C. elegans pojawił się jako nowy model genetyczny do badania interakcji gospodarz-patogen. Tutaj opisujemy protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium w połączeniu z techniką interferencji dwuniciowego RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ostatniej dekadzie, C. elegans pojawił się jako organizm bezkręgowy do badania interakcji między gospodarzami a patogenami, w tym obrony gospodarza przed bakterią Gram-ujemną Salmonella typhimurium. Salmonella powoduje trwałe zakażenie w jelicie C. elegans i powoduje przedwczesną śmierć zakażonych zwierząt. U C. elegans zidentyfikowano szereg mechanizmów odpornościowych w celu obrony przed zakażeniami Salmonellą. Wykazano, że autofagia, ewolucyjnie zachowany szlak degradacji lizosomalnej, ogranicza replikację Salmonelli u C. elegans i ssaków. Tutaj opisano protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium, w którym robaki są narażone na Salmonellę przez ograniczony czas, podobnie jak w przypadku zakażenia Salmonellą u ludzi. Zakażenie Salmonellą znacznie skraca żywotność C. elegans. Używając jako przykładu niezbędnego genu autofagii bec-1, połączyliśmy tę metodę infekcji z podejściem do żywienia C. elegans RNAi i pokazaliśmy, że ten protokół można wykorzystać do zbadania funkcji genów gospodarza C. elegans w obronie przed zakażeniem Salmonellą. Ponieważ dostępne są biblioteki RNAi całego genomu C. elegans, protokół ten umożliwia kompleksowe badanie przesiewowe genów C. elegans, które chronią przed Salmonellą i innymi patogenami jelitowymi, przy użyciu bibliotek RNAi całego genomu.
Wprowadzenie
Wolno żyjący nicień glebowy Caenorhabditis elegans jest prostym i genetycznie podatnym organizmem modelowym używanym do badania wielu zagadnień biologicznych. C. elegans występuje głównie jako samozapładniające się hermafrodyty. Samce są spontanicznie generowane przez brak dysjunkcji chromosomu X podczas gametogenezy1,2. W obecności obfitości pożywienia C. elegans stale rozwija się przez cztery stadia larwalne do osobnika dorosłego. Temperatura wpływa również na rozwój C. elegans; Szybszy rozwój obserwuje się w wyższych temperaturach. W laboratorium C. elegans jest hodowany w standardowej temperaturze 20 °C na pł....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. XLD (Xyloza Lizyna Desoksycholan) Płytki agarowe
agar XLD jest selektywnym podłożem do hodowli Salmonelli, która pojawia się jako czarne kolonie na płytkach agarowych XLD. Jeśli jednak nie ma obaw o zanieczyszczenie, można zastąpić zwykłą płytę LB.
- Odważyć 5,5 g agaru XLD i ponownie zawiesić w 5 ml wody dejonizowanej.
- Dokładnie wymieszaj, aż cały agar będzie mokry. Dodaj 95 ml wody dejonizowanej, aż wszystkie grudki znikną, a podłoże zostanie całkowicie ponownie zawieszone.
- Zagotuj pożywkę do całkowitego rozpuszczenia (nie sterylizuj w autoklawie).
- Schłodzić podłoże w temperaturze pokojo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W temperaturze 20 °C mediana czasu przeżycia nicieni N2 typu dzikiego wynosi 17 dni (Rycina 2A oraz Tabela 2). Infekcja Salmonella znacząco skraca medianę czasu przeżycia nicieni N2 do 10,5 dnia (p = 0,0002, test log-rank) (Rycina 2A).
Jeśli gen C. elegans odgrywa istotną rolę w obronie przed infekcją Salmonella, można przewidywać, że jego zahamowanie spowoduje podatność na infekcję Salmonella. W rzeczywisto.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
C. elegans jest prostym genetycznym organizmem modelowym, który zjada bakterie jako źródło składników odżywczych. W ten sposób łatwo jest zastąpić normalny pokarm bakteryjny patogenem jelitowym, aby zbadać interakcje między C. elegans a wybranym patogenem. W niniejszym artykule opisano protokół łączący zakażenie Salmonellą i leczenie żywieniem C . elegans RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą . Poprzednie protokoły infekcji narażały r.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy dr Diane Baronas-Lowell za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta była wspierana przez FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant oraz stypendium na starzenie się od Ellison Medical Foundation dla K.J.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| LB Bulion | Fisher | BP9723-500 | |
| Agar XLD | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Pepton | Fisher | BP1420-500 | |
| Chlorek sodu | Fisher | S671-500 | |
| Chlorek wapnia | Fisher | C69-500 | |
| Siarczan magnezu | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher BP1760-25 | ||
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petriego 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Szalka Petriego 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Pipeta serologiczna Falcon | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Inkubator | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 | Inkubator Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Percival | I-36DL |
Bibliografia
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
