Artykuł metodologiczny

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51715

⸱

21 lipca 2014

 ,  , 
1Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Streszczenie

Metody in vivo, takie jak ChIP-chip, są dobrze znanymi technikami używanymi do określania globalnych celów genów dla czynników transkrypcyjnych. Mają one jednak ograniczone zastosowanie w badaniu dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakterii z niescharakteryzowanymi warunkami aktywacji. Takie systemy regulują transkrypcję tylko wtedy, gdy są aktywowane w obecności unikalnych sygnałów. Ponieważ sygnały te są często nieznane, metoda oparta na mikromacierzyach in vitro opisana w tym artykule wideo może być wykorzystana do określenia celów genów i miejsc wiązania regulatorów odpowiedzi. Ta metoda oczyszczonego chipa z powinowactwem DNA może być stosowana do dowolnego oczyszczonego regulatora w dowolnym organizmie ze zsekwencjonowanym genomem. Protokół polega na umożliwieniu oczyszczonemu, znakowanemu białku związania się ze ściętym genomowym DNA, a następnie powinowactwu oczyszczającemu DNA związane z białkiem, a następnie fluorescencyjnemu znakowaniu DNA i hybrydyzacji z niestandardową macierzą kafelkową. Opisano również poprzednie kroki, które można wykorzystać do optymalizacji testu dla określonych regulatorów. Piki wygenerowane przez analizę danych tablicowych są wykorzystywane do przewidywania motywów miejsc wiązania, które są następnie weryfikowane eksperymentalnie. Przewidywania dotyczące motywów mogą być dalej wykorzystywane do określania celów genowych regulatorów odpowiedzi ortologicznej u blisko spokrewnionych gatunków. Wykazujemy możliwość zastosowania tej metody, określając cele genów i motywy miejsc wiązania, a tym samym przewidując funkcję DVU3023 regulatora odpowiedzi zależnego od sigma54 w bakterii środowiskowej Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Wprowadzenie

Zdolność bakterii do przetrwania i rozwoju zależy w krytyczny sposób od tego, jak dobrze potrafią one postrzegać i reagować na zaburzenia w ich środowisku, co z kolei zależy od ich systemów transdukcji sygnału. Liczba systemów sygnalizacyjnych zakodowanych w bakterii została określona mianem jej „mikrobowego IQ” i może stanowić wskaźnik zarówno zmienności jej środowiska, jak i zdolności do wykrywania wielu sygnałów oraz precyzyjnego dostrajania reakcji1. Dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału (TCS) są najpowszechniejszymi systemami sygnalizacyjnymi wykorzystywanymi przez bakterie i składają się z histydynowej kinazy (HK), która wykrywa sygnał zewnętrzny i przekazuje go poprzez fosforylację do efektorowego regulatora odpowiedzi (RR)2. RR mogą posiadać różne domeny wyjściowe, a tym samym różne tryby efektorowe, jednak najczęstszą odpowiedzią jest regulacja transkrypcyjna za pośrednictwem domeny wiążącej DNA1. Sygnały wykrywane oraz odpowiadające im funkcje ogromnej większości TCS pozostają nieznane.

Choć metody in vivo, takie jak ChIP-chip, są rutynowo stosowane do wyznaczania genomowych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych3, mogą one być wykorzystane w przypadku bakteryjnych regulatorów odpowiedzi (RR) systemów dwuskładnikowych tylko wtedy, gdy znane są warunki lub sygnały aktywujące. Często sygnały środowiskowe aktywujące system dwuskładnikowy (TCS) są trudniejsze do ustalenia niż ich geny docelowe. Opisany tutaj test oparty na mikromacierzach in vitro może być wykorzystany do skutecznego i szybkiego wyznaczania genów docelowych oraz przewidywania funkcji TCS. Test ten wykorzystuje fakt, że RR mogą zostać ufosforylowane, a w konsekwencji aktywowane in vitro przy użyciu małocząsteczkowych donorów, takich jak fosforan acetylowy4.

