Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Podsumowanie

Przedstawiono podejście do określania struktur kompleksów glikoprotein błony wirusowej za pomocą kombinacji kriotomografii elektronowej i uśredniania sub-tomogramu za pomocą pakietu obliczeniowego Jsubtomomo.

Streszczenie

Wirusy otoczkowe wykorzystują glikoproteiny błonowe na swojej powierzchni do pośredniczenia w wejściu do komórek gospodarza. Trójwymiarowa analiza strukturalna tych "kolców" glikoproteiny jest często trudna technicznie, ale ważna dla zrozumienia patogenezy wirusa i projektowania leków. W tym miejscu przedstawiono protokół określania struktury kolców wirusowych poprzez uśrednianie obliczeniowe danych kriotomografii elektronowej. Kriotomografia elektronowa to technika mikroskopii elektronowej stosowana do uzyskiwania trójwymiarowych rekonstrukcji objętości tomograficznej lub tomogramów pleomorficznych próbek biologicznych, takich jak wirusy błonowe, w stanie zbliżonym do natywnego, zamrożonego i uwodnionego. Tomogramy te ukazują interesujące struktury w trzech wymiarach, choć w niskiej rozdzielczości. Uśrednianie obliczeniowe podobjętości lub subtomogramów jest niezbędne do uzyskania wyższej rozdzielczości szczegółów powtarzających się motywów strukturalnych, takich jak kolce glikoproteiny wirusa. Przedstawiono szczegółowe podejście obliczeniowe do wyrównywania i uśredniania podtomogramów przy użyciu pakietu oprogramowania Jsubtomo. Podejście to umożliwia wizualizację struktury kolców glikoproteiny wirusa z rozdzielczością w zakresie 20-40 A oraz badanie badania interakcji kolca-kolca wyższego rzędu na błonie wirionu. Typowe wyniki przedstawiono dla wirusa Bunyamwera, wirusa otoczkowego z rodziny Bunyaviridae. Rodzina ta jest strukturalnie zróżnicowaną grupą patogenów stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt.

Wprowadzenie

Kriotomografia elektronowa to technika obrazowania kriomikroskopii elektronowej, pozwalająca na obliczanie trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji złożonych próbek biologicznych. Odpowiednie próbki obejmują zarówno oczyszczone kompleksy makromolekularne¹, włókna², pokryte pęcherzyki³ i pleomorficzne wirusy błonowe⁴, jak i całe komórki prokariotyczne⁵, a nawet cienkie obszary całych komórek eukariotycznych⁶. Po zebraniu danych z serii nachylenia, objętości tomograficzne 3D lub tomogramy mogą być obliczane przy użyciu kilku uznanych pakietów oprogramowania, w tym Bsoft⁷ i IMOD⁸.

Dwa aspekty nieodłącznie związane z badaniem próbek biologicznych za pomocą kriotomografii elektronowej ograniczają biologiczną interpretację odpowiednich objętości tomografii. Po pierwsze, ze względu na ograniczoną dawkę elektronów, którą można zastosować do materiałów biologicznych przed wprowadzeniem znacznych uszkodzeń radiacyjnych, stosunek sygnału do szumu w danych tomograficznych jest zazwyczaj bardzo niski. Po drugie, w wyniku ograniczonej geometrii nachylenia próbki podczas zbierania danych, niektóre widoki obiektu pozostają nieobecne, co prowadzi do tak zwanego artefaktu "brakującego klina" w objętości tomografii. Jednak oba te ograniczenia można przezwyciężyć, jeśli objętość tomograficzna zawiera powtarzające się identyczne struktury, takie jak kompleksy makromolekularne, które można z powodzeniem uśrednić^9-12.

Przed uśrednieniem struktur z rekonstrukcji tomogramu, obiekty zainteresowania muszą zostać znalezione i wyrównane do tej samej orientacji. Lokalizację takich struktur można osiągnąć poprzez korelację krzyżową struktury szablonowej w objętości tomografii przy użyciu podejścia często określanego jako dopasowywanie szablonów¹³. Szablon używany w tym procesie dopasowywania może pochodzić z kriomikroskopii elektronowej lub kriotomografii elektronowej w połączeniu z rekonstrukcją 3D lub może to być mapa gęstości symulowana na podstawie struktury atomowej. W celu realizacji tych zadań opracowano kilka pakietów obliczeniowych¹¹.

