Protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium

Podsumowanie

C. elegans pojawił się jako nowy model genetyczny do badania interakcji gospodarz-patogen. Tutaj opisujemy protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium w połączeniu z techniką interferencji dwuniciowego RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą.

Streszczenie

W ostatniej dekadzie, C. elegans pojawił się jako organizm bezkręgowy do badania interakcji między gospodarzami a patogenami, w tym obrony gospodarza przed bakterią Gram-ujemną Salmonella typhimurium. Salmonella powoduje trwałe zakażenie w jelicie C. elegans i powoduje przedwczesną śmierć zakażonych zwierząt. U C. elegans zidentyfikowano szereg mechanizmów odpornościowych w celu obrony przed zakażeniami Salmonellą. Wykazano, że autofagia, ewolucyjnie zachowany szlak degradacji lizosomalnej, ogranicza replikację Salmonelli u C. elegans i ssaków. Tutaj opisano protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium, w którym robaki są narażone na Salmonellę przez ograniczony czas, podobnie jak w przypadku zakażenia Salmonellą u ludzi. Zakażenie Salmonellą znacznie skraca żywotność C. elegans. Używając jako przykładu niezbędnego genu autofagii bec-1, połączyliśmy tę metodę infekcji z podejściem do żywienia C. elegans RNAi i pokazaliśmy, że ten protokół można wykorzystać do zbadania funkcji genów gospodarza C. elegans w obronie przed zakażeniem Salmonellą. Ponieważ dostępne są biblioteki RNAi całego genomu C. elegans, protokół ten umożliwia kompleksowe badanie przesiewowe genów C. elegans, które chronią przed Salmonellą i innymi patogenami jelitowymi, przy użyciu bibliotek RNAi całego genomu.

Wprowadzenie

Wolno żyjący nicień glebowy Caenorhabditis elegans jest prostym i genetycznie podatnym organizmem modelowym używanym do badania wielu zagadnień biologicznych. C. elegans występuje głównie jako samozapładniające się hermafrodyty. Samce są spontanicznie generowane przez brak dysjunkcji chromosomu X podczas gametogenezy^1,2. W obecności obfitości pożywienia C. elegans stale rozwija się przez cztery stadia larwalne do osobnika dorosłego. Temperatura wpływa również na rozwój C. elegans; Szybszy rozwój obserwuje się w wyższych temperaturach. W laboratorium C. elegans jest hodowany w standardowej temperaturze 20 °C na płytkach agarowych z wysiewaną bakterią Escherichia coli (szczep OP50) jako pokarmem^1,2.

W ostatniej dekadzie C. elegans pojawił się jako organizm bezkręgowy do badania interakcji gospodarz-patogen^3-5. W naturze C. elegans zjada bakterie jako źródło składników odżywczych^1,2. Jego normalny bakteryjny pokarm laboratoryjny, OP50, można łatwo zastąpić innymi patogenami w celu zbadania interakcji między C. elegans a dowolnym wybranym patogenem. W tych warunkach jelito jest głównym miejscem infekcji. Rzeczywiście, wykazano, że szeroka gama patogenów bakteryjnych śmiertelnie infekuje C. elegans^3-5.

Gram-ujemna bakteria Salmonella jest patogenem przewodu pokarmowego, który powoduje choroby przenoszone przez żywność u ludzi na całym świecie^6,7. C. elegans jest dobrym modelowym żywicielem dla Salmonella typhimurium, ponieważ bakteria ta replikuje się i wykazuje uporczywe infekcje jelitowe^8-10. C. elegans wykorzystano do identyfikacji zarówno nowych, jak i wcześniej znanych czynników wirulencji Salmonelli ¹¹. Co ciekawe, układ odpornościowy C. elegans skutecznie ogranicza replikację Salmonelli. Wcześniej donoszono, że hamowanie genów autofagii powoduje zwiększoną replikację Salmonelli u C. elegans, co skutkuje przedwczesną śmiercią zakażonych robaków¹⁰. Makroautofagia (zwana tutaj autofagią) to dynamiczny proces polegający na przegrupowaniu błon subkomórkowych w celu sekwestracji cytoplazmy i organelli w celu dostarczenia do lizosomu w celu degradacji¹². Doniesiono, że autofagia ogranicza replikację Salmonelli u C. elegans i ssaków^10,13.