W tej metodzie, nazwanej DAP-chip (chip z oczyszczaniem powinowactwa do DNA) (Rysunek 1), badany gen RR jest klonowany z tagiem His w E. coli, a następnie oczyszczone białko z tagiem wiąże się z pociętym DNA genomicznym. DNA związane z białkiem jest następnie wzbogacane poprzez oczyszczanie powinowactwa, a wzbogacone i wejściowe DNA są amplifikowane, znakowane fluorescencyjnie, łączone i hybrydyzowane z matrycą tilingową wykonaną na zamówienie dla badanego organizmu (Rysunek 1). Eksperymenty z mikromacierzy są podatne na artefakty, dlatego stosuje się dodatkowe kroki w celu optymalizacji analizy. Jednym z takich kroków jest próba wyznaczenia jednego celu dla badanego RR przy użyciu testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) (patrz schemat w Rysunku 2). Następnie, po związaniu z DNA genomicznym i przeprowadzeniu etapów DAP, DNA związane z białkiem oraz DNA wejściowe są badane za pomocą qPCR, aby sprawdzić, czy pozytywny cel jest wzbogacony we frakcji związanej z białkiem w stosunku do frakcji wejściowej, co potwierdza optymalne warunki wiązania dla RR (Rysunek 2). Po hybrydyzacji z macierzą dane są analizowane w celu znalezienia szczytów o wyższej intensywności sygnału, wskazujących na loci genomiczne, w których związało się białko. Funkcje RR mogą zostać przewidziane na podstawie uzyskanych celów genowych. Docelowe loci genomiczne służą do przewidywania motywów miejsc wiązania, które są następnie walidowane eksperymentalnie za pomocą EMSA (Rysunek 2). Przewidywania funkcjonalne i cele genowe dla RR mogą być następnie rozszerzone na blisko spokrewnione gatunki kodujące ortologiczne RR poprzez przeszukiwanie tych genomów pod kątem podobnych motywów wiązania (Rysunek 2). Metoda DAP-chip może dostarczyć bogactwa informacji dla TCS, w przypadku których wcześniej ich brakowało. Metodę tę można stosować dla każdego regulatora transkrypcji, jeśli białko może zostać oczyszczone i można określić warunki wiązania DNA, a także dla każdego badanego organizmu, dla którego dostępna jest sekwencja genomu.

Schemat procesu ekspresji genu; E. coli, ekspresja RR-His, oczyszczanie Ni-NTA, amplifikacja DNA.
Rysunek 1. Strategia DAP-chip (DNA-affinity-purified-chip)7. Gen RR z badanego organizmu jest klonowany wraz z His-tagiem na koniec karboksylowym do szczepu ekspresyjnego E. coli. Oczyszczone białko z His-tagiem jest aktywowane poprzez fosforylację fosforanem acetylu, a następnie mieszane z pofragmentowanym genomowym DNA. Alikwot reakcji wiązania jest zachowany jako DNA wejściowe (input), natomiast reszta poddawana jest oczyszczaniu powinowactwa przy użyciu żywicy Ni-NTA. DNA wejściowe oraz DNA związane z RR poddawane są amplifikacji całego genomu, a następnie odpowiednio znakowane barwnikami Cy3 i Cy5. Znakowane DNA są łączone i hybrydyzowane z macierzą tilingową, która jest następnie analizowana w celu określenia genów docelowych. Rysunek zmodyfikowany i przedrukowany na podstawie licencjonowanego materiału Creative Commons z7.

Schemat analizy oddziaływań białko-DNA; etapy EMSA i qPCR dla przewidywań funkcjonalnych.
Rycina 2. Podsumowanie schematu postępowania. W przypadku każdego oczyszczonego białka z etykietą należy rozpocząć od wyznaczenia celu za pomocą EMSA. Pozostawić białko do związania z DNA genomowym, a następnie przeprowadzić oczyszczanie z powinowactwem do DNA (DAP) oraz amplifikację całego genomu (WGA) wzbogaconego DNA oraz DNA wejściowego. Jeśli cel genowy jest znany, należy użyć qPCR, aby upewnić się, że znany cel jest wzbogacony we frakcji związanej z białkiem. Jeśli nie udało się wyznaczyć celu, należy przejść bezpośrednio do znakowania DNA i hybrydyzacji na macierzach. Jeśli nie zaobserwowano wzbogacenia w qPCR, należy powtórzyć etapy wiązania białka z gDNA oraz DAP-WGA, stosując inne ilości białka. Wykorzystać analizę macierzy do znalezienia pików i przypisania ich do genów docelowych. Użyć regionów powyżej genów docelowych do przewidywania motywów miejsc wiązania. Zweryfikować motywy eksperymentalnie za pomocą EMSA. Wykorzystać motyw do przeszukiwania genomów gatunków pokrewnych kodujących ortologi badanego RR i przewidzieć geny docelowe również w tych gatunkach. Na podstawie uzyskanych celów genowych można przewidzieć funkcję fizjologiczną RR i jego ortologów. Rycina zmodyfikowana i przedrukowana na podstawie licencji Creative Commons z7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Poniższy protokół jest dostosowany do określania celów genowych DVU3023 RR z bakterii Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Można go dostosować do dowolnego innego regulatora transkrypcji, który Cię interesuje.

1. Klonowanie i oczyszczanie RR

  1. Sklonuj gen RR, a konkretnie DVU3023, z D. vulgaris Hildenborough do wektora ekspresyjnego Escherichia coli tak, aby gen był C-terminalnie znakowany His, a ekspresja była pod kontrolą promotora T7.
    Uwaga: Można zastosować kilka metod klonowania, które są określane przez badacza. Można również używać alternatywnych tagów koligacji.
  2. Przekształć konstrukt wyrażenia w szczep ekspresyjny E. coli BL21 (DE3).
  3. Dosyć 1 l odmiany BL21 expression w temperaturze 37 °C. W połowie fazy logarytmicznej dodaj IPTG do 0,5 mM, aby indukować ekspresję białka. Kontynuuj wzrost w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
  4. Odwirować komórki przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić komórki w buforze do lizy (20 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazolu, 1 mg/ml lizozymu, 1x nukleaza benzonazowa). Lizować komórki za pomocą prasy francuskiej w temperaturze 4 °C.
  5. Odwirować lizat przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
  6. Przemyć 1 ml kolumny sefarozy Ni na przyrządzie FPLC przy użyciu 10 ml buforu do przemywania (20 mM fosforan sodu, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol).
  7. Załaduj lizat na kolumnę. Przepłukać kolumnę 20 ml buforu do przemywania wodą.
  8. Elute DVU3023 za pomocą gradientu 0-100% buforu elucyjnego (20 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazolu).
  9. Załadować eluowane frakcje do kolumny odsalającej i przemyć buforem odsalającym (20 mM fosforan sodu o pH 7,4, 100 mM NaCl).
  10. Odwirować próbkę białka w filtrze wirówkowym o wysokiej masie cząsteczkowej w celu zagęszczenia białka. Dodaj DTT do 0,1 mM i glicerol do 50% i przechowuj białko w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: Metody oczyszczania będą musiały być zoptymalizowane indywidualnie dla każdego badanego białka.

2. Określ cel genu dla RR za pomocą testu przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA)

  1. PCR amplifikuje region 400 pz przed kandydującym genem docelowym DVU3025, używając genomowego DNA D. vulgaris Hildenborough jako matrycy oraz nieznakowanego startera do przodu i startera znakowanego odwróconą 5'-biotyną.
    Uwaga: Wskazówki dotyczące wyboru kandydującego genu docelowego: Często RR wiążą regiony nadrzędne własnego genu/operonu lub mogą regulować geny kodowane proksymalnie. Jeśli RR ma ortologi u innych gatunków, poszukaj genów, które są konserwatywne w sąsiedztwie. Alternatywne metody obejmują wybór genów kandydujących na podstawie przewidywań regulonów (np. RegPrecise5) lub przewidywanie promotorów zależnych od sigma546 dla RR, które same są zależne od sigma54.
  2. Uruchom produkt PCR na 1% żelu agarozowym, wytnij produkt o rozmiarze 400 pz i oczyść DNA za pomocą zestawu do czyszczenia ekstrakcji żelu.
  3. Wymieszaj białko DVU3023 (0,5 pmol) ze 100 fmol biotynylowanego substratu DNA w 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25% glicerolu i 1 μg/ml poli dI.dC (niespecyficzne konkurencyjne DNA) w łącznej objętości 20 μl. Ustaw również reakcję bez żadnego białka jako kontrolę. Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej na stole przez 20 minut.
  4. Uwaga: Są to wymienione warunki standardowe i inne składniki reakcji mogą być dodawane w zależności od interesującego RR. Jeśli pożądana jest aktywacja, dodaj do reakcji 50 mM fosforanu acetylu (często RR wiążą DNA in vitro bez aktywacji).
  5. Uruchom prefabrykowany mini żel 6% poliakryloamid-0,5x TBE w 0,5x buforze TBE przy 100 V przez 30 minut. Dodaj 5 μl 5x buforu ładującego (0,1% błękitu bromofenolowego, 0,1% cyjanolu ksylenowego, 30% glicerolu w 1x TBE) do reakcji wiązania i załaduj 18 μl reakcji do żelu. Praca pod napięciem 100 V przez 2 godz.
    Uwaga: Aby uniknąć przegrzania, które może prowadzić do dysocjacji kompleksów białko-DNA, należy wypełnić zewnętrzną komorę buforową w systemie elektroforezy buforem pracującym tak, aby większość żelu była izolowana buforem. Alternatywnie żel może być podawany w temperaturze 4 °C.
  6. Wytnij naładowaną nylonową membranę do rozmiaru żelu i zanurz ją w 0,5x TBE przez co najmniej dziesięć minut. Wyjmij żel z kasety. Odetnij wszelkie grzbiety żelu i umieść żel i membranę między dwiema grubymi bibułami filtracyjnymi nasączonymi 0,5x TBE, a następnie umieść w półsuchym aparacie do bibuły i pracuj pod napięciem 20 V przez 30 minut.
  7. Umieść membranę w komercyjnym przyrządzie sieciującym światłem UV i ustaw czas na 3 min.
    Uwaga: Membrana może być teraz przechowywana w suchym miejscu w temperaturze pokojowej przez kilka dni przed przejściem do następnego kroku.
  8. Użyj dostępnego na rynku zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnego, który wykorzystuje koniugat streptawidyny i peroksydazy chrzodkwi w celu wytworzenia blot zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Zobrazuj plamę za pomocą komputera podłączonego do kamery wyposażonej w matrycę CCD i poszukaj zmiany w ruchliwości substratu DNA w obecności RR, co wskazuje, że RR wiąże badane DNA.
    Uwaga: Specyficzność przesunięcia białko-DNA można przetestować, włączając do reakcji nadmiar nieznakowanego DNA konkurenta, co powinno wyeliminować lub zmniejszyć obserwowane przesunięcie.

3. Sprawdź wzbogacenie celu po powiązaniu genomu DNA-białko

  1. Reakcja wiązania genomowego DNA-białko
    1. Ścinanie genomowego DNA do średniej wielkości 500 pz poprzez sonikację 100 μl genomowego DNA (w stężeniach 100-200 ng/μl) w probówce do mikrofug o pojemności 1,5 ml za pomocą mikrokońcówki z 9 impulsami o niskiej amplitudzie po 1 sekundę, z 2-sekundową przerwą między każdymi.
      Uwaga: Jeśli DNA rozprysknie się na boki probówki, odkręć zawartość po każdych 3 impulsach. Dokładne warunki będą się różnić w zależności od użytego instrumentu sonifikatora. Ścięte fragmenty DNA mogą mieć od 100 do 1000 pz, ale średnia wielkość powinna mieścić się w granicach 400-600 pz. Zbyt duże ścinanie może skutkować mniejszą liczbą nienaruszonych miejsc wiązania, a zbyt duże lub zbyt małe ścinanie wpłynie na przygotowanie biblioteki podczas dalszych etapów amplifikacji całego genomu.
    2. Wymieszaj 2-3 μg ściętego genomowego DNA z białkiem RR (0,5 pmol DVU3023) w 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 25% glicerolu i 50 mM fosforanu acetylu. Inkubować reakcje w temperaturze 25 °C przez 30 minut. Przenieść 10 μl tej reakcji do probówki o pojemności 1,5 ml i oznaczyć jako wejściowe DNA.
      Uwaga: Fosforan acetylu jest dodawany w celu aktywacji białka przez fosforylację in vitro. Fosforylacja stymuluje wiązanie DNA, ale wiele RR wiąże również DNA in vitro bez aktywacji7. Ilość białka dodanego do reakcji będzie zależeć od aktywności preparatu białkowego. Do optymalizacji tej kwoty można wykorzystać EMSA.
  2. Powinowactwo oczyszcza DNA związane z białkami
    1. Dodać 30 μl żywicy agarozowej Ni-NTA do probówki o pojemności 0,6 ml. Wirować przy 100 x g przez 1 minutę, aby zebrać żywicę na dnie i usunąć supernatant. Dodać 100 μl buforu do przemywania (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 25% glicerolu), przesunąć probówkę do wymieszania i odwirować przy 100 x g przez 2 min. Usunąć supernatant.
    2. Dodać pozostałe 90 μl reakcji wiązania do przemytej żywicy Ni-NTA i inkubować w wytrząsarce obrotowej przez 30 minut.
    3. Wirować przy 100 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant (niezwiązane DNA). Dodać 100 μl buforu do płukania, przesunąć probówkę do wymieszania zawartości i odwirować przy 100 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.
    4. Dodać 35 μl buforu elucyjnego (20 mM buforu fosforanu sodu o pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM imidazolu) do żywicy i wymieszać przez wirowanie. Inkubować na ławce w RT przez 5 minut. Wirować przy 100 x g przez 2 min. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i oznaczyć jako frakcję DNA związaną z białkiem.
    5. Dodać również 35 μl buforu elucyjnego do wejściowego DNA.
    6. Oczyść wejściowe i związane z białkiem frakcje DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
  3. Cały genom amplifikuje wejściowe i związane z białkiem próbki DNA.
