Artykuł metodologiczny

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

DOI:

10.3791/51710

⸱

18 października 2014

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej technice, komórki są hodowane na szkiełku podstawowym, które jest częściowo pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO), przezroczystym, przewodzącym prąd elektryczny materiałem. Różne cząsteczki, takie jak peptydy lub oligonukleotydy, mogą być wprowadzane do zasadniczo 100% komórek w sposób nietraumatyczny. Tutaj opisujemy, w jaki sposób można je wykorzystać do badania komunikacji międzykomórkowej, węzłowej. Żółcień lucyfera wnika do komórek, gdy impuls elektryczny, przyłożony do przewodzącej powierzchni, na której rosną, powoduje tworzenie się porów przez błonę komórkową. To jest elektroporacja. Komórki rosnące na nieprzewodzącej powierzchni szkła bezpośrednio przylegającej do elektroporowanego obszaru nie pobierają żółtego Lucyfera przez elektroporację, ale pozyskują barwnik fluorescencyjny, gdy jest on do nich przekazywany przez złącza szczelinowe, które łączą je z elektroporowanymi ogniwami. Wyniki transferu barwnika z komórki do komórki można obserwować pod mikroskopem przy oświetleniu fluorescencyjnym. Technika ta pozwala na precyzyjne ilościowe określenie komunikacji na skrzyżowaniach szczelinowych. Ponadto może być stosowany do wprowadzania peptydów lub innych cząsteczek nieprzepuszczalnych, a przenoszenie małych elektroporowanych peptydów przez złącza szczelinowe w celu zahamowania sygnału w sąsiednich, nieelektroporowanych komórkach jest potężną demonstracją hamowania sygnału.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przyłożenie prądu elektrycznego do komórki powoduje powstawanie porów na błonie komórkowej w procesie zwanym elektroporacją. Pory umożliwiają przechodzenie przez błonę różnych niepermeanowanych cząsteczek. Pole elektryczne może być precyzyjnie kontrolowane, dzięki czemu powstałe pory są bardzo małe i szybko się zamykają, przy minimalnym zakłóceniu fizjologii komórkowej. Co ciekawe, przylegające komórki mogą być hodowane na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny (ITO) i elektroporowane in situ, czyli na powierzchni, na której rosną, bez odłączania w celu elektroporacji w zawiesinie. Komórki mogą bardzo dobrze rosnąć na tej powierzchni, a ponieważ są przyczepione i przedłużone, możliwa jest szczegółowa obserwacja mikroskopowa. Korzystając z tej techniki, małe cząsteczki niepermeanizowane mogą być wprowadzane natychmiast i zasadniczo do 100% komórek, co sprawia, że technika ta jest szczególnie odpowiednia do badań nad aktywacją składników szlaku po stymulacji receptora ligandem (omówione w1).

Elektroporacja była najczęściej używana do wprowadzania DNA (zwana również elektrotransfekcją). Jednak elektroporacja in situ może być cenna dla wprowadzenia wielu różnych cząsteczek, takich jak peptydy2-4, oligonukleotydy, takie jak antysensowne RNA, dwuniciowe oligonukleotydy wabiące DNA hamujące wiązanie czynników transkrypcyjnych lub siRNA3,5,6, radioaktywne nukleotydy7-10, białka1112 lub proleki13. Po elektroporacji komórki mogą być poddawane lizie do analiz biochemicznych lub utrwalane i barwione przeciwciałami.

Przewodząca powłoka ITO jest bardzo cienka, 800-1000A, dzięki czemu wzrost komórek nie jest zakłócany przez różnicę wysokości dwóch powierzchni, ponieważ komórki rosną na krawędzi powłoki przewodzącej. Ma to tę zaletę, że ogniwa nieelektroporowane mogą być hodowane obok ogniw elektroporowanych, które służą jako kontrole. To samo podejście można zastosować do badania komunikacji międzykomórkowej (GJIC), jak opisano w filmie.

