Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Summary

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Abstract

Introduction

Obwody neuronalne hipokampa od dawna są przedmiotem intensywnych badań, zarówno w odniesieniu do anatomii, jak i fizjologii, ze względu na ich istotną rolę w uczeniu się i pamięci, a także nawigacji przestrzennej zarówno u ludzi, jak i gryzoni. Podobnie, wyraźna, ale prosta organizacja laminarna hipokampa sprawia, że region ten jest ulubionym przedmiotem badań dotyczących strukturalnych i funkcjonalnych właściwości sieci korowych.

Obwody hipokampa składają się z głównych komórek pobudzających (>80%) i mniejszej (10-20%), ale bardzo zróżnicowanej kohorty interneuronów hamujących>^1-3. Interneurony uwalniają kwas γ-aminomasłowy (GABA) ze swoich zakończeń aksonów, który działa na szybkie jonotropowe receptory_A, A, (GABA_{, A}, RS) i powolne metabotropowe receptory GABA_B (GABA_B, RS⁾⁴. Te mechanizmy hamujące równoważą pobudzenie i regulują pobudliwość głównych komórek, a tym samym ich czas i wzorzec wyładowania. Jednak GABA uwalniany z interneuronów działa nie tylko na główne komórki, ale także na same interneurony^5,6. Receptory pre- i postsynaptyczne pośredniczą w regulacji sprzężenia zwrotnego i hamujących wzajemnych interakcjach między różnymi typami interneuronów. Uważa się, że te mechanizmy hamujące w sieciach interneuronowych mają kluczowe znaczenie dla generowania i kształtowania wzorców aktywności populacji, w szczególności oscylacji o różnych częstotliwościach⁷.

Zapis na całej komórce jest dobrze znaną metodą badania wewnętrznych właściwości i interakcji synaptycznych neuronów. Jednak ze względu na dużą różnorodność typów interneuronów, badanie interneuronów hamujących wymaga rygorystycznej identyfikacji zarejestrowanych komórek. Ponieważ typy interneuronów hipokampa charakteryzują się odrębnymi cechami morfologicznymi i ekspresją markerów neurochemicznych, połączone badanie anatomiczne i immunocytochemiczne może zapewnić sposób na określenie precyzyjnej tożsamości interneuronów^6,8,9.

W niniejszym artykule opisujemy eksperymentalne podejście, w którym zapisy całokomórkowych kropek z pojedynczych neuronów lub par sprzężonych synaptycznie są łączone z wewnątrzkomórkowym znakowaniem, a następnie analizą morfologiczną i immunocytochemiczną post hoc, co pozwala na scharakteryzowanie powolnego GABA_B Efekty hamujące za pośrednictwem receptorów w zidentyfikowanych interneuronach. Jako przykład skupiamy się na jednym głównym typie interneuronu, podzbiorze tak zwanych "komórek koszyczkowych" (BC), który unerwia somę i proksymalne dendryty swoich celów postsynaptycznych i charakteryzuje się "szybkim wyładowaniem" (FS), aksonem gęsto pokrywającym warstwę ciała komórki i ekspresją białka wiążącego wapń parwalbuminy (PV)^10,11. Te interneurony wykazują duże postsynaptyczne prądy hamujące, a także wyraźną presynaptyczną modulację ich synaptycznego wyjścia w odpowiedzi na aktywację GABA_BR¹². Opisana tutaj kombinacja technik może być równie dobrze zastosowana do badania wewnętrznych lub synaptycznych mechanizmów w wielu innych zidentyfikowanych typach neuronów.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury i utrzymanie zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, niemiecką ustawą o dobrostanie zwierząt, dyrektywą Rady Europejskiej 86/609/EWG dotyczącą ochrony zwierząt oraz wytycznymi władz lokalnych (Berlin, T-0215/11)