    1. Dodaj 10 μl wejściowego i związanego z białkiem DNA do oddzielnych probówek PCR. Do każdej próbki dodać 1 μl 10-krotnego buforu do fragmentacji, 2 μl buforu do przygotowania biblioteki i 1 μl roztworu stabilizacji biblioteki. Dobrze wymieszaj, wirując. Podgrzewać w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 2 minuty i schładzać na lodzie.
      Uwaga: Początkowa ilość DNA powinna wynosić co najmniej 10 ng, aby uniknąć wprowadzenia błędu amplifikacji.
    2. Dodać 1 μl enzymu do przygotowywania z biblioteki, wymieszać pipetując i inkubować w termocyklerze w temperaturze 16 °C/20 min, 24 °C/20 min, 37 °C przez 20 min, 75 °C/5 min i trzymać w temperaturze 4 °C.
    3. Do każdej probówki dodaj 47,5 μl wody, 7,5 μl 10-krotnej amplifikacji głównej mieszanki i 5 μl polimerazy. Dobrze wymieszać i podgrzać w temperaturze 95 °C/3 min, a następnie 20 cykli po 94 °C/15 sekund, 65 °C/5 min. Reakcje utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    4. Oczyść amplifikowane próbki DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i zmierz stężenie DNA spektrofotometrycznie.
  4. Weryfikacja docelowego wzbogacenia w DNA związanym z białkiem za pomocą qPCR
    1. Zaprojektuj startery qPCR do amplifikacji 200 pz regionu poprzedzającego gen docelowy (DVU3025) zweryfikowany przez EMSA przy użyciu dowolnego bezpłatnego oprogramowania do projektowania starterów.
    2. Ustaw potrójne reakcje qPCR dla każdej matrycy DNA z każdym zestawem starterów. Przygotuj mieszankę wzorcową dla każdego zestawu podkładów. 1x master mix zawiera 10 μl 2x Sybr Green qPCR mix, 0,5 μM każdego podkładu i wodę do łącznej ilości 18 μl. Podwielokrotność 18 μl mieszanki wzorcowej na basenik 96-dołkowej płytki PCR.
    3. Rozcieńczyć amplifikowane i oczyszczone próbki wejściowe i związane z białkiem próbki DNA do 5 ng/μl wodą i użyć jako matrycy DNA. Dodaj 2 μl matrycy DNA do studzienek.
    4. Uszczelnij płytkę ultra przezroczystą folią uszczelniającą qPCR, odwiruj płytkę w wirówce przy 200 x g/1 min. Umieść płytkę w maszynie qPCR w czasie rzeczywistym. Cykl w następujący sposób za pomocą odpowiedniego oprogramowania qPCR: 95 °C/1 min i 40 cykli 95 °C/10 sekund, 59 °C/15 sekund i 70 °C/35 sek.
    5. Przygotuj również potrójne reakcje qPCR ze starterami w celu amplifikacji regionów poprzedzających niepowiązany gen (kontrola negatywna).
    6. Obliczyć ΔCT, odejmując wartość CT DNA związanego z białkiem od wartości wejściowego DNA. Obliczać fałdowanie wzbogacenia genu docelowego w DNA związanym z białkiem jako 2ΔCT.
      Uwaga: Jeśli docelowy region nadrzędny został wzbogacony w DNA związany z białkiem w porównaniu z DNA wejściowym, oznacza to, że reakcje wiązania i oczyszczanie powinowactwa zakończyły się sukcesem. Przejdź do kroku 4. Jeśli nie zaobserwowano wzbogacenia docelowego regionu poprzedzającego, należy powtórzyć reakcje wiązania (krok 3.1) z inną ilością białka.

4. Etykietowanie DNA i hybrydyzacja macierzy

  1. Oznacz wejściowe DNA za pomocą Cy3 i wzbogacone DNA za pomocą Cy5
    ote: Barwniki Cy3 i Cy5 są wrażliwe na światło i należy zachować ostrożność, aby ograniczyć ekspozycję na światło do minimum.
    1. Wymieszaj 1 μg DNA z 40 μl 9-merów znakowanych Cy3/Cy5 i dostosuj objętość do 80 μl z wodą.
    2. Denaturacja ciepła w temperaturze 98 °C przez 10 minut w ciemności (w termocyklerze). Szybkie schładzanie na lodzie przez 2 min.
    3. Do każdej reakcji dodać 2 μl polimerazy Klenowa (3'-5'-egzo-, 50 000 U/ml), 5 mM dNTP i 8 μl wody, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w ciemności (w termocyklerze).
    4. Dodaj EDTA do 50 mM, aby zatrzymać reakcję i roztwór NaCl do 0,5 M.
    5. Przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 0,9 objętości izopropanolu, inkubować w ciemności przez 10 minut i wirować przy 12 000 x g przez 10 minut. Osad powinien być różowy dla DNA znakowanego Cy3 i niebieski dla DNA znakowanego Cy5.
    6. Granulat przemyć 80% etanolem (500 μl) i odwirować przy 12 000 x g przez 2 min. Granulki suszyć na powietrzu przez 5-10 min w ciemności.
      Uwaga: Granulki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
    7. Zawiesić pelet w 25 μl wody. Zmierz stężenie DNA spektrofotometrycznie.
    8. Zebrać razem po 6 μg DNA znakowanego Cy3 i Cy5 w probówce o pojemności 1,5 ml i wysuszyć próżniowo w wirówce na małym ogniu w ciemności (przykryj pokrywę wirówki, jeśli jest przezroczysta).
      Uwaga: Granulki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu uzyskania gotowości do hybrydyzacji.
  2. Hybrydyzacja mikromacierzy
    1. Włącz system hybrydyzacji na 3-4 godziny przed użyciem i ustaw temperaturę na 42 °C.
    2. Przygotuj mieszankę główną roztworu do hybrydyzacji tak, aby 1x roztwór zawierał 11,8 μl 2x bufor hybrydyzacyjny, 4,7 μl składnika hybrydyzacyjnego A i 0,5 μl oligonutyku wyrównującego.
    3. Zawiesić granulki w 5 μl wody. Dodać 13 μl tej mieszaniny do próbki. Wirować przez 15 sekund, inkubować w temperaturze 95 °C w suchej łaźni przez 5 minut. Przechowywać próbki w temperaturze 42 °C w systemie hybrydyzacji do czasu, gdy będą gotowe do załadunku.
    4. Przygotuj zespół miksera do szkiełek z mikromacierzą, zgodnie z protokołem producenta.
    5. Umieść zespół mieszalnika-suwaka w systemie hybrydyzacji. Załadować 16 μl próbki do portu napełniania, uszczelnić porty folią samoprzylepną, włączyć mieszanie w systemie i hybrydyzować przez 16-20 godzin w temperaturze 42 °C.
    6. Przygotować 1x do przemywania I (250 ml), II (50 ml) i III (50 ml), rozcieńczając 10x dostępne w handlu w wodzie, a do każdego dodać DTT do 1 mM. Ciepły bufor I do 42 °C.
    7. Wsuń suwak miksera do narzędzia do demontażu i umieść w naczyniu zawierającym ciepły bufor I. Zdejmij mikser, energicznie potrząsając ręcznie narzędziem do demontażu.
    8. Umieścić szkiełko w pojemniku z 50 ml buforu do płukania I i energicznie wstrząsać ręcznie przez 2 minuty.
    9. Przenieś szkiełko do drugiego pojemnika z 50 ml buforem do płukania II i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 1 minutę.
    10. Przenieś szkiełko do trzeciego pojemnika z 50 ml buforem do przemywania III i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 15 sekund.
    11. Szybko osusz krawędzie szkiełka ręcznikiem papierowym i umieść w stojaku na slajdy. Wirować przy 200 x g przez 2 minuty, aby wysuszyć szkiełko. Umieść w szkiełkowym etui, owiń folią i przechowuj w eksykatorze.
  3. Skanowanie macierzy
    1. Umieść szkiełko w skanerze mikromatrycowym zgodnie z instrukcją urządzenia.
    2. Użyj oprogramowania skanera, aby ustawić długości fal jako 532 nm = Cy3 i 635 nm = Cy5, a początkowy fotopowielacz zyskuje od 350 do 400.
    3. Wyświetl podgląd slajdu, aby zlokalizować tablicę na slajdzie. Wybierz region macierzy do skanowania.
    4. Zeskanuj matrycę i dostosuj ustawienia fotopowielacza tak, aby cechy tablicy były w większości żółte. Histogram powinien pokazywać czerwoną i zieloną krzywą nałożoną na siebie lub jak najbliżej siebie. Krzywe powinny kończyć się powyżej 10-5 znormalizowanych liczb przy nasyceniu.
    5. Obrazy o długości fali 532 i 635 nm można zapisywać oddzielnie.
  4. Analiza danych tablicowych
    1. Zaimportuj obrazy do oprogramowania do analizy tablic. Korzystając z oprogramowania, utwórz dwa raporty par (.pair) dla każdej tablicy (dla obrazów Cy3 i Cy5). Utwórz skalowane pliki o proporcjach logarytmu2przy użyciu plików par. Użyj plików o współczynniku logarytmu2, aby wyszukać szczyty przy użyciu przesuwanego okna 500 bp. Mapuj loci pików do regionów znajdujących się w górnej części celów genowych.
    2. Sprawdź, czy dodatni cel (wyznaczony za pomocą EMSA i potwierdzony za pomocą qPCR, DVU3025 w tym przykładzie) pojawia się w obrębie najwyższych pików.
      Uwaga: Jeśli dodatni cel nie znajduje się wśród najwyższych trafień, możliwe jest, że rozważany RR ma kilka celów genowych i można przeprowadzić replikowane chipy DAP, a piki wspólne dla wszystkich powtórzeń można wykorzystać do wygenerowania listy celów.