Połączenia szczelinowe to kanały łączące wnętrza sąsiednich komórek14. Komunikacja międzykomórkowa w szczelinie odgrywa ważną rolę w tworzeniu guza i przerzutach, podczas gdy onkogeny, takie jak Src, hamują GJIC15,16. Aby zbadać GJIC, barwnik fluorescencyjny, taki jak żółty Lucyfer (LY), jest często wprowadzany do hodowanych komórek poprzez mikroiniekcję lub skrobanie17, a dyfuzja barwnika do sąsiednich komórek jest obserwowana pod mikroskopem w świetle fluorescencyjnym. Techniki te jednak niezmiennie powodują uszkodzenie komórek. Opisujemy teraz technikę, w której komórki są hodowane na szkiełku podstawowym, które jest częściowo pokryte ITO18. Impuls elektryczny został zastosowany w obecności LY (lub innych barwników) powodując jego wnikanie do komórek rosnących na przewodzącej części szkiełka, podczas gdy migrację barwnika do sąsiednich, nieelektroporowanych komórek obserwowano mikroskopowo poprzez oświetlenie fluorescencyjne. Aby uniknąć zakłócania wrażliwych ogniw, które mogą mieć tendencję do odłączania się od monowarstwy, zaprojektowano zespół, który nie wymagał umieszczania elektrody na ogniwach w celu doprowadzenia prądu elektrycznego19. Podejście to oferuje możliwość ilościowego oznaczania GJIC w dużej liczbie komórek, bez żadnych wykrywalnych zaburzeń metabolizmu komórkowego, na co wskazuje brak wpływu na długość fazy G1 po stymulacji surowicy12, wzrost poziomów białka protoonkogenu fos (Raptis, niepublikowane) lub dwóch kinaz związanych ze stresem komórkowym, świnia p38 lub kinaza JNK/SAPK1. Podejście to umożliwiło zbadanie związku między poziomami ekspresji onkogenu, transformacji i GJIC18, a także wpływu Src i Stat3 na GJIC w różnych typach komórek, w tym w komórkach świeżo wyhodowanych z próbek guza płuc20-23. Ponadto, elektroporacja in situ z opisanym układem, który nie ma górnej elektrody, została z powodzeniem zastosowana do wykazania zamknięcia złącza szczelinowego po różnicowaniu adipocytarnym, chociaż przyłączenie komórkowe do podłoża jest na tym etapie zmniejszone19,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Powlekanie komórek w komorach elektroporacyjnych

  1. W kapturze z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki przy użyciu sterylnej techniki, jak zwykle.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przez odwirowanie usunąć wszelkie ślady trypsyny, ponieważ mogą one utrudniać rozprzestrzenianie się komórek na szkle, stąd powstawanie adherenów i połączeń szczelinowych.
  2. Odpipetować 1 ml zawiesiny komórek w sterylnych komorach do elektroporacji wyposażonych w elektroporator in situ (rysunek 1) i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 oCi temperaturze 37 oC.
    UWAGA: Adhezja komórek może być poprawiona poprzez powlekanie fibronektyną, kolagenem, polilizyną lub klejem komórkowym i tkankowym (patrz tabela materiałów).
  3. Kiedy komórki utworzą zlewającą się warstwę, są gotowe do badania GJIC.

2. Procedura elektroporacji

Elektroporacja do badania GJIC może być przeprowadzona na zewnątrz okapu laminarnego, ponieważ trwa tylko kilka minut. Jeśli do konkretnego eksperymentu wymagane są dłuższe czasy inkubacji, można je przeprowadzić w całości w okapie z przepływem laminarnym. We wszystkich przypadkach komory, w których hodowane są komórki, muszą być sterylne.