1. Przygotowanie plastrów ostrego hipokampa

1. Weźmy transgenicznego szczura (w wieku od 17 do 24 dni), u którego dochodzi do ekspresji fluorescencyjnego białka Venus / YFP pod promotorem vGAT, który znakuje większość korowych interneuronów hamujących¹³. Odetnij głowę szczurowi. Szybko rozwarstwić mózg (<40 sekund) na częściowo zamrożony, karbogenny (95% O₂/5% CO₂) sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy na bazie sacharozy (sacharoza-ACSF, ryc. 1A).
2. Oceń wypreparowany mózg szczura pod kątem fluorescencji Wenus/YFP za pomocą lampy LED 505 nm i filtra emisyjnego 515, zamontowanych na goglach.
3. Usuń przednią trzecią część kory i móżdżku, a następnie oddziel półkule, wszystko za pomocą skalpela. Usuń grzbietową powierzchnię kory, aby zapewnić płaską powierzchnię do przyklejenia mózgu, jak opisano wcześniej^14.
4. Wytnij poprzeczne plastry (300 μm) formacji hipokampa na wibratomie, półkule powinny być otoczone częściowo zamrożoną, karbogeniczną sacharozą-ACSF (ryc. 1B)¹⁴. Usuń dodatkowe obszary kory rostralnej, śródmózgowia i pnia mózgu. Przenieść każdą cząstkę do zanurzonej komory zawierającej sacharozę-ACSF, która jest karbonogenowana i ogrzewana do 35 °C.
5. Pozostaw plastry do odzyskania w temperaturze 35 ºC na 30 minut od momentu, gdy ostatni plasterek wejdzie do ogrzanego ACSF. Zrób to, aby reaktywować procesy metaboliczne i ułatwić ponowne uszczelnienie przeciętych procesów neuronalnych. Następnie przenieś do temperatury pokojowej w celu przechowywania (rysunek 1C).

2. Produkcja i napełnianie pipet rejestrujących

1. Wyciągnij pipety z plastrami ze szklanych kapilar tak, aby po napełnieniu filtrowanym (filtr strzykawkowy, wielkość porów: 0,2 μm) uzyskać rezystancję pipet na poziomie 2-4 MΩ. Roztwór wewnątrzkomórkowy należy przechowywać schłodzony na lodzie, aby zapobiec degradacji jego składników.
2. Napełnij pipety z plastrami do identyfikacji prądów postsynaptycznych roztworem zawierającym fizjologicznie istotne niskie stężenie Cl^- (E_R(Cl-) = -61 mV; patrz lista roztworów).
3. W przypadku sparowanych zapisów w celu identyfikacji odpowiedzi za pośrednictwem receptora presynaptycznego, należy napełnić pipety plastrowe roztworem wewnątrzkomórkowym o niskiej pojemności buforowej Ca²⁺, aby zapobiec zakłóceniom presynaptycznego uwalniania nadajnika, a także 4-krotnie wyższym stężeniu Cl^- (E_R(Cl-) = -20 mV), aby poprawić stosunek sygnału do szumu obserwowanych IPSC⁵, umożliwiając dokładną ocenę reakcji farmakologicznej. Należy pamiętać, że zmiana stężenia Cl^- może zmienić kinetykę IPSC¹⁵.