Genom C. elegans był pierwszym wielokomórkowym genomem eukariotycznym zsekwencjonowanym; reaguje na leczenie RNAi^14-16. Co więcej, RNAi może być skutecznie podawane poprzez poddawanie robaków działaniu bakterii zawierających dwuniciowy RNA docelowego genu, znanego jako karmienie RNAi^16,17. Biblioteki odżywiania całego genomu RNAi zostały wygenerowane do badań przesiewowych RNAi całego genomu^16,18. W tym przypadku protokół zakażenia Salmonellą jest połączony z karmieniem RNAi, aby umożliwić testowanie genów C. elegans pod kątem ich zdolności do ochrony przed zakażeniem Salmonellą.

Protokół

1. XLD (Xyloza Lizyna Desoksycholan) Płytki agarowe

agar XLD jest selektywnym podłożem do hodowli Salmonelli, która pojawia się jako czarne kolonie na płytkach agarowych XLD. Jeśli jednak nie ma obaw o zanieczyszczenie, można zastąpić zwykłą płytę LB.

1. Odważyć 5,5 g agaru XLD i ponownie zawiesić w 5 ml wody dejonizowanej.
2. Dokładnie wymieszaj, aż cały agar będzie mokry. Dodaj 95 ml wody dejonizowanej, aż wszystkie grudki znikną, a podłoże zostanie całkowicie ponownie zawieszone.
3. Zagotuj pożywkę do całkowitego rozpuszczenia (nie sterylizuj w autoklawie).
4. Schłodzić podłoże w temperaturze pokojowej do 50 °C.
5. Wlać 25 ml agaru do każdej płytki o wymiarach 95 x 15 mm (średnica x wysokość) (płytki uszczelnione Parafilmem można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca).

2. Pożywka dla nicieni (NGM) Płytki do karmienia RNAi

Przygotowanie płytek NGM C. elegans zostało opisane wcześniej¹⁹. Tutaj pokrótce opisano procedurę dodawania antybiotyku ampicyliny i induktora chemicznego RNAi izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do pożywki NGM w celu wytworzenia płytek zasilających RNAi.

1. Rozpuść 3 g NaCl i 2,5 g peptonu Bacto w 1 l wody dejonizowanej.
2. Dodać 17 g agaru Bacto do podłoża
.
3. Autoklawować pożywkę przez 45 minut i schłodzić ją do temperatury 50 °C w łaźni wodnej.
4. Dodać następujące roztwory: 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w 95% etanolu), 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M_MgSO4 i 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH 6,0). Dobrze wymieszaj.
5. Dodać 1 ml 1 M IPTG i 500 μl ampicyliny (100 mg/ml w sterylnej wodzie).
6. Dobrze wymieszać roztwór i wlać go do płytek Petriego o wymiarach 60 x 15 mm (średnica x wysokość) za pomocą przystawki do pipetowania i pipety serologicznej o pojemności 25 ml zgodnie ze sterylnymi procedurami. Napełnij każdą płytkę 12 ml agaru. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.

3. Przygotuj zwierzęta leczone RNAi do infekcji

Niezbędny gen autofagii bec-1 jest używany jako przykład do zbadania funkcji genu gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą. Procedury doświadczalne przedstawiono na rysunku 1 i w tabeli 1. Poniżej przedstawiono protokół przygotowania zwierząt leczonych RNAi do zakażenia, przy czym dzień każdego etapu doświadczalnego podano w nawiasach.

1. Zaszczepić bec-1 RNAi żywiące się i kontrolować bakterie żywiące się pustym wektorem L4440 RNAi, umieszczając płatek zamrożonych bakterii o temperaturze -80 °C w 2 ml pożywki LB uzupełnionej 100 mg / ml ampicyliny (Dzień 1). Powtarzaj ten krok raz w tygodniu podczas całego eksperymentu, aby uzyskać świeże bakterie RNAi. Przechowywać kulturę w lodówce o temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana.
2. Wysiewaj 100 ml nocnej kultury bakteryjnej RNAi na płytkach RNAi. Przygotuj trzy płytki bec-1 RNAi i trzy kontrolne puste płytki wektorowe RNAi. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc (dzień 2).
3. Wyjąć płytki RNAi z inkubatora o temperaturze 37 °C i pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej na stole laboratoryjnym. Podnieś dobrze odżywione hermafrodyty L4 typu dzikiego N2 i przenieś je do bec-1 RNAi i kontroluj puste płytki RNAi wektora. Umieść trzy robaki na każdej płytce na trzech płytkach. Tego samego dnia należy przygotować płytki RNAi zgodnie z opisem w kroku 3.2 (Dzień 3).
4. Inkubować płytki RNAi z robakami w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez 36-40 godzin i przenieść robaki na świeże odpowiadające im płytki RNAi przygotowane w kroku 3.3. Po przeniesieniu robaków inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez 64 godziny (dzień 4).

