Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Podsumowanie

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Streszczenie

Metody in vivo, takie jak ChIP-chip, są dobrze znanymi technikami używanymi do określania globalnych celów genów dla czynników transkrypcyjnych. Mają one jednak ograniczone zastosowanie w badaniu dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakterii z niescharakteryzowanymi warunkami aktywacji. Takie systemy regulują transkrypcję tylko wtedy, gdy są aktywowane w obecności unikalnych sygnałów. Ponieważ sygnały te są często nieznane, metoda oparta na mikromacierzyach in vitro opisana w tym artykule wideo może być wykorzystana do określenia celów genów i miejsc wiązania regulatorów odpowiedzi. Ta metoda oczyszczonego chipa z powinowactwem DNA może być stosowana do dowolnego oczyszczonego regulatora w dowolnym organizmie ze zsekwencjonowanym genomem. Protokół polega na umożliwieniu oczyszczonemu, znakowanemu białku związania się ze ściętym genomowym DNA, a następnie powinowactwu oczyszczającemu DNA związane z białkiem, a następnie fluorescencyjnemu znakowaniu DNA i hybrydyzacji z niestandardową macierzą kafelkową. Opisano również poprzednie kroki, które można wykorzystać do optymalizacji testu dla określonych regulatorów. Piki wygenerowane przez analizę danych tablicowych są wykorzystywane do przewidywania motywów miejsc wiązania, które są następnie weryfikowane eksperymentalnie. Przewidywania dotyczące motywów mogą być dalej wykorzystywane do określania celów genowych regulatorów odpowiedzi ortologicznej u blisko spokrewnionych gatunków. Wykazujemy możliwość zastosowania tej metody, określając cele genów i motywy miejsc wiązania, a tym samym przewidując funkcję DVU3023 regulatora odpowiedzi zależnego od sigma54 w bakterii środowiskowej Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Wprowadzenie

Zdolność bakterii do przetrwania i rozwoju zależy w krytyczny sposób od tego, jak dobrze potrafią one postrzegać i reagować na zaburzenia w ich środowisku, co z kolei zależy od ich systemów transdukcji sygnału. Liczba systemów sygnalizacyjnych zakodowanych w bakterii została określona mianem jej „mikrobowego IQ” i może stanowić wskaźnik zarówno zmienności jej środowiska, jak i zdolności do wykrywania wielu sygnałów oraz precyzyjnego dostrajania reakcji¹. Dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału (TCS) są najpowszechniejszymi systemami sygnalizacyjnymi wykorzystywanymi przez bakterie i składają się z histydynowej kinazy (HK), która wykrywa sygnał zewnętrzny....

Protokół

Uwaga: Poniższy protokół jest dostosowany do określania celów genowych DVU3023 RR z bakterii Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Można go dostosować do dowolnego innego regulatora transkrypcji, który Cię interesuje.

1. Klonowanie i oczyszczanie RR

1. Sklonuj gen RR, a konkretnie DVU3023, z D. vulgaris Hildenborough do wektora ekspresyjnego Escherichia coli tak, aby gen był C-terminalnie znakowany His, a ekspresja była pod kontrolą promotora T7.
   Uwaga: Można zastosować kilka metod klonowania, które są określane przez badacza. Można również używać alternatywnych tagów koligacji.
2. Przekszta....

Wyniki

Powyższa metoda została zastosowana w celu określenia globalnych genów docelowych regulatorów odpowiedzi (RR) u modelowej bakterii redukującej siarczany Desulfovibrio vulgaris Hildenborough⁷. Organizm ten posiada liczne systemy dwuskładnikowe (TCS), reprezentowane przez ponad 70 RR, co wskazuje na szeroki wachlarz sygnałów, które bakteria ta wykrywa i na które reaguje. Analizy in vivo funkcji tych systemów sygnałowych są trudne do przeprowadzenia, ponieważ ich sygnały, a tym samym warunki akt.......

Dyskusja

Opisana tutaj metoda DAP-chip została z powodzeniem wykorzystana do określenia celów genowych dla kilku RR w Desulfovibrio vulgaris Hildenborough⁷ , z których jeden jest pokazany tutaj jako reprezentatywny wynik. W przypadku DVU3023 RR wybór docelowego genu był prosty. DVU3025 znajduje się bezpośrednio za genem RR, a geny RR i docelowe są konserwatywne w kilku gatunkach Desulfovibrio , a dodatkowo ma DVU3025 przewidywany promotor zależny od sigma54. EMSA zapewnia prostą metodę szybkiego testo.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolumna HisTrapFF (kolumna Ni-Sepharose)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5255-01
Eksplorator Akta (instrument FPLC)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Kolumna odsalająca	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5087-01
Qiaquick Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen Inc, Walencja, CA, USA	28704
Oligonukleotydy znakowane biotyną	Zintegrowane technologie DNA Nie	dotyczy
6% poliakrylamidu-0,5x TBE prefabrykowany mini żel opóźniający DNA	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	EC63652BOX	Alternatywnie możesz wlać własny żel.
Membrana	nylonowa EMD Millipore, Billerica, MA, USA	INYC00010
Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowa	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3940
Bardzo gruby papier do bibuły, 8 x 13,5 cm	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3967
Środek sieciujący UV Model XL-1000	Fisher Scientific	11-992-89
Zestaw do wykrywania chemiluminescencyjnego kwasu nukleinowego (Pierce)	Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA	89880
Żywica agarozowa Ni-NTA	Qiagen Inc, Walencja, CA, USA	30210
Zestaw do amplifikacji całego genomu GenomePlex (bufor do fragmentacji, bufor do przygotowania biblioteki, roztwór stabilizujący bibliotekę, enzym do przygotowania biblioteki, 10-krotna amplifikacja główna mieszanka, polimeraza WGA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA	Do ilościowego oznaczania DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, z ROX	Quanta biosciences	95055-500	Można użyć dowolnej mieszanki Sybr Green PCR
Przezroczysta folia termozgrzewalna PlateMax Ultra do qPCR	Axygen
[header]
96-dołkowa, przezroczysta, niskoprofilowa mikropłytka PCR	Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems System StepOne Plus Real Time PCR	System Life Technologies, Grand Island, NY, USA	4376600	Można użyć dowolnego systemu do PCR w czasie rzeczywistym
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR	Qiagen Inc, Walencja, CA, USA	28104	Można użyć dowolnego zestawu do czyszczenia PCR
Nieamers z oznaczeniem Cy3/Cy5	Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA	N46-0001, N46-0002
Polimeraza Klenowa 50 000 U/ml, 3'-5' egzo-	New England Biolabs, Ipswich, MA	M0212M
System hybrydyzacji	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A	Ta firma nie produkuje już tablic ani powiązanych elementów, więc konieczne będzie użycie alternatywnych źródeł, takich jak Agilent lub Affymetrix.
Mikromacierze i miksery z nadrukiem na zamówienie	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Zestaw do hybrydyzacji (2x bufor hybrydyzacyjny, składnik hybrydyzacyjny A, oligo wyrównujący)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Zestaw myjących (10x bufor do mycia I, II, III, 1 M DTT)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Skaner mikromacierzy GenePix 4200A	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA	Ten model został zastąpiony lepszymi
Oprogramowanie do mikromacierzy GenePix Pro	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
Nimblescan v.2.4, oprogramowanie do analizy chipów ChIP	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A