3. Nagrywanie całej komórki z FS-INs

1. Skarbonować ACSF i wprowadzić go przez system perfuzyjny do komory rejestracyjnej za pomocą pompy perystaltycznej (która również usuwa ACSF z komory rejestracyjnej przez przewód ssący, rysunek 2A). Włącz wszystkie urządzenia w konfiguracji, przygotowując się do nagrywania.
2. Przenieś plasterek do komory nagraniowej i przytrzymaj w miejscu za pomocą platynowego pierścienia nawleczonego na pojedyncze włókna jedwabiu. Umieść plasterek tak, aby warstwa piramidalna CA1 przebiegała pionowo przez pole widzenia, umożliwiając dostęp za pomocą 2 pipet do zarówno str. radiatum, jak i str. oriens jednocześnie (ryc. 2C i 4A).
3. Umieścić komorę w zestawie i rozpocząć perfuzję karbonogenowanego i ogrzanego (32-34 ºC) rejestrującego ACSF przy natężeniu przepływu 5-10 ml/min.
4. Oceń jakość przekroju pod optyką IR-DIC przy 40-krotnym powiększeniu obiektywu i wizualizuj za pomocą kamery CCD wyświetlanej na wyświetlaczu. Załóżmy dobrą jakość wycinka, jeśli duża liczba okrągłych, umiarkowanie kontrastowych komórek piramidalnych CA1 (CA1 PC) jest widoczna w str. pyramidale na głębokości 20-30 μm poniżej gładkiej i lekko pokrytej kraterami powierzchni (Rysunek 2C). Plastry niskiej jakości zawierają dużą liczbę silnie skontrastowanych, skurczonych lub spuchniętych komórek, z nierówną powierzchnią plasterka.
5. Zidentyfikuj przypuszczalne interneurony FS w oświetleniu epifluorescencyjnym jako te wyrażające Wenus / YFP (ryc. 2B), z dużymi wielobiegunowymi somatami w lub w pobliżu str. pyramidale. Wybierz komórki odpowiednio głęboko w wycinku (50-100 μm, ryc. 2C), aby lepiej zachować ich integralność morfologiczną.
6. Zamontuj elektrodę rejestrującą w uchwycie na pipetę na głowicy, a następnie przyłóż niskie, dodatnie ciśnienie (20-30 mBar) przez przewód rurowy. Opuść pipetę na powierzchnię wycinka, lekko przesuniętą do środka wybranego neuronu.
7. Uzyskaj konfigurację zapisu całej komórki, jak opisano wcześniej^14,16 i patrz również rysunki 2D i 2E:
   1. Celowanie w komórkę: Zwiększ ciśnienie do 70-80 mBar i szybko opuść pipetę przez plasterek tuż nad somą wybranej komórki (Rysunek 2D, u góry).
   2. Zbliż się do komórki: Przyciśnij pipetę do błony komórkowej, aby uzyskać na niej "wgłębienie" (Rysunek 2D, góra). Wykonaj ten krok szybko, aby zapobiec znakowaniu biocytyny w sąsiednich komórkach.
   3. Stwórz uszczelnienie giga-omowe: Zwolnij ciśnienie i jednocześnie zastosuj polecenie napięcia 20 mV do pipety. Uszczelka giga-omowa (1-50 GΩ; Rysunek 2D, na dole i Rysunek 2E w środku) zwykle rozwija się szybko. Po uszczelnieniu zastosuj oczekiwany potencjał spoczynkowy membrany (zwykle od -70 do -60 mV) jako polecenie napięcia.
   4. Przebij się przez łatkę: Po uszczelnieniu rozerwij łatkę membrany krótkim impulsem podciśnienia, uzyskując w ten sposób konfigurację całej komórki (rysunek 2E, na dole).
8. Kompensacja pojemności całego ogniwa i rezystancji_szeregowej (RS). R_s wynosi zwykle 5-20 MΩ i jest stabilny do 120 minut. Porzuć komórki, jeśli potencjał błonowy (V_M) w momencie przebicia jest bardziej zdepolaryzowany niż -50 mV; R_S jest początkowo większe niż 30 MΩ; lub R_S zmienia się o więcej niż 20% w trakcie nagrywania.
9. Zidentyfikuj FS-IN na podstawie ich odpowiedzi (w trybie cęgów prądowych) na rodzinę hiper- do depolaryzujących impulsów prądowych (od -250 do +250 pA, rysunek 2F, u góry). FS-IN mają stosunkowo zdepolaryzowane V_M (zwykle od -50 do -60 mV), krótką stałą czasową membrany (<20 ms) i reagują na wstrzyknięcie prądu depolaryzującego 500 pA ciągiem potencjałów czynnościowych (AP) o częstotliwościach >100 Hz ¹¹ (rysunek 2F, na dole), które znacznie różnią się od tych w komputerach CA1 (rysunek 2F, środek).