4. Przygotuj Salmonellę na infekcję

1. Zamrożony bulion w temperaturze -80 °C rozprowadzić na 1 płytce agarowej XLD i inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez noc (dzień 5).
2. Wybrać dobrze wyizolowaną kolonię czarnej Salmonelli i zaszczepić ją w 2 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez noc (dzień 6).
3. Wysiewaj 80 ml nocnej kultury Salmonelli na 1 C. elegans 60 x 15 mm (średnica x wysokość) płytce agarowej NGM i przygotuj w sumie 6 płytek. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Kultura bakteryjna powinna wyschnąć i uformować trawnik na talerzu (dzień 7).

5. Zakażenie robaków leczonych RNAi Salmonellą

1. Przenieś hermafrodyty L4 N2 potraktowane bec-1 RNAi i kontroluj puste hermafrodyty L4 N2 potraktowane RNAi (potomstwo robaków ustawionych w kroku 3) na płytki Salmonelli. Umieść 40 robaków na talerzu na 3 talerzach dla każdej grupy. Inkubować płytki robaka w temperaturze 20 °C przez 48 godzin (dzień 7).
2. Przygotować jeden zestaw świeżych płytek RNAi zgodnie z opisem w krokach 3.1 i 3.2 (dzień 7 i dzień 8).
3. Po 48 godzinach zakażenia przenieść robaki zakażone Salmonellą na odpowiednie płytki RNAi przygotowane w kroku 5.2 i inkubować w temperaturze 20 °C (dzień 9).

6. Test przeżycia

1. Codziennie oceniaj przeżywalność robaków i przenoś robaki na świeże odpowiednie płytki RNAi w czasie składania jaj. Przygotować zestaw świeżych płytek RNAi przed każdym przeniesieniem robaka, jak opisano w krokach 3.1 i 3.2. Delikatnie dotknij korpusu ślimaka (głowa, środkowa część i ogon) spłaszczonym drutem platynowym na końcu. Robak jest oceniany jako martwy, jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu ciała robaka.
2. Oceniaj przeżywalność robaków codziennie lub co drugi dzień i przenoś robaki na świeże odpowiednie płytki RNAi dwa razy w tygodniu po tym, jak robaki przestaną składać jaja.
3. Po tym, jak wszystkie robaki umrą, zbierz dane dotyczące przeżycia z potrójnych płytek w jeden zestaw danych. Wprowadź dane dotyczące przeżycia każdej grupy do odpowiedniego oprogramowania statystycznego, takiego jak GraphPad Prism, aby wygenerować krzywe przeżycia i przeprowadzić analizę przeżycia Kaplana-Meiera. Cały eksperyment powtarza się co najmniej raz, aby potwierdzić wniosek.

Wyniki

W temperaturze 20 °C mediana czasu przeżycia nicieni N2 typu dzikiego wynosi 17 dni (Rycina 2A oraz Tabela 2). Infekcja Salmonella znacząco skraca medianę czasu przeżycia nicieni N2 do 10,5 dnia (p = 0,0002, test log-rank) (Rycina 2A).

Jeśli gen C. elegans odgrywa istotną rolę w obronie przed infekcją Salmonella, można przewidywać, że jego zahamowanie spowoduje podatność na infekcję Salmonella. W rzeczywisto...

Dyskusja

C. elegans jest prostym genetycznym organizmem modelowym, który zjada bakterie jako źródło składników odżywczych. W ten sposób łatwo jest zastąpić normalny pokarm bakteryjny patogenem jelitowym, aby zbadać interakcje między C. elegans a wybranym patogenem. W niniejszym artykule opisano protokół łączący zakażenie Salmonellą i leczenie żywieniem C . elegans RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą . Poprzednie protokoły infekcji narażały r...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB Bulion	Fisher	BP9723-500
Agar XLD	EMD Chemicals	1.05287.0500
Bacto Agar	Fisher	DF0140-01-0
Pepton	Fisher	BP1420-500
Chlorek sodu	Fisher	S671-500
Chlorek wapnia	Fisher	C69-500
Siarczan magnezu	Fisher	M65-500
IPTG	Gold Biotechnology	12481C50
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
Ampicillin		Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028
Petriego 95 x 15 mm	Fisher	FB0875714G
Szalka Petriego 60 x 15 mm	Fisher	08-757-13A
Pipeta serologiczna Falcon	Fisher	13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid	Inkubator	13-675-42
MaxQ6000	Inkubator Thermo Scientific	SHKE6000-7
	Percival	I-36DL

szalka do wytrząsania Fisher