5. Przewidywanie i walidacja motywu miejsca wiązania

  1. Pobierz sekwencje dla regionów nadrzędnych (400 pz) dla głównych celów genowych wygenerowanych przez analizę DAP-chip. Zastosuj MEME do tych sekwencji za pośrednictwem Microbes Online (meme.nbcr.net), aby przewidzieć motywy.
    Uwaga: Białka wiążące wzmacniacze, takie jak regulatory zależne od sigma54, mogą wiązać kilkaset par zasad przed miejscem startowym. W przypadku innych regulatorów transkrypcji wystarczający będzie krótszy obszar, taki jak 200 pz w górę.
  2. Zaprojektuj górną i dolną nić oligomerów DNA, które zawierają przewidywany motyw miejsca wiązania otoczony 10 zasadami na każdym końcu. Zamów górne pasmo 5' biotynylowane.
  3. Wymieszaj górne i dolne pasmo oligonukleotydów w stosunku 1:1,5 w 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA i 50 mM NaCl w całkowitej objętości reakcyjnej 20 μl w probówkach PCR. Ogrzewać do 95 °C przez 5 minut w termocyklerze, a następnie powoli schładzać do 25 °C. Rozcieńczyć dziesięciokrotnie i użyć jako substratu dsDNA typu dzikiego dla EMSA.
  4. Przygotuj zmodyfikowane podłoża, wykonując te same kroki, co powyżej, ale zaprojektuj oligomery tak, aby zawierały 4-6 podstawień w zachowanych podstawach motywu wiążącego.
  5. Ustawić reakcje wiązania z RR i substratami typu dzikiego lub zmodyfikowanymi i zbadać za pomocą EMSA, jak opisano w kroku 2.
  6. Uwaga: Przewidywany motyw jest zwalidowany, jeśli RR wiąże podłoże typu dzikiego, ale nie zmodyfikowane.