4. Zewnątrzkomórkowa stymulacja elektryczna wywołująca reakcje za pośrednictwem GABA_BR

1. Aby zaobserwować reakcje wywołane synaptowo, należy umieścić elektrodę do stymulacji zewnątrzkomórkowej (pipetę punktową wypełnioną 2 M NaCl; Rezystancja: 0,1-0,3 MΩ) w warstwie na granicy str. radiatum i str. lacunosum-moleculare. Umieść elektrodę 200-300 μm bocznie od somy, aby zapobiec bezpośredniej stymulacji elektrycznej komórki i zminimalizować artefakty stymulacji (rysunek 3A).
2. Po umieszczeniu elektrody stymulacyjnej, uzyskaj zapis całej komórki wybranej komórki i oceń fenotyp fizjologiczny w trybie cęgów prądowych, jak w sekcji 3.9 (Rysunek 3B).
3. Z neuronem zapisanym w zacisku napięciowym (V_M -65 mV), dostarczaj elektryczną stymulację aksonów presynaptycznych przy napięciu 50 V (skuteczny bodziec ~500 μA) co 20 sekund, używając izolowanego stymulatora o stałym napięciu. Użyj pojedynczych bodźców (czas trwania 100 μs, ryc. 3C, u góry), aby obserwować IPSC za pośrednictwem GABA_BR i przeplataj się z ciągami wielu bodźców (przy 200 Hz), aby uzyskać większe uwolnienie nadajnika.
4. Do kąpieli stosuje się jonotropowych antagonistów receptora glutaminianu (receptor AMPA: DNQX [10 μM]; Receptor NMDA: d-AP5 [50 μM]) w celu ujawnienia izolowanego monosynaptycznego IPSC (ryc. 3C, środkowa górna). Dalej izolować IPSC za pośrednictwem GABA_BR za pomocą blokera GABA_AR (gabazyna [10 μM]; Rysunek 3C, środek, dolny).
5. Potwierdź, że wynikowy prąd spowolniony na zewnątrz (rysunek 3C niższy, rozszerzony) jest pośredniczony przez GABA_BR przez późniejsze zastosowanie CGP-55,845 [5 μM] (rysunek 3C niższy, pod szarym spodem)

5. Sparowane nagrania synaptycznie sprzężonych komputerów FS-IN i CA1

1. Oceń presynaptyczną kontrolę hamującej transmisji synaptycznej za pośrednictwem GABA_BR z jednoczesnymi zapisami, wykonywanymi między synaptycznie sprzężonymi parami IN i PC, jak opisano poniżej.
2. Najpierw ustal zapis całego komórkowego interneuronu presynaptycznego (jak w sekcji 3) i potwierdź fenotyp FS (ryc. 4A).
3. Następnie załataj sąsiedni komputer CA1 (odległość 20-100 μm, rysunek 4A) i zastosuj krótkie supraprogowe impulsy prądu depolaryzacyjnego (czas trwania 1 ms, amplituda 1-5 nA) do presynaptycznego IN (utrzymywanego w trybie cęgów prądowych) w celu wywołania AP. Jeśli obecne jest połączenie synaptyczne, AP w IN powodują IPSC w CA1 PC, utrzymywane w zacisku napięciowym (kompensują_{R S} do około 80%).
4. W razie potrzeby napełnij nową elektrodę rejestrującą i nagrywaj z kolejnych komputerów CA1, aż zostanie znalezione połączenie.
5. Po nawiązaniu połączenia wywołaj pary AP w presynaptycznym FS-IN, aby ocenić zarówno unitarną odpowiedź synaptyczną, jak i dynamiczne zachowanie. Użyj typowego protokołu sparowanych impulsów składającego się z 2 bodźców depolaryzujących w odstępie 50 ms (ryc. 4B).
6. Zbieranie śladów kontrolnych w warunkach bazowych. Następnie zastosuj selektywny agonista GABA_BR baklofen (10 μM) do perfekującego ACSF, aktywując w ten sposób GABA_BRs, a następnie antagonistę CGP-55,845 (5 μM), aby całkowicie zablokować działanie za pośrednictwem receptora. Zbierz ~50 śladów w stanie stacjonarnym każdego stanu leku (Rysunek 4B i C).
7. Po zakończeniu zapisu uszczelnij błonę somatyczną, tworząc łatkę na zewnątrz: Powoli wyjmij pipetę z korpusu komórki w zacisku V-clamp i wraz ze wzrostem R_S zmniejsz V_M do -40 mV. Zrób to, aby ułatwić tworzenie się łaty na zewnątrz; Następnie wyjmij pipetę z wanny.