Uśrednianie kolców glikoproteinowych wirusów błonowych, takich jak HIV-1, było szczególnie skutecznym podejściem do badania ich struktury^14-16. Zrozumienie tej struktury jest niezbędne do odkrycia zarówno molekularnych podstaw interakcji wirus-gospodarz, jak i ukierunkowania rozwoju leków przeciwwirusowych i projektów szczepionek. Podczas gdy krystalografia makromolekularna jest techniką z wyboru do analizy strukturalnej o wysokiej rozdzielczości (zwykle lepszej niż 4 A) pojedynczych glikoprotein wirusowych i ich kompleksów, struktury rentgenowskie wynikające z tej metody składają się z białek wyizolowanych z naturalnego środowiska błoniastego na wirionie. W związku z tym nadal brakuje ważnych szczegółów, takich jak architektura glikoprotein wirusowych wyższego rzędu w kontekście wirionu. Z drugiej strony, kriomikroskopia elektronowa i rekonstrukcja pojedynczych cząstek całych wirusów otoczkowych jest ograniczona do wirionów o symetrii dwudziestościennej^17,18. Kriotomografia elektronowa w połączeniu z wyrównaniem podobjętości stała się zatem techniką uzupełniającą pozwalającą na badanie kolców glikoprotein pleomorficznych wirusów o nieregularnych kształtach in situ.

Opracowaliśmy oprogramowanie o nazwie Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) do wykrywania, dopasowywania i uśredniania tomograficznych podobjętości. Jsubtomo został wykorzystany do określenia struktury wielu struktur komórkowych i wirusowych^19-26. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który umożliwia określenie struktur kolców na powierzchni wirusa. Aby uniknąć nadmiernego wyrafinowania uśrednionych struktur poprzez korelację szumu, przyjęto schemat udoskonalania oparty na "złotym standardzie"^10,27. Na koniec omówiono strategie wizualizacji i interpretacji typowych wyników.

Protokół

Przedstawiono szczegółowy protokół obliczeniowego dopasowania i następnego uśredniania kolców glikoprotein wirusowych. Protokół postępuje zgodnie z przebiegiem prac przedstawionym na Rycini 1 i łączy zautomatyzowane wyszukiwanie kolców z wykorzystaniem wstępnych struktur szablonowych oraz rafinację struktury w standardzie gold-standard.

Danymi wejściowymi dla niniejszego protokołu jest zestaw rekonstrukcji tomograficznych wirionów. Jeden tomogram zawiera jeden lub więcej wirionów. Początkowo ręcznie wybiera się niewielki podzbiór kolców, który służy do uśrednienia i dopracowania dwóch niezależnych modeli. Modele te są wykorzystywane do automatycznego lokalizowania kolców we wszystkich wirionach. Na koniec przeprowadza się dwa niezależne dopracowania, a uzyskane uśrednione wyniki są porównywane i łączone w celu otrzymania ostatecznej struktury.

Podejście do doprecyzowania zostało zaprezentowane przy użyciu programów z pakietu Jsubtomo. Programy z pakietu Bsoft²⁸ są wykorzystywane do ogólnych zadań przetwarzania obrazów, a pakiet grafiki molekularnej UCSF Chimera²⁹ służy do wizualizacji wyników. Nazwy poszczególnych programów podano kursywą, a formaty plików oznaczono wielkimi literami w rozszerzeniach plików.

Rycina 1: Ogólna strategia określania struktur kompleksów białek kolca glikoprotein z pleomorficznych wirusów błonowych. Numery odpowiadają poszczególnym sekcjom w Protokołach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Wyodrębnianie podobjętości wirusa z pełnowymiarowych tomogramów

1. Ręcznie wybierz cząsteczki wirusa w tomogramach.
   1. Otwórz plik tomogramu w programie bshow. Zdefiniuj współrzędne środka cząsteczki wirusa za pomocą narzędzia do wyboru cząsteczek (particle-picking tool). Powtarzaj ten krok, aż wszystkie wiriony zostaną przetworzone. Zapisz współrzędne wirusów w pliku STAR.
   2. Powtarzaj krok 1.1.1, aż wszystkie tomogramy zostaną przetworzone. Zanotuj średnicę wirionu w pikselach.
      UWAGA: Jeśli kolce są trudne do zauważenia w tomogramach, użyj programu bfilter, aby zastosować filtr dolnoprzepustowy do tomogramów do rozdzielczości 80-Å (parametr „-bandpass 80,10000”).
2. Uruchom jsubtomo.py w trybie ekstrakcji (parametr „--mode extract”), aby wyekstrahować podobjętości wirionów do poszczególnych plików objętości. Jako pliki wejściowe wykorzystaj pliki STAR zapisane w kroku 1.1.1.
   1. Podaj rozmiar (parametr „--size”) o około 25% większy niż największy wirion w zbiorze danych. Np. jeśli średnica wirionu wynosi ~200 pikseli, użyj rozmiaru 250 x 250 x 250 pikseli.
   2. Pliki wyjściowe objętości wirionów będą w formacie MAP. Dodatkowo utwórz towarzyszący plik STAR dla każdej objętości wirionu (parametr „--output”).
3. Znormalizuj objętości wirionów w programie bimg (parametr „-rescale 0,1”).