6. Zachowanie motywu u innych pokrewnych gatunków bakterii

  1. Wybierz interesujące Cię genomy, które zawierają ortologi DVU3023. Uzyskaj pliki sekwencji i adnotacji dla genomów ze strony NCBI.
  2. Użyj języka programowania, takiego jak Perl, do napisania skryptów, które będą wykorzystywać sekwencje motywów z celów chipa DAP do zbudowania macierzy ważonej pozycją i używać macierzy do oceny podobnych motywów obecnych w innych sekwencjonowanych genomach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powyższa metoda została zastosowana w celu określenia globalnych genów docelowych regulatorów odpowiedzi (RR) u modelowej bakterii redukującej siarczany Desulfovibrio vulgaris Hildenborough7. Organizm ten posiada liczne systemy dwuskładnikowe (TCS), reprezentowane przez ponad 70 RR, co wskazuje na szeroki wachlarz sygnałów, które bakteria ta wykrywa i na które reaguje. Analizy in vivo funkcji tych systemów sygnałowych są trudne do przeprowadzenia, ponieważ ich sygnały, a tym samym warunki akt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda DAP-chip została z powodzeniem wykorzystana do określenia celów genowych dla kilku RR w Desulfovibrio vulgaris Hildenborough7 , z których jeden jest pokazany tutaj jako reprezentatywny wynik. W przypadku DVU3023 RR wybór docelowego genu był prosty. DVU3025 znajduje się bezpośrednio za genem RR, a geny RR i docelowe są konserwatywne w kilku gatunkach Desulfovibrio , a dodatkowo ma DVU3025 przewidywany promotor zależny od sigma54. EMSA zapewnia prostą metodę szybkiego testo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Amy Chen za pomoc w przygotowaniach do sesji zdjęciowej i za zademonstrowanie techniki. Prace przeprowadzone przez ENIGMA: Ekosystemy i Sieci Zintegrowane z Genami i Zespołami Molekularnymi (http://enigma.lbl.gov), program naukowy w Lawrence Berkeley National Laboratory, były wspierane przez Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy nr 1. DE-AC02-05CH11231.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumna HisTrapFF (kolumna Ni-Sepharose)GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA17-5255-01
Eksplorator Akta (instrument FPLC)GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Kolumna odsalającaGE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA17-5087-01
Qiaquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen Inc, Walencja, CA, USA28704
Oligonukleotydy znakowane biotynąZintegrowane technologie DNA Niedotyczy
6% poliakrylamidu-0,5x TBE prefabrykowany mini żel opóźniający DNALife Technologies, Grand Island, NY, USAEC63652BOXAlternatywnie możesz wlać własny żel.
Membrananylonowa EMD Millipore, Billerica, MA, USAINYC00010
Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowaBiorad, Hercules, CA, USA170-3940
Bardzo gruby papier do bibuły, 8 x 13,5 cmBiorad, Hercules, CA, USA170-3967
Środek sieciujący UV Model XL-1000Fisher Scientific11-992-89
Zestaw do wykrywania chemiluminescencyjnego kwasu nukleinowego (Pierce)Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA89880
Żywica agarozowa Ni-NTAQiagen Inc, Walencja, CA, USA30210
Zestaw do amplifikacji całego genomu GenomePlex (bufor do fragmentacji, bufor do przygotowania biblioteki, roztwór stabilizujący bibliotekę, enzym do przygotowania biblioteki, 10-krotna amplifikacja główna mieszanka, polimeraza WGA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAWGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000Thermo Scientific, Wilmington, DE, USADo ilościowego oznaczania DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, z ROXQuanta biosciences95055-500Można użyć dowolnej mieszanki Sybr Green PCR
Przezroczysta folia termozgrzewalna PlateMax Ultra do qPCRAxygen
[header]
96-dołkowa, przezroczysta, niskoprofilowa mikropłytka PCRLife Technologies, Grand Island, Nowy Jork, Stany ZjednoczonePCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems System StepOne Plus Real Time PCRSystem Life Technologies, Grand Island, NY, USA4376600Można użyć dowolnego systemu do PCR w czasie rzeczywistym
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCRQiagen Inc, Walencja, CA, USA28104Można użyć dowolnego zestawu do czyszczenia PCR
Nieamers z oznaczeniem Cy3/Cy5Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USAN46-0001, N46-0002
Polimeraza Klenowa 50 000 U/ml, 3'-5' egzo-New England Biolabs, Ipswich, MAM0212M
System hybrydyzacjiRoche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/ATa firma nie produkuje już tablic ani powiązanych elementów, więc konieczne będzie użycie alternatywnych źródeł, takich jak Agilent lub Affymetrix.
Mikromacierze i miksery z nadrukiem na zamówienieRoche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A
Zestaw do hybrydyzacji (2x bufor hybrydyzacyjny, składnik hybrydyzacyjny A, oligo wyrównujący)Roche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A
Zestaw myjących (10x bufor do mycia I, II, III, 1 M DTT)Roche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A
Skaner mikromacierzy GenePix 4200AUrządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USATen model został zastąpiony lepszymi
Oprogramowanie do mikromacierzy GenePix ProMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
Nimblescan v.2.4, oprogramowanie do analizy chipów ChIPRoche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A

Bibliografia

  1. Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
  2. Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
  3. Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
  4. McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
  5. Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
  6. Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
  7. Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99(2011).
  8. Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
  9. Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
  10. Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
  11. Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
  12. Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
  13. Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
  14. Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
  15. Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
  16. Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
  17. Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
  20. Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134(2011).
  21. Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bakteryjne dwusk adnikowe systemy sygnalizacyjnewi zanie regulatora odpowiedziwi zanie genomowego DNAoczyszczanie powinowactwemhybrydyzacja na macierzach kafelkowychanaliza przesuni cia mobilno ci elektroforetycznejwalidacja predykcji motyw widentyfikacja gen w docelowychregulator zale ny od Sigma54

Powiązane artykuły