6. Analiza właściwości elektrofizjologicznych

1. UWAGA: Dostępnych jest wiele różnych pakietów oprogramowania do pozyskiwania danych elektrofizjologicznych. W tym przypadku używany jest WinWCP, program Windows w darmowym pakiecie Strathclyde Electrophysiology Software, który umożliwia nagrywanie do 16 analogowych kanałów wejściowych i wyprowadzanie 10 sygnałów cyfrowych.
2. Filtr dolnoprzepustowy wszystkie dane przy 5-10 kHz i próbka przy 20 kHz.
3. Analizuj dane fizjologiczne za pomocą pakietu do analizy off-line.
   UWAGA: W tym przypadku używany jest Stimfit, pakiet oprogramowania typu open source, który zawiera powłokę Pythona; Jednak zamiast tego można łatwo zastosować inne alternatywy.
   1. Analizuj pasywne właściwości błony zarejestrowanych neuronów, nabyte w zacisku prądowym, ze spoczynkowego potencjału błonowego.
   2. Zmierz średni spoczynkowy potencjał błony od linii podstawowej zarejestrowanych odpowiedzi od początku zapisu.
   3. Oblicz rezystancję wejściową, korzystając z prawa Ohma, od odpowiedzi napięciowej na najmniejsze impulsy prądu hiperpolaryzacyjnego (≤ -50 pA). Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, uśrednij wiele ścieżek. Uwaga: nasze przykłady to zazwyczaj średnie z 10-50 pojedynczych przeciągnięć.
4. Oszacuj pozorną stałą czasową błony, dopasowując krzywą monowykładniczą do zaniku odpowiedzi na najmniejsze impulsy prądu hiperpolaryzacyjnego.
5. Przeanalizuj przebieg potencjału czynnościowego, aby określić próg, amplitudę (od progu do szczytu) i czas trwania (szerokość mierzoną w połowie wysokości) wywołane przez impulsy prądu depolaryzującego na poziomie progowym.
6. Analizuj IPSC za pośrednictwem GABA_IRz nagrań cęgów napięciowych. Przefiltruj ślady off-line przy 500 Hz (filtr Gaussa) i oceń szczytową amplitudę i opóźnienie odpowiedzi za pośrednictwem GABA_BR (średnio co najmniej 10 śladów).
7. Wykryj wpływ GABA_BRs na hamującą produkcję IN jako zmianę amplitudy piku IPSC za pośrednictwem GABA_AR, mierzoną między szczytem a poprzednią linią wyjściową. Obliczyć średnią amplitudę ze śladów ≥50 dla okresu kontrolnego i stanu ustalonego wszystkich epok farmakologicznych.

7. Wizualizacja i immunocytochemia FS-Ins

1. Po nagraniach utrwalić plastry przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie z 0,1 M buforem fosforanowym (PB, pH = 7,35) O/N w temperaturze 4 °C.
2. W razie potrzeby plastry można przenieść do PB i przechowywać do ~1 tygodnia przed przetworzeniem.
3. Plastry myć obficie w świeżym PB, a następnie w 0,025 M PB z 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35).
4. Aby zmniejszyć nieswoiste wiązanie przeciwciał, należy zablokować plastry na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze zawierającym 10% normalnej surowicy koziej (NGS), 0,3% Triton-X100 (detergent do przepuszczalności błon) i 0,05% NaN₃, uzupełnione w PBS.
5. Aby oznaczyć ekspresję PV, należy użyć mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-PV rozcieńczonego w roztworze zawierającym 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN₃ w PBS. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C¹². Dokładnie opłucz plastry w PBS.
6. Zastosować fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe przeciwko myszom (np. Alexafluor-546) wraz z białkiem wiążącym biotynę streptawidyną, sprzężonym z fluorochromem (np. Alexafluor-647); i inkubować w roztworze zawierającym 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN₃, rozcieńczony w PBS i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
7. Obficie opłucz plastry 2-3x PBS, a następnie 2-3 płukania w PB. Zamontuj plastry na szkiełkach podstawowych. Użyj przekładki agarowej 300 μm, aby zapobiec zapadaniu się plasterka. Plastry szkiełka nakrywkowego z fluorescencyjnym medium montażowym i uszczelnić lakierem do paznokci.

8. Obrazowanie i rekonstrukcja wizualizowanych FS-Ins

1. Wizualizacja wycinków za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego, z reporterem fluorochomowym wzbudzonym odpowiednią linią laserową (laser diodowy 635 nm dla Alexafluor-647; Hel-neon 543 nm dla znakowania Alexafluor-546 dla PV i Argon 488 lub 515 nm dla Wenus/YFP).
2. Rób zdjęcia w odpowiedniej rozdzielczości Z (zwykle co 0,5-1 μm, używając obiektywu 20X), aby utworzyć stos Z całej komórki. Do zobrazowania całej komórki zwykle wymaganych jest wiele stosów, które można cyfrowo zszyć w trybie off-line za pomocą oprogramowania FIJI/ImageJ (rysunek 5A).
3. Zrekonstruuj komórkę ze zszytego stosu obrazów za pomocą półautomatycznej metody śledzenia (wtyczka Simple Neurite Tracer w pakiecie oprogramowania FIJI/ImageJ¹⁷, rysunek C).
4. Na koniec oceń immunoreaktywność PV interneuronu za pomocą soczewki obiektywowej o wysokiej aperturze numerycznej (60-krotne zanurzenie w krzemie, NDA = 1,3). Wykonaj obrazy somy, dendrytów proksymalnych i aksonu proksymalnego lub alternatywnie zakończeń aksonów, jeśli wymywanie somatyczne PV jest zbyt silne. Komórki uważa się za immunoreaktywne dla PV, jeśli zaobserwowano, że znakowanie immunologiczne jest zgodne ze strukturami znakowanymi biocytyną (Figura 5B).