  1. Przygotuj 5 mg/ml żółtego roztworu Lucyfer: Rozpuść 10 mg proszku LY (dostarczonego z elektroporatorem) w 2 ml pożywki bezwapniowej. W przypadku eksperymentów, które wymagają dłuższego czasu inkubacji, przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze 4oC.
  2. Odessać pożywkę wzrostową i umyć komórki pożywką bezwapniową, uważając, aby nie zarysować monowarstwy ani nie wysuszyć komórek. Jeśli komórki są wysuszone, zwykle mają ciemniejsze jądra i odbierają LY bez elektroporacji. Efekt ten jest bardziej wyraźny w środkowej części szkiełka, która jest bardziej narażona na przeciągi powietrza (ryc. 4F).
  3. Za pomocą pipetora Eppendorf odpipetuj roztwór barwnika do komórek (400 μl na całą komorę) na krawędzi komory, uważając, aby nie dotknąć warstwy komórek.
  4. Umieść komorę w uchwycie dostarczonym z elektroporatorem i zastosuj impuls o odpowiedniej sile (patrz Dyskusja).
  5. Ostrożnie odessać część roztworu LY. Można go ponownie użyć do mniej ważnych eksperymentów.
  6. Dodaj bezwapniowy DMEM zawierający 10% biolizowanej surowicy.
  7. Inkubować komórki przez 3-5 minut w inkubatorze, aby umożliwić transfer barwnika przez połączenia szczelinowe.
    UWAGA: Włączenie dializowanej surowicy w tym momencie pomaga w zamknięciu porów.
  8. Umyj niewbudowany barwnik bezwapniowym DMEM do obserwacji żywych komórek. Alternatywnie, komórki można utrwalić na tym etapie, poprzez dodanie 4% formaldehydu do studzienki, a następnie przemyte PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami). We wszystkich przypadkach pranie musi usunąć całe tło.
    UWAGA: We wstępnych eksperymentach mających na celu określenie optymalnych warunków, jeśli napięcie jest zbyt niskie, można pozwolić komórkom zregenerować się w inkubatorze przez kilka minut i elektrorazować to samo szkiełko po raz drugi, aby zaoszczędzić na kosztach szkiełek.

3. Badanie mikroskopowe

  1. Obserwuj komórki pod wpływem oświetlenia fluorescencyjnego, używając mikroskopu odwróconego wyposażonego w filtr odpowiedni dla używanego barwnika. Dla żółtego Lucyfera wzbudzenie wynosi 423 nm, emisja 555 nm, filtr WBV do mikroskopu Nikon IX70.
  2. Wyeliminuj efekty łąkotki, umieszczając szklane szkiełko nakrywkowe na plastikowej studzience, po napełnieniu jej do góry płynem, w celu zbadania morfologii komórki w kontraście fazowym. Aby uzyskać lepsze zdjęcia, studzienkę można odczepić od szkiełka, a szkiełko nakrywkowe umieścić na ramie. W przypadku komórek stałych studzienka może być wypełniona glicerolem w celu obserwacji mikroskopowej, natomiast w przypadku żywych komórek należy ją wypełnić pożywką wzrostową.
    UWAGA: Mycie i fotografowanie jest łatwiejsze, jeśli komórki są utrwalane formaldehydem po przeniesieniu barwnika (krok 2.7 powyżej). Jeśli komórki nie są utrwalone, fluorescencja jest eliminowana z komórek w ciągu około 60 minut, w zależności od typu komórki, napięcia i ilości wprowadzonego LY, podczas gdy w komórkach stałych fluorescencja jest utrzymywana przez kilka godzin. Jednak fluorescencja zanika lub rozprasza się po inkubacji O/N, nawet w komórkach stałych. Z tego powodu zdjęcia muszą być wykonane zaraz po elektroporacji (Ryc. 2).