2. Generowanie dwóch niezależnych modeli początkowych

1. Wybierz podzbiór kolców w podobjętościach wirionów.
   1. Otwórz plik mapy podobjętości wirionu w programie bshow. Zdefiniuj współrzędną środka kolca za pomocą narzędzia do wyboru cząsteczek (particle-picking tool), dostępnego w oknie Toolbox. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie wyraźnie odróżnialne kolce zostaną przetworzone. Zapisz współrzędne kolców w pliku STAR.
   2. W razie potrzeby powtórz krok 2.1.1 dla innych wirionów, aż przetworzonych zostanie około 200 kolców glikoproteinowych. Zanotuj wymiary kolców w pikselach.
      UWAGA: Liczba ~200 kolców jest orientacyjna i w niektórych zastosowaniach może być wymagana większa liczba. Jeśli to możliwe, staraj się wybierać kolce w różnych orientacjach. Unikaj wyboru wyłącznie widoków z góry.
2. Przypisz wstępny wektor widoku do kolców, uruchamiając program jviews.py. Jako pliki wejściowe wykorzystaj pliki STAR wygenerowane w kroku 2.1.1.
   UWAGA: Ten wektor widoku przybliża kierunek kolca w odniesieniu do wirionu.
   1. W przypadku wirionu sferycznego użyj współrzędnej środkowej do przypisania widoków. Na przykład, jeśli wirion znajduje się w centrum (po kroku 1.2) w ramce o rozmiarze 250 x 250 x 250 pikseli, współrzędna środkowa wynosi 125,125,125 pikseli (opcja „--Radial 125,125,125”).
   2. Aby przypisać widoki dla wirionu nitkowatego, otwórz każdą podobjętość wirionu w programie bshow, używając pliku STAR zdefiniowanego w kroku 2.1.1 jako pliku wejściowego. Zdefiniuj dwa punkty końcowe filamentu za pomocą narzędzia do wyboru filamentów i zapisz plik STAR. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie pliki STAR zostaną zaktualizowane, a następnie uruchom jviews.py, używając zaktualizowanych plików STAR jako plików wejściowych (opcja --Segment).
3. Wygeneruj maskę w przestrzeni rzeczywistej za pomocą programu jsubtomo_create_mask.py. Upewnij się, że maska w przestrzeni rzeczywistej ma takie same wymiary, jakie będą stosowane dla uśrednionej struktury (patrz 2.6.2) i jest wystarczająco duża, aby pomieścić zarówno kolca, jak i fragment leżącej pod nim błony.
4. Wygeneruj maskę w przestrzeni odwrotnej za pomocą programu jsubtomo_create_wedgemask.py. Maska w przestrzeni odwrotnej służy do wykluczenia obszarów w regionie „brakującego klina” (missing wedge), wynikającego z tomograficznego zbierania danych na jednej osi. Upewnij się, że ma ona takie same wymiary, jakie będą stosowane dla uśrednionej struktury (patrz 2.6.2).
5. Wygeneruj plik selekcji (plik SEL) definiujący wiriony należące do zestawów „1” i „2” za pomocą programu jsubtomo_evenodd.py oraz plików STAR wygenerowanych w kroku 2.2.
6. Wygeneruj dwie wstępne średnie za pomocą programu jsubtomo_create_averages.py.
   1. Jako plik wejściowy wykorzystaj plik SEL wygenerowany w kroku 2.5.
   2. Podaj rozmiar (parametr „--size”) co najmniej o 32 piksele większy niż największy wymiar kolca. Np. jeśli kolca ma długość ~40 pikseli, użyj rozmiaru 72 x 72 x 72 piksele.
   3. Zastosuj wysoką symetrię (np. c100) dla średnich (parametr „--symmetry c100”), aby uzyskać przybliżoną średnią cylindryczną wzdłuż długiej osi kolca. Użyj symetryzacji, aby zredukować szum w wstępnych średnich.
   4. Podaj unikalną nazwę dla plików wyjściowych projektu (parametr „--suffix”).
   5. Użyj maski w przestrzeni rzeczywistej wygenerowanej w kroku 2.3 do zamaskowania tła (parametr „--mask”). Użyj maski w przestrzeni odwrotnej wygenerowanej w kroku 2.4, aby uwzględnić utratę sygnału spowodowaną obecnością brakującego klina (parametr „--Mask”).

3. Złoty standard iteracyjnego dopasowania i uśredniania dwóch początkowych modeli kolca

Iteracyjnie dopasuj i uśrednij dwa początkowe modele wygenerowane w sekcji 2 za pomocą jsubtomo_iterate_gold.py.

1. Etap I. Celem tego etapu jest doprecyzowanie kierunku wektora widoku. Plikiem wejściowym jest plik SEL wygenerowany w kroku 2.5.
   1. Zastosuj 8-stopniowe próbkowanie kątowe (parametr „--angles 8,8,8”).
   2. Dopuszczalne są 16-stopniowe zmiany kierunku wektora widoku kolca (parametr „--thetaphilimit 16”), przy zachowaniu stałego kąta wokół długiej osi kolca (parametr „--alphalimit 0”).
   3. Dopuszczalne są niewielkie przesunięcia translacyjne (np. 5 pikseli), aby uwzględnić niedokładności w ręcznym wskazywaniu kolców (parametr „--shiftlimit 5”).
   4. Zastosuj wysoką symetrię (np. c100) dla średnich (parametr „--symmetry c100”), aby przybliżyć średnią cylindryczną wokół długiej osi kolca.
      UWAGA: Symetryzacja jest stosowana w celu redukcji szumów w średnich.
   5. Użyj maski w przestrzeni rzeczywistej oraz maski w przestrzeni odwrotnej wygenerowanych w krokach 2.3 i 2.4, aby zamaskować otaczające kolce i uwzględnić brakujący klin (odpowiednio parametry „--mask” i „--Mask”).
   6. Użyj dwóch plików MAP wygenerowanych w kroku 2.6 (oznaczonych tagami „even” i „odd” w nazwie pliku) jako szablonów (odpowiednio parametry „--Template1” i „--Template2”).
   7. Zastosuj filtr dolnoprzepustowy o rozdzielczości 50 Å (parametr „--resolution”), aby zapobiec błędowi dopasowania (alignment bias).
   8. Zastosuj czynnik binowania równy 2 w celu przyspieszenia doprecyzowania (parametr „--bin 2”).
   9. Wykonaj 5 iteracji dopasowania i uśredniania (parametry „--firstiter 1 --lastiter 5”).
2. Etap II. Celem tego etapu jest doprecyzowanie kąta wokół wektora widoku. Plikiem wejściowym jest wyjściowy plik SEL z kroku 3.1.9.
   1. Zmierz dokładne wymiary kolca, otwierając w programie bshow plik MAP z filtrem dolnoprzepustowym wygenerowany w ostatniej iteracji w kroku 3.1.9 (oznaczony tagiem „_lp” w nazwie pliku). Wygeneruj nową maskę w przestrzeni rzeczywistej analogicznie do kroku 2.3, która definiuje kolca, ale wyklucza większość błony i sąsiednie kolce.
      UWAGA: Optymalny rozmiar maski zależy od rozmiaru i cech kolca.
   2. Zastosuj 8-stopniowe próbkowanie kątowe (parametr „--angles 8,8,8”), tak jak wcześniej.
   3. Dopuszczalne są 180-stopniowe zmiany kąta wokół wektora widoku kolca (parametr „-- alphalimit 180”), przy zachowaniu stałych kątów theta i phi (parametr „--thetaphilimit 0”).
   4. Nie dopuszczaj żadnych przesunięć translacyjnych (parametr „--shiftlimit 0”).
   5. Nie stosuj żadnej symetrii dla średnich (pomiń parametr „--symmetry”).
   6. Użyj maski w przestrzeni odwrotnej wygenerowanej w kroku 2.4, aby uwzględnić brakujący klin.
   7. Użyj dwóch plików MAP wygenerowanych w ostatniej iteracji kroku 3.1.9 bez symetrii (oznaczonych tagami „even_nosym” i „odd_nosym” w nazwie pliku) jako szablonów (odpowiednio parametry „--Template1” i „--Template2”).
   8. W pierwszej iteracji zastosuj filtr dolnoprzepustowy o rozdzielczości 50 Å (parametr „--resolution”), aby zapobiec błędowi dopasowania. Parametry filtra w kolejnych iteracjach dostosuj automatycznie (parametr „--adaptivefilter”) na podstawie korelacji powłok Fouriera (FSC) według złotego standardu między dwiema niezależnymi średnimi. Użyj kryterium 0,143 (parametr „--fsccrit 0.143”). Nie dopuszczaj doprecyzowania powyżej pierwszego zera funkcji przenoszenia kontrastu (CTF) (parametr „--minhires”), chyba że w tomogramach zastosowano korekcję CTF.
   9. Wykonaj 5–10 iteracji dopasowania i uśredniania (np. parametry „--firstiter 6 --lastiter 15”). Monitoruj zmiany w raportowanej rozdzielczości. Proces można przerwać, gdy nie zaobserwuje się już istotnych zmian.
3. Oceń stopień symetrii struktury, badając wynikowy plik MAP z filtrem dolnoprzepustowym (oznaczony tagiem „_lp” w nazwie pliku) w programie chimera. Np. jeśli kolcem jest kompleks trymeryczny, powinna być widoczna symetria trzykrotna.
4. Etap III. Celem tego etapu jest dalsze doprecyzowanie kąta wokół wektora widoku z zastosowaniem poprawnej symetrii. Plikiem wejściowym jest wyjściowy plik SEL z kroku 3.2.9. Parametry są takie same jak w kroku 3.2, z kilkoma wyjątkami:
   1. Dopuszczalne są odpowiednie zmiany kąta wokół wektora widoku kolca. Na przykład, jeśli struktura posiada symetrię trzykrotną, dopuść zmiany o 60 stopni w kącie alfa (parametr „--alphalimit 60”).
   2. Zastosuj poprawną symetrię (np. c3) dla średnich (parametr „--symmetry c3”).
   3. Użyj dwóch plików MAP wygenerowanych w ostatniej iteracji w kroku 3.2.9 (oznaczonych tagami „even” i „odd” w nazwie pliku) jako wejściowe pliki szablonów (parametry „--Template1” i „--Template2”).
   4. Wykonaj 5–10 iteracji dopasowania i uśredniania (np. parametry „--firstiter 16 --lastiter 25”). Monitoruj zmiany w raportowanej rozdzielczości. Proces można przerwać, gdy nie zaobserwuje się już istotnych zmian.
5. Etap IV. Celem tego etapu jest dokładne, jednoczesne doprecyzowanie wszystkich trzech kątów. Plikiem wejściowym jest wyjściowy plik SEL z kroku 3.4.4. Parametry są takie same jak w kroku 3.4, z kilkoma wyjątkami:
   1. Dopuszczalne są 8-stopniowe zmiany kąta wokół wektora widoku kolca (parametr „-- alphalimit 8”) oraz 8-stopniowe zmiany kierunku wektora widoku kolca (parametr „--thetaphilimit 8”). Doprecyzuj orientacje z dokładnością do 4 stopni (parametry „--angles 8,8,8 --iterate 2”).
   2. Dopuszczalne są niewielkie przesunięcia (np. 5 pikseli), aby uwzględnić niedokładności w poprzednich krokach dopasowania (parametr „--shiftlimit 5”).
   3. Użyj dwóch plików MAP wygenerowanych w ostatniej iteracji w kroku 3.4.4 (oznaczonych tagami „even” i „odd” w nazwie pliku) jako wejściowe pliki szablonów (parametry „--Template1” i „--Template2”).
   4. Wykonaj 5-10 iteracji dopasowania i uśredniania (np. parametry „--firstiter 26 --lastiter 35”). Monitoruj zmiany w raportowanej rozdzielczości. Proces można przerwać, gdy nie zaobserwuje się już istotnych zmian.

