Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypu w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w klinicznym laboratorium diagnostycznym. DNA wyekstrahowane z próbki pacjenta (krew, ślina lub inne rodzaje tkanek) jest znakowane fluorochromem (cyjaniną 5 lub cyjaniną 3). Referencyjna próbka DNA jest znakowana przeciwległym fluorochromem. Następuje etap oczyszczania w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów, zanim znakowane DNA zostaną zmieszane i ponownie zawieszone w buforze hybrydyzacyjnym i zastosowane do macierzy składającej się z ~ 60 000 sond oligonukleotydowych z loci w całym genomie, o dużej gęstości sondy w klinicznie ważnych obszarach. Po hybrydyzacji matryce są myte, a następnie skanowane, a uzyskane obrazy są analizowane w celu zmierzenia czerwonej i zielonej fluorescencji dla każdej sondy. Oprogramowanie służy do oceny jakości każdego pomiaru sondy, obliczania stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej oraz wykrywania potencjