Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypu w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w klinicznym laboratorium diagnostycznym. DNA wyekstrahowane z próbki pacjenta (krew, ślina lub inne rodzaje tkanek) jest znakowane fluorochromem (cyjaniną 5 lub cyjaniną 3). Referencyjna próbka DNA jest znakowana przeciwległym fluorochromem. Następuje etap oczyszczania w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów, zanim znakowane DNA zostaną zmieszane i ponownie zawieszone w buforze hybrydyzacyjnym i zastosowane do macierzy składającej się z ~ 60 000 sond oligonukleotydowych z loci w całym genomie, o dużej gęstości sondy w klinicznie ważnych obszarach. Po hybrydyzacji matryce są myte, a następnie skanowane, a uzyskane obrazy są analizowane w celu zmierzenia czerwonej i zielonej fluorescencji dla każdej sondy. Oprogramowanie służy do oceny jakości każdego pomiaru sondy, obliczania stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej oraz wykrywania potencjalnych wariantów liczby kopii.
Wprowadzenie
Od wielu lat wiadomo, że delecje lub dodatkowe kopie segmentów chromosomów powodują niepełnosprawność intelektualną, dysmorfię i wrodzone wady rozwojowe, a w niektórych przypadkach powodują zespoły genetyczne1. Jednak jedyną dostępną do połowy 2000 roku technologią do wykrywania tych zmian w całym genomie była analiza chromosomów z pasmem G, która ma rozdzielczość około 5-10 Mb, w zależności od regionu i charakteru nierównowagi, i która nie może wykryć nieprawidłowych chromosomów, w których materiał został zastąpiony regionem z innego chromosomu o tym samym schemacie prążkowania. Pomocnicze techniki cytogenetyczne, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i amplifikacja sondy specyficznej dla ligacji multipleksowej, były dostępne do badania określonych loci w przypadkach podejrzenia specyficznej nierównowagi syndromicznej, ale nie było to aż do wprowadzenia porównawczej hybrydyzacji genomowej (macierzy CGH) do rutynowej klinicznej usługi diagnostycznej2-5 To wykrywanie wariantów liczby kopii (CNV) w całym genomie stało się możliwe przy znacznie zwiększonej rozdzielczości (zwykle około 120 KB). Prace kliniczne prowadzone równolegle z badaniami naukowymi wykazały, że CNV w niektórych regionach są szeroko rozpowszechnione w normalnej populacji6-7, podczas gdy inne CNV, wcześniej niewykrywalne, są związane z niepełnosprawnościami neurologicznymi, takimi jak autyzm i padaczka8-11.
Protokół opisany w tym artykule jest używany w naszym klinicznym laboratorium diagnostycznym brytyjskiej Narodowej Służby Zdrowia (NHS); używamy nowatorskich strategii hybrydyzacji, testów wsadowych i robotyki, aby zminimalizować koszty w tej finansowanej przez państwo usłudze.
Przed opisanym poniżej protokołem, wysokiej jakości DNA powinno być ekstrahowane z odpowiedniego materiału wyjściowego, zwykle krwi, hodowanych komórek lub próbek tkanek. Spektrofotometria może być używana do pomiaru stężenia (powinno wynosić >50 ng/ul) i sprawdzania współczynników absorbancji 260:280 (powinno wynosić 1,8-2,0). Elektroforeza żelowa może być stosowana do sprawdzania, czy DNA ma wysoką masę cząsteczkową bez znaczącej degradacji.
Ten protokół jest przeznaczony dla laboratoriów o wyższej przepustowości, które oznaczają 96 próbek na przebieg za pomocą zautomatyzowanej robotyki do obsługi cieczy. Można go jednak dostosować do laboratoriów o niższej przepustowości bez automatyzacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Reakcja na etykietowanie
- Przed użyciem wstępnie wyznacznikowane cyjaniną 3 i 5 dUTP, nieznakowane nukleotydy i losowe startery w stężeniach zalecanych przez producenta umieścić na 96-dołkowych płytkach i przechowywać w temperaturze -20 C w stanie gotowym do użycia. Do celów niniejszego protokołu, do każdego dołka należy podwielokrotność 10,5 μl odpowiedniego znakowanego dUTP i 10,5 μl nieznakowanych nukleotydów i losowych starterów.
- Rozmrażać gotową do użycia 96-dołkową płytkę nukleotydów i starterów w temperaturze 4 °C przez około 1 godzinę, chroniąc ją przed światłem.
- Po rozmrożeniu należy zrównoważyć tę płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, chroniąc ją przed światłem.
- Równoważyć próbki DNA w temperaturze 60 °C przez co najmniej 15 minut.
- Za pomocą robota do obsługi cieczy dozuj wodę wolną od nukleaz do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce.
UWAGA: Objętość wody będzie zależeć od stężenia każdej wejściowej próbki DNA i powinna być wystarczająca, aby uzyskać końcowe stężenie 50 ng / ul. - Używając robota do obsługi cieczy, odpipetować 1 μg DNA do dołka na płytce 96-dołkowej (patrz 1.5), aby uzyskać całkowitą objętość do 20 μl.