4. Generowanie i dopasowanie ziarn do powierzchni wirusa w celu dopasowania szablonu

1. Wygeneruj punkty startowe (seeds) rozmieszczone równomiernie na powierzchni wirionu do dopasowania szablonu i przypisz początkowy wektor widoku do punktów startowych, uruchamiając skrypt jviews.py. Jako pliki wejściowe wykorzystaj pliki STAR wygenerowane w kroku 1.2.2. Wygeneruj około 1,5 raza więcej punktów startowych niż oczekiwana liczba kolców.
   UWAGA: Ten wektor widoku przybliża kierunek kolca znajdującego się najbliżej każdego punktu startowego.
   1. Aby wygenerować równomiernie rozmieszczone punkty startowe na w przybliżeniu sferycznym wirionie (parametr „--Even”), podaj promień (parametr „--radius”), separację kątową punktów startowych (np. 20 stopni; parametr „--angle 20”) oraz współrzędną środka wirionu. Np. jeśli wirion jest wycentrowany (po kroku 1.2) w ramce o rozmiarze 250 x 250 x 250 pikseli, współrzędna środka wynosi 125,125,125 pikseli (opcja „--origin 125,125,125”).
   2. Aby wygenerować równomiernie rozmieszczone punkty startowe na cząstce włóknistej, użyj parametru „--Filament” i określ parametry promienia oraz symetrii helikalnej (skok i skręcenie).
      UWAGA: Parametry symetrii helikalnej są tutaj używane jedynie jako wygodny sposób definiowania równomiernie rozmieszczonych pozycji punktów startowych i nie muszą odzwierciedlać rzeczywistego rozmieszczenia kolców na włóknie.
2. Wygeneruj dwie niezależne średnie powierzchni wirusa, zgodnie z wyjaśnieniami w sekcji 2.
   1. Wygeneruj plik SEL definiujący wiriony należące do zbiorów „1” i „2”, używając skryptu jsubtomo_evenodd.py oraz plików STAR wygenerowanych w kroku 4.1.
      UWAGA: Aby zapewnić niezależność zbiorów danych, wszelkie poprzednie przypisania wirionów do grup „1” i „2” muszą pozostać niezmienione.
3. Zoptymalizuj pozycję punktów startowych.
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami w kroku 3.1, chyba że wskazano inaczej. Jako plik wejściowy wykorzystaj plik SEL wygenerowany w kroku 4.2.1.
   2. Pozwól punktom startowym przesuwać się wyłącznie wzdłuż normalnej do błony (parametr „--zshiftlimit”). Dostosuj dopuszczalny zakres przesunięcia w zależności od tego, jak bardzo wiriony odbiegają od idealnej geometrii sferycznej (np. parametr „--zshiftlimit 25”).
   3. Użyj dwóch plików MAP wygenerowanych w kroku 4.2 (oznaczonych tagami „even” i „odd” w nazwie pliku) jako wejściowe pliki szablonów (parametry „--Template1” i „--Template2”).
   4. Użyj unikalnego przyrostka, aby uniknąć nadpisania oryginalnych wejściowych plików STAR (np. parametr „--suffix _seeds”).
   5. Użyj binningu o wartości 4, aby przyspieszyć obliczenia (parametr „--bin 4”), oraz filtru dolnoprzepustowego (np. parametr „--resolution 50”).
4. Wygeneruj pliki znaczników Chimera (CMM) dla zoptymalizowanych plików STAR z punktami startowymi, używając skryptu jviews.py (parametr „--cmm”). Przeanalizuj punkty startowe, otwierając pliki CMM (oraz powiązane pliki MAP wirionów) w programie chimera. Upewnij się, że zoptymalizowane punkty startowe są poprawnie wyrównane względem błony wirusa.
   UWAGA: Do rozróżnienia oddzielnych zestawów znaczników można użyć różnych kolorów (parametr „--color”). Alternatywnie zoptymalizowane znaczniki można pokolorować na podstawie ich współczynnika korelacji wzajemnej (np. parametr „--fomcolor 0.1,0.3”).

5. Złoty standard iteracyjnego dopasowania i uśredniania struktury kolca

Automatycznie zlokalizuj wszystkie kolce w podobjętościach wirionów, stosując lokalne dopasowanie szablonu wokół doprecyzowanych punktów startowych, a następnie wyrównaj i uśrednij zlokalizowane kolce. Jako początkowe szablony wykorzystaj średnie wygenerowane z podzbioru ręcznie wybranych kolców.

1. Wykonaj lokalne dopasowanie szablonu wokół punktów startowych (seeds), aby uśrednić wszystkie kolce, używając programu jsubtomo_iterate_gold.py. Postępuj zgodnie z instrukcjami z kroku 3.5, chyba że wskazano inaczej.
   1. Plikiem wejściowym jest plik SEL dla doprecyzowanych punktów startowych wygenerowanych w kroku 4.3.
   2. Użyj odpowiednio dużego limitu dla kąta wektora widoku. Np. jeśli punkty startowe były generowane co 20 stopni (krok 4.1), użyj kąta nieco większego niż połowa tej wartości (parametr „--thetaphilimit 12”). Dopuszczone są odpowiednie zmiany kąta wokół wektora widoku kolca.
   3. Zezwól punktom startowym na przesunięcie w płaszczyźnie błony (parametr „--xyshiftlimit”). Np. jeśli odległość między punktami startowymi wynosi 25 pikseli, użyj całkowitego przesunięcia nieco większego niż połowa tej wartości (np. parametry „--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10”).
      UWAGA: Dodatkowe przesunięcia translacyjne mogą być wymagane, jeśli pliki MAP wygenerowane w kroku 3.5 są wycentrowane w innej odległości od centrum wirionu niż punkty startowe.
   4. Użyj dwóch plików MAP wygenerowanych w kroku 3.5 (oznaczonych tagami „even” i „odd” w nazwie pliku) jako wejściowych plików szablonu (parametry „--Template1” i --Template2).
   5. Użyj aktualnej rozdzielczości plików MAP wygenerowanych w kroku 3.5 (parametr --resolution).
   6. Przeprowadź 5–10 iteracji dopasowania szablonu, wyrównania i uśredniania (np. parametry „--firstiter 1 --lastiter 10”). Monitoruj zmiany w raportowanej rozdzielczości. Proces można przerwać, gdy nie zaobserwuje się istotnych zmian.
   7. Po każdej iteracji wyklucz nakładające się dopasowania. Np. jeśli szerokość kolca wynosi 30 pikseli, wyklucz dopasowania, które znajdują się bliżej niż 30 pikseli od innych dopasowań (parametr „--mindist 30”).
   8. Wyklucz dopasowania o niskim współczynniku korelacji krzyżowej. Na przykład uwzględnij 75% najlepszych kolców dla każdego wirionu (parametr „--topp 75”).
      UWAGA: Dopasowania o niskim współczynniku korelacji krzyżowej prawdopodobnie reprezentują wyniki fałszywie dodatnie.

6. Wizualizacja wyników

1. Otwórz udoskonaloną strukturę białka spike w programie chimera w celu wizualizacji i dopasowania struktur atomowych.
   1. Jako plik wejściowy wykorzystaj plik MAP z filtrem dolnoprzepustowym (oznaczony tagiem „lp”), utworzony w ostatniej iteracji w kroku 5.1.6.
   2. W narzędziu „Fit in Map” programu chimera do dopasowania opartego na korelacji wzajemnej zastosuj rozdzielczość wskazaną w kroku 5.1.6.
2. Utwórz model kompozytowy wirionu za pomocą skryptu jsubtomo_create_model.py.
   1. Jako wejściowy plik MAP (parametr „--Template”) wykorzystaj plik MAP z filtrem dolnoprzepustowym (oznaczony tagiem „lp”), utworzony w ostatniej iteracji w kroku 5.1.6.
   2. Jako wejściowy plik STAR wykorzystaj plik STAR wygenerowany w ostatniej iteracji w kroku 5.1.6.
   3. Aby uwzględnić nakładające się gęstości w modelu kompozytowym, wykorzystaj plik maski wygenerowany w kroku 3.2.1 (parametr „--mask”).
   4. Wskaż rozmiar pliku MAP wirionu, aby wygenerować model kompozytowy o tym samym rozmiarze (parametr „--size”).
3. Otwórz model kompozytowy w programie chimera w celu wizualizacji.