Results

Pod warunkiem, że jakość slice jest znacznie dobra, nagrywanie zarówno z komputerów CA1, jak i FS-INs może być osiągnięte z minimalnym trudem. Transgeniczna linia szczurów wykazująca ekspresję Wenus / YFP pod promotorem vGAT¹³ nie identyfikuje jednoznacznie FS-IN, a nawet BC. Jednak nagrania z IN w i wokół str. pyramidale, gdzie gęstość FS-IN jest zwykle wysoka¹, skutkują wysokim prawdopodobieństwem wyboru FS-IN (ryc. 2B). FS-IN można odróżnić po charakterystycznych właściw...

Discussion

Opisujemy metodę, która łączy techniki elektrofizjologiczne i neuroanatomiczne w celu funkcjonalnego scharakteryzowania morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych neuronów in vitro; w szczególności różne rodzaje korowych inhibitorów IN. Kluczowe aspekty procedury to: (1) wstępna selekcja potencjalnych IN; (2) zapis wewnątrzkomórkowy i wizualizacja neuronów; i wreszcie (3) analiza morfologiczna i immunocytochemiczna zarejestrowanych IN. Chociaż badanie to dotyczyło w szczególności PV-IN, opisany protokół może być ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgeniczne szczury			patrz Uematsu , et al., 2008
Gogle Venus (515 nm)	BLS Ltd., Węgry
Narzędzia do preparacji	i.e. FST		Do usuwania mózgu
Vibratome	Leica	VT1200S	Lub inny wysokiej klasy wibratom z minimalnymi oscylacjami pionowymi
Trzymanie plasterków komory	Wykonane na zamówienie w laboratorium
			CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		Alternatywnie 2x wzmacniacze Axopatch 200B
Oprogramowanie do akwizycji WinWCP	John Dempster, Strathclyde University		Można użyć dowolnego oprogramowania do akwizycji wysokiej jakości, tj. EPHUS, pClamp, Igor itp.
Ściągacz elektrod	Sutter	P-97	Używany ze
szklaną pipetą borokrzemianową	Hilgenberg, Niemcy	1405020	2 mm zewnętrzna, 1 mm średnica wewnętrzna, bez filamentu
Pompa perystaltyczna	Gilson	Minipuls	Zamiast tego można użyć innych pomp lub zasilania grawitacyjnego
Termometr			Wykonany na zamówienie
manometr cyfrowy	Supertech, Węgry
Izolowany stymulator stałego napięcia	Digitimer Ltd.	DS-2A
Biocytin	Invitrogen	B1592	Znany również jako ε-Biotinoyl-L-Lizyna
DL-AP5(V) sól disodowa	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX sól disodowa	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternatywnie NBQX lub CNQX
Gabazyna (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternatywnie metycodek bicukuliny
R-baklofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 chlorowodorek	Tocris	1248
Streptawidyna 647	Invitrogen	S32357
mysie przeciwciało monoklonalne anty-PV	Swant, Szwajcaria	235	Stężenie robocze 1:5 000-1:10 000
przeciwciało wtórne przeciwko myszy	Invitrogen	A11030	W przypadku stosowania gryzoni Venus lub GFP zaleca się stosowanie kanału czerwonego (tj. 546 nm).
Normalna surowica kozia	Vector Labs	S-1000
Szkiełka mikroskopowe			Dowolna marka wysokiej jakości
Szkiełka			Zwykle 22 x 22 mm
Przekładki agarowe			Blok agarowy, cięty na wibratomie do 300 μ m
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Olympus, Japonia	Fluoview FV1000	Lub inny porównywalny system
Fidżi (Fidżi to tylko ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji		Patrz Schindelin et al., 2012