UWAGA: Można użyć mniejszych ilości DNA, chociaż jakość uzyskanych danych może być zagrożona (w przypadku cennych próbek można użyć wejściowych ilości DNA do 400 ng). - Za pomocą robota do obsługi cieczy przenieś 20 μl zrównoważonych nukleotydów i starterów do każdej studzienki płytki rozcieńczonego DNA.
- Uszczelnij 96-dołkową płytkę nakrętkami paskowymi (kluczowe znaczenie ma szczelne uszczelnienie).
- Denaturować DNA w temperaturze 99 °C przez 10 minut w maszynie do PCR z podgrzewaną pokrywką, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut, aby wyżarzyć startery.
- Za pomocą robota do obsługi cieczy dodaj 10 μl enzymu polimerazy DNA Klenow Exo do każdego DNA i dokładnie wymieszaj pipetą.
UWAGA: Całkowita objętość powinna wynosić 50 μl. - Zamknąć 96-dołkową płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godz.
UWAGA: Wystarczająca jest krótsza inkubacja trwająca 4 godziny, jednak inkubacja O/N może być wygodniejsza. - Za pomocą robota do obsługi cieczy dodać 5 μl buforu zatrzymującego do każdej studzienki.
UWAGA: Podsumowanie odczynników stosowanych w reakcji znakowania przedstawiono w Tabeli 1.
2. Usuwanie nieinkorporowanych nukleotydów
- Usuń nieinkorporowane nukleotydy za pomocą kolumn wirowych opartych na membranie krzemionkowej i dedykowanego robota przetwarzającego kolumny wirowe (kolumny wirowe mogą być również przetwarzane ręcznie). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przenieść zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 2 ml; wstępnie oznaczyć je identyfikatorami studzienek.
UWAGA: Ten krok można wykonać ręcznie lub najlepiej za pomocą robota do obsługi cieczy. - Jeśli używasz robota przetwarzającego kolumnę wirową, załaduj robota probówkami o pojemności 2 ml, kolumnami wirowymi do oczyszczania DNA i powiązanymi.
- Dodać 250 μl buforu wiążącego DNA o wysokiej zawartości soli (bufor PB) do reakcji znakowania, aby związać znakowane DNA z błoną krzemionkową.
- Usunąć zanieczyszczenia poprzez dwukrotne przemycie membrany 500 μl buforem płuczącym (bufor PE).
- Dodać 15 μl buforu elucyjnego o niskiej zawartości soli (bufor EB) do membrany, aby odzyskać oczyszczone, znakowane DNA w objętości ~12 μl.
- Przenieść zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 2 ml; wstępnie oznaczyć je identyfikatorami studzienek.
3. Połącz pary Hyb
- Połącz odpowiednie pary DNA znakowanego cyjaniną 3 i 5, DNA COT-1, dostarczoną przez producenta mieszankę blokującą i dostarczony przez producenta bufor hybrydyzacyjny za pomocą robota do obsługi cieczy.
UWAGA: Te pary hyb mogą być próbką i odniesieniem lub próbka kontra próbka, jeśli wspólne CNV nie stanowią problemu (np. rutynowo łączymy w pary próbki niedopasowane fenotypiowo, takie jak pacjent z dysplazją nerek i pacjent z kraniosynostozą, ponieważ jest bardzo mało prawdopodobne, aby zawierały one ten sam klinicznie istotny CNV). W przypadku stosowania referencyjnego DNA zaleca się komercyjne zaopatrzenie go w DNA, które powinno być przetwarzane razem z próbką.- Za pomocą robota do obsługi cieczy dodaj DNA COT-1 (3333 ng / μl), dostarczoną przez producenta mieszankę blokującą i bufor hybrydyzacyjny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, tak aby każda studzienka zawierała 1,1 μl DNA COT-1, 4,95 μl mieszanki blokującej i 24,75 μl buforu hybrydyzacyjnego.
- Do każdej studzienki dodać 9,35 μl odpowiedniego DNA znakowanego cyjaniną 3. Wstępnie zwilż każdą końcówkę, aby zwiększyć dokładność pipetowania.
- Do każdej studzienki dodać 9,35 μl odpowiedniego DNA znakowanego cyjaniną 5. Wstępnie zwilż każdą końcówkę, aby zwiększyć dokładność pipetowania.
- Zamknij 96-dołkową płytkę i wiruj przez 1 minutę. Zakręć 96-dołkową płytką, aby zebrać zawartość na dnie każdej studzienki.
4. Hybrydyzacja
- Rozgrzej piec do hybrydyzacji do 65oC i podgrzej jedno szkiełko podstawowe i jedną komorę hybrydyzacyjną na każde szkiełko macierzy.