Wyniki

Prezentujemy zastosowanie opisanego powyżej schematu uśredniania subtomogramów dla kompleksu glikoprotein otoczki wirusa Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) z wykorzystaniem wcześniej opublikowanego zestawu danych²⁴. Parametry gromadzenia i doprecyzowania danych wymieniono w Tabeli 1. Jeden reprezentatywny tomogram przedstawiono na Rysunku 2.

Parametr (jednostka)	Wartość
Gromadzenie danych
Napięcie (kV)	300
Skalibrowane powiększenie (X)	111,000
Rozmiar piksela (Å)	5.4
Szacowana dawka (e–/ Å2)	100
Rozmycie (brak ostrości) (μm)	4.0–4.5
Pierwsze zero CTF (Å)a	26–30
zakres nachylenia (°)	–60–60
próbkowanie pod kątem (°)	3
Dane i udoskonalenie
Tomogramy	11
Wiriony	29
Liczba cząsteczek kwasu nukleinowego na wirion	106
Całkowita liczba nasion	3,074
Wykryto piki	1,346
Piki po usunięciu nakładania się sygnałów	1,401
Szczyty po selekcji opartej na korelacji wzajemnej	1,022
Wartości odstające uwzględnione w końcowej średniej	1,022
Symetria	C3
Próbkowanie kątowe (°)	8
Zakres rozdzielczości zastosowany w udoskonalaniu (Å)	42–334
Szacowana rozdzielczość końcowa (Å)b	35

Tabela 1: Statystyki zbierania i udoskonalania danych dla wirusa Bunyamwera.
^a CTF, funkcja przenoszenia kontrastu.
^b Obliczone przy użyciu korelacji powłok Fouriera między dwiema niezależnie udoskonalonymi strukturami przy progu 0,143.

Rysunek 2: Przekrój przez tomogram wirionów Bunyamwera. Groty strzałek wskazują widoki boczne kilku kolców widocznych na obwodzie każdego wirionu. Tomogram został poddany filtrowaniu dolnoprzepustowemu do 60 Å. Pasek skali 100 nm.

W pierwszej kolejności dopracowaliśmy model wstępny, wykorzystując 205 ręcznie wybranych kolców (Rycina 3). Trójskrotna symetria najbardziej centralnego kolca była widoczna bez nakładania jakiejkolwiek symetrii (Rycina 3B) i została wymuszona w kolejnych rundach doprecyzowania (Rycina 3C). W celu automatycznego wykrycia wszystkich kolców na powierzchniach wirionów wygenerowaliśmy 106 punktów startowych dla każdego wirionu w promieniu 43 nm i z odstępem 20 stopni (Rycina 4A), a następnie iteracyjnie dopracowaliśmy ich położenie względem błony (Rycina 4B).

Rycina 3: Udoskonalenie struktury początkowego szablonu. (A) Szablon uśredniony cylindrycznie (C100) skonstruowany na podstawie ręcznie zdefiniowanych pozycji kolców. (B) Uśredniona gęstość po pięciu rundach udoskonalenia bez narzuconej symetrii (C1) wykazuje kolca z cechami symetrii trzykrotnej. Rozdzielczość modelu wynosi 48 Å. (C) Średnia dla kolca została wyznaczona z rozdzielczością 41 Å po pięciu rundach udoskonalenia z symetrią trzykrotną.

Rycina 4: Udoskonalenie ziarn (seeds). A-B) Podzbiór ziarn przed (A) i po (B) udoskonaleniu przedstawiony na jednej gęstości wirionu z Ryciny 2. Ziarna w (B) zostały zakodowane kolorami na podstawie odpowiednich współczynników korelacji krzyżowej (niebieski – niska korelacja; czerwony – wysoka korelacja).

Do obliczenia końcowej średniej wykorzystano najlepiej korelujące fragmenty białka kolca (top 75% po usunięciu nakładających się obszarów; ~1 000 kolców). Średnia została wyznaczona z rozdzielczością 35-Å (Rysunek 5). Wykazała ona obecność trymerycznej struktury kolca w centrum, a także pewien wkład z sześciu sąsiednich kolców. Modele kompozytowe wirionów, obliczone poprzez rozmieszczenie struktury w znanych pozycjach, ujawniły rozmieszczenie kolców na powierzchni wirionu (Rysunek 6A). Okazyjnie widoczne były lokalnie uporządkowane fragmenty kolców (Rysunek 6B).

