo	P1533
1/32" PEEK	Idex Zdrowie i Nauka	P1569
Złączki rurowe PEEK	Idex Zdrowie i nauka	P881
	Drut	8110A
	Firma Bob Martin	6061 ALUM
Oscyloskop	Agilent	DSO3062A
probówki wirówkowe 50 ml	VWR	21008-178
Probówka wirówkowa 15 ml	VWR	21008-216
T75 kolba hodowlana	VWR	82050-862
Dekstran, Tetrametylodamina, 3 000 MW, Anionowe	Gibco, Life Technologies	D3307
Dekstran, Tetrametylodamina, 70 000 MW, Neutralny	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutralny	Gibco, Life Technologies	D3329