4. Kwantyfikacja komunikacji międzykomórkowej

  1. Sfotografuj komórki za pomocą obiektywu 20x przy fluorescencji i kontraście fazowym (ryc. 3).
  2. Zidentyfikuj i oznacz gwiazdką elektroporowane ogniwa na granicy z obszarem nieelektroporowanym (Rysunek 2, strzałka, krawędź elektroporacji).
  3. Zidentyfikuj i oznacz kropką fluoryzujące ogniwa po stronie nieelektroporowanej, w których barwnik przeniósł się przez połączenia szczelinowe (rysunki 3A i 3B).
  4. Podziel całkowitą liczbę ogniw fluoryzujących na obszarze nieelektroporowanym przez liczbę ogniw elektroporowanych wzdłuż krawędzi (rysunki 3A i 3B).
    UWAGA: Transfer z co najmniej 200 ciągłych elektroporowanych ogniw granicznych jest obliczany dla każdego eksperymentu. Otrzymana liczba jest wartością GJIC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje komórki nabłonkowe wątroby szczuraT51B 22, natłuszczone elektroporacją LY i sfotografowane pod wpływem fluorescencji (panel A i B) lub kontrastu fazowego (C), po utrwaleniu i umyciu. W panelu A krawędź obszaru elektroporowanego jest zaznaczona na czerwono. Gradient fluorescencji po prawej stronie czerwonej linii oznacza przejście przez skrzyżowania szczelinowe. Na rysunkach 3A i 3B przedstawiono ilościowe określenie komunikacji na skrzyżowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w protokole

Materiał poddany elektroporacji
Czystość materiału, który ma być poddany elektroporacji, jest bardzo ważna. Jeśli komórki są bardzo płaskie, należy użyć wyższych stężeń barwnika śledzącego (do 20 mg/ml dla LY) i w takich przypadkach czystość jest jeszcze ważniejsza niż w komórkach o bardziej kulistym kształcie1. Oprócz LY zastosowano wiele różnych innych barwników lub cząsteczek niepermedycznych, takich jak seria barwników Alexa do wyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor korespondencyjny jest wynalazcą patentu posiadanego przez Queen's University, który został licencjonowany przez Cell Projects Inc. Firma ani Uniwersytet nie miały wpływu na treść artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Lowellowi Cochranowi za fachową pomoc w filmowaniu. Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc finansową Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Fundacji Raka Piersi (CBCF, Ontario Chapter), Kanadyjskiej Rady Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC), Kanadyjskiego Sojuszu Badań nad Rakiem Piersi, Ontario Centers of Excellence, Breast Cancer Action Kingston oraz funduszu Clare Nelson Bequest Fund poprzez dotacje dla LR. SG był stypendystą NSERC. MG był wspierany przez stypendium podoktorskie z US Army Breast Cancer Program, Ministerstwa Badań i Innowacji Prowincji Ontario oraz Komitetu Doradczego ds. Badań Queen's University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM bez Hyklonu Wapnia(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Surowica cielęca dawcy PAA: http://www.paa.com/Kat.# B15-008
Surowica bydlęcaPAA: http://www.paa.com/Kat.# A15-751
Aparat do elektroporacjiCell Projects Ltd Wielka Brytania: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd Wielka BrytaniaACE-04-CC4-dołkowy
ChambersCell Projects Ltd Wielka BrytaniaACE-08-CC8-dołkowy
Lucifer YellowCell Projects Ltd Wielka BrytaniaACE-25-LYWysoka czystość
CelTakBD Biosciences354240Klej komórkowy i tkankowy
FibronektynaSigma AldrichF1141
KolagenBD Biosciences354236
PolilizynaSigma AldrichP8920

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
  2. Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
  3. Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
  4. Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
  5. Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
  6. Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
  7. Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
  8. Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
  9. Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
  10. Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
  11. Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
  12. Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
  13. Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
  14. Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  15. Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
  16. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  17. Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
  18. Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
  19. Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
  20. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
  21. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
  22. Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
  23. Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605(2012).
  24. Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
  25. Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
  26. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  27. Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
  28. Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
  29. Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
  30. Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
  31. Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
  32. Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
  33. Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
  34. Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  35. Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Komunikacja przez po czenia szczelinowetransfer lucifer yellowmikroskopia fluorescencyjnapory b ony kom rkowejinhibicja sygna uwprowadzanie peptyd wanaliza ilo ciowa

Powiązane artykuły