Rysunek 5: Udoskonalona struktura fragmentu warstwy białek kolca glikoproteiny po dopasowaniu szablonu. (A-B) Przedstawiono dwie mapy, „parzystą” i „nieparzystą”, zrekonstruowane z dwóch połaci danych. Obie mapy wykazują niezwykły stopień podobieństwa, co potwierdza poprawność przyjętego podejścia. Orientacja wokół długiej osi kolca jest różna, ponieważ obie mapy zostały zrekonstruowane całkowicie niezależnie od siebie. (C) Przedstawiono średnią z obu map w końcowej rozdzielczości 35 Å.

Rycina 6: Rozmieszczenie kolców na wirionie Bunyamwera. (A) Złożony model wirionu. Wektory widoczności (pręciki) wskazują orientację kolców. Kolory określają korelację krzyżową między każdym kolcem a strukturą szablonową (niebieski – niska korelacja; czerwony – wysoka korelacja). (B) Powiększony widok uporządkowanego obszaru kolców.

Dyskusja

Wiedza na temat struktury kolców glikoproteiny wirusa na błonie wirionu jest niezbędna do zrozumienia replikacji wirusa i opracowania środków terapeutycznych do leczenia i zapobiegania zakażeniom. Kriomikroskopia elektronowa w połączeniu z uśrednianiem pojedynczych cząstek stała się najczęściej stosowaną metodą rozwiązywania struktur otoczkowych cząstek wirusa, w tym kolców glikoproteiny. Jednak ta metoda jest ograniczona do wirusów symetrycznych ikozai. Tutaj, poprzez zastosowanie kriotomografii elektronowej i uśredniania subtomogramu w Jsubtomo, nakreśliliśmy ogólny protokół określania kolców glikoproteiny na pleomorficznych wirusach otoczkowych, które nie są podatne na inne obecne metody biologii strukturalnej. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że rozdzielczość tej metody jest wystarczająca, aby ujawnić wgląd w architekturę domeny, oligomeryzację i organizację wyższego rzędu kolców glikoproteiny na nienaruszonych wirionach.

Najważniejszym krokiem w ramach tego protokołu jest skonstruowanie dwóch niezawodnych modeli wyjściowych, które są statystycznie niezależne od siebie. Pomyślne wykonanie tego kroku zakłada, że kolce glikoproteiny są wystarczająco duże i nie są zbyt ciasno upakowane względem siebie, tak aby poszczególne kolce mogły być wizualnie rozpoznane i ręcznie wybrane na tomogramach, a dwa niezależne modele uśrednione. Jeśli nie jest to wykonalne, można spróbować wprowadzić dwie modyfikacje protokołu. Po pierwsze, można skonstruować dwa niezależne modele losowe, definiując najpierw dwa losowe podzbiory podtomogramów, a następnie uśredniając podtomogramy w ramach tych podzbiorów³⁰. Po drugie, jeśli struktura izolowanego kolca została wyprowadzona w inny sposób, na przykład za pomocą krystalografii rentgenowskiej, można ją wykorzystać jako model wyjściowy. Należy jednak zachować ostrożność, aby filtrować dolnoprzepustowy ten model za pomocą odcięcia o niskiej rozdzielczości (50-70 A), ponieważ dwa wynikowe modele w następnej rundzie udoskonalania będą statystycznie niezależne tylko po przekroczeniu tej rozdzielczości. Ze względu na to zastrzeżenie zalecane jest pierwsze podejście.

Rozdzielczość możliwa do uzyskania z tego protokołu zależy od czterech głównych czynników: i. strategii zbierania danych i jakości danych wejściowych, ii. liczba subtomogramów, iii. dokładność wyrównania subtomogramów oraz iv. niejednorodność struktur. Podczas gdy pierwsze i drugie ograniczenie można w dużej mierze przezwyciężyć poprzez zastosowanie bezpośrednich detektorów elektronów o wysokim współczynniku sygnału do szumu w połączeniu z tomografią korekcyjną CTF i automatycznym gromadzeniem danych, na dokładność dopasowania dodatkowo wpływa rozmiar i kształt samej struktury będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku stosowania tego protokołu do małych kolców pozbawionych widocznych cech, korzystne może być związanie fragmentów Fab z kolcem w celu poprawy dokładności wyrównania, a tym samym rozdzielczości³¹. Wreszcie, jeżeli struktury, które mają być uśrednione, wykazują wiele konformacji, metody klasyfikacji subtomogramowej mogą być stosowane do oddzielnego uśredniania różnych konformacji. W tym celu Jsubtomo integruje się z pakietem Dynamo, oferując potężną klasyfikację subtomogramu⁹.

Powyższy protokół jest komplementarny do krystalografii rentgenowskiej izolowanych glikoprotein wirusowych. Struktury krystalograficzne można dopasować do średnich subtomogramowych, aby uzyskać precyzyjną orientację glikoproteiny w stosunku do błony wirionu. Zastosowanie tej metodologii bez wątpienia będzie nadal rzucać światło na strukturę i patobiologię wirusa otoczkowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jsubtomo (ver 1.3.1)	University of Oxford	n/a	www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7)	NIAMS, NIH	n/a	bsoft.ws
UCSF Chimera	UCSF	n/a	www.cgl.ucsf.edu/chimera