Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Summary

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.

Abstract

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypu w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w klinicznym laboratorium diagnostycznym. DNA wyekstrahowane z próbki pacjenta (krew, ślina lub inne rodzaje tkanek) jest znakowane fluorochromem (cyjaniną 5 lub cyjaniną 3). Referencyjna próbka DNA jest znakowana przeciwległym fluorochromem. Następuje etap oczyszczania w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów, zanim znakowane DNA zostaną zmieszane i ponownie zawieszone w buforze hybrydyzacyjnym i zastosowane do macierzy składającej się z ~ 60 000 sond oligonukleotydowych z loci w całym genomie, o dużej gęstości sondy w klinicznie ważnych obszarach. Po hybrydyzacji matryce są myte, a następnie skanowane, a uzyskane obrazy są analizowane w celu zmierzenia czerwonej i zielonej fluorescencji dla każdej sondy. Oprogramowanie służy do oceny jakości każdego pomiaru sondy, obliczania stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej oraz wykrywania potencjalnych wariantów liczby kopii.

Introduction

Od wielu lat wiadomo, że delecje lub dodatkowe kopie segmentów chromosomów powodują niepełnosprawność intelektualną, dysmorfię i wrodzone wady rozwojowe, a w niektórych przypadkach powodują zespoły genetyczne¹. Jednak jedyną dostępną do połowy 2000 roku technologią do wykrywania tych zmian w całym genomie była analiza chromosomów z pasmem G, która ma rozdzielczość około 5-10 Mb, w zależności od regionu i charakteru nierównowagi, i która nie może wykryć nieprawidłowych chromosomów, w których materiał został zastąpiony regionem z innego chromosomu o tym samym schemacie prążkowania. Pomocnicze techniki cytogenetyczne, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja

Protocol

1. Reakcja na etykietowanie

1. Przed użyciem wstępnie wyznacznikowane cyjaniną 3 i 5 dUTP, nieznakowane nukleotydy i losowe startery w stężeniach zalecanych przez producenta umieścić na 96-dołkowych płytkach i przechowywać w temperaturze -20 C w stanie gotowym do użycia. Do celów niniejszego protokołu, do każdego dołka należy podwielokrotność 10,5 μl odpowiedniego znakowanego dUTP i 10,5 μl nieznakowanych nukleotydów i losowych starterów.
2. Rozmrażać gotową do użycia 96-dołkową płytkę nukleotydów i starterów w temperaturze 4 °C przez około 1 godzinę, chroniąc ją przed światłem.
3. Po rozmrożeniu należy zrównoważyć tę płytkę w temperaturze pokoj....

Results

Każda sonda na hybrydyzowanej tablicy jest wizualizowana jako mieszanina czerwonych i zielonych fluorochromów (zobacz Rysunek 1). Stosunek czerwonego do zielonego sygnału fluorescencyjnego dla każdej sondy jest określany ilościowo przez skaner, a powiązane oprogramowanie wykreśla je jako współczynniki log2 zgodnie z ich położeniem genomowym i identyfikuje obszary leżące poza ustalonymi granicami. Uzyskane w ten sposób ślady macierzy pozwalają na interpretację regionów zidentyfikowanych jako niezrównoważo.......

Discussion

Array CGH nie wykryje zrównoważonych rearanżacji ani nieprawidłowości ploidalnych, takich jak triploidia. Co więcej, nierównowaga mozaiki niskiego poziomu może nie zostać wykryta. Jednak matryca CGH ma wyższą rozdzielczość wykrywania CNV niż analiza chromosomów w pasmach G, którą zastąpiła w wielu laboratoriach cytogenetycznych. Jest to zatem obecnie złoty standard w wykrywaniu CNV w całym genomie. W przyszłości może zostać zastąpiona przez technologie sekwencjonowania nowej generacji, ale obecnie ich koszt i złożoność t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikromacierz CGH 8 x 60K	Agilent	G4126
Array płuczące CGH	Agilent	5188-5226
Bufor hybrydyzacyjny CGH	Agilent	5188-5380
Zestaw do oczyszczania Minelute	Qiagen	28006
Array Zestaw do etykietowania CGH	Enzo	ENZ-42672-0000