- Denaturować znakowane DNA w inkubacji przed hybrydyzacją przed nałożeniem na matryce. Wykonaj hybrydyzację w piecu obrotowym przez 24 godziny.
- Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 70 °C przez 30 minut, a następnie pozostawić w temperaturze 37 °C na co najmniej 5 minut.
- Pracując na podgrzewanej platformie w temperaturze 42 °C, przed użyciem załaduj każdy szkiełko nośne do komory hybrydyzacyjnej. Upewnij się, że przezroczysta część suwaka uszczelki jest wyrównana z "okienkową" częścią komory hybrydyzacji.
- Odpipetować 42 μl przygotowanej wcześniej mieszanki do hybrydyzacji (patrz sekcja 3) na odpowiednie miejsce na szkiełku podstawowym matrycy. Wstępnie zwilż każdą końcówkę, aby zwiększyć dokładność pipetowania. Powoli pipetuj na środek każdej pozycji, upewniając się, że płyn nie dotyka granicy gumowego pierścienia.
- Gdy wszystkie pozycje na szkiełku podkładowym zostaną wypełnione, ostrożnie opuść na nim suwak matrycy i zmontuj komorę hybrydyzacyjną. Upewnij się, że strona tablicy, na której znajduje się napis, jest skierowana w stronę suwaka podkładowego. Pamiętaj, aby całkowicie dokręcić komory hybrydyzacji.
- Sprawdź zmontowaną komorę hybrydyzacyjną. Upewnij się, że nie ma wycieku mieszanki hybrydyzacyjnej poza granice gumowego pierścienia, a każdy pęcherzyk powietrza ma wysokość ~ 4 mm, gdy komora hybrydyzacji spoczywa pionowo na swoim końcu. Obróć komorę hybrydyzacyjną i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza, które utknęły na miejscu i nie poruszają się. Jeśli jest którykolwiek z nich, mocno postukaj w ławkę. Sprawdź, czy wszystkie pęcherzyki powietrza się poruszają.
- Umieścić komorę hybrydyzacyjną w piecu obrotowym w temperaturze 65 °C na 24 godziny. Upewnij się, że wirnik piekarnika jest wyważony; w razie potrzeby użyj innych pustych komór.
5. Mycie i skanowanie slajdów
- Umyj matryce, aby usunąć nadmiar znakowanego DNA, a następnie zeskanuj, aby zmierzyć fluorescencję każdej sondy.
- Wyjmij komory hybrydyzacyjne z piekarnika i zdemontuj. Prowadnice i prowadnice uszczelek zostaną ze sobą sklejone; Zanurz je w buforze do mycia 1 i użyj plastikowych kleszczy o płaskich krawędziach, aby je podważyć.
- Wyrzuć suwak uszczelki i umieść suwak matrycy w stojaku zanurzonym w buforze 1.
- Umyj szkiełko w ~700 ml świeżego buforu do płukania 1 przez 5 minut, energicznie mieszając (użyj pcheł i mieszadła magnetycznego).
- Przenieś szkiełko do ~700 ml buforu do płukania 2 i myj przez 90 sekund, energicznie mieszając. Delikatnie wyjmij prowadnice matrycy z bufora płuczącego 2, powinny wyschnąć.
- Załaduj szkiełko matrycy do uchwytu suwaka skanera za pomocą osłony suwaka. Załaduj szkiełko do skanera macierzy i zeskanuj zgodnie z instrukcjami producenta macierzy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Każda sonda na hybrydyzowanej macierzy jest wizualizowana jako mieszanina czerwonych i zielonych fluorochromów (patrz Rysunek 1). Stosunek czerwonego do zielonego sygnału fluorescencji dla każdej sondy jest kwantyfikowany przez skaner, a powiązane oprogramowanie przedstawia je jako stosunki log2 w zależności od ich pozycji genomowej i identyfikuje regiony wykraczające poza określone granice. Powstałe profile macierzy pozwalają na interpretację regionów zidentyfikowanych jako niezrównoważone genomowo. Na ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Array CGH nie wykryje zrównoważonych rearanżacji ani nieprawidłowości ploidalnych, takich jak triploidia. Co więcej, nierównowaga mozaiki niskiego poziomu może nie zostać wykryta. Jednak matryca CGH ma wyższą rozdzielczość wykrywania CNV niż analiza chromosomów w pasmach G, którą zastąpiła w wielu laboratoriach cytogenetycznych. Jest to zatem obecnie złoty standard w wykrywaniu CNV w całym genomie. W przyszłości może zostać zastąpiona przez technologie sekwencjonowania nowej generacji, ale obecnie ich koszt i złożoność t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikromacierz CGH 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array płuczące CGH | Agilent | 5188-5226 | |
| Bufor hybrydyzacyjny CGH | Agilent | 5188-5380 | |
| Zestaw do oczyszczania Minelute | Qiagen | 28006 | |
| Array Zestaw do etykietowania CGH | Enzo | ENZ-42672-0000 |
Bibliografia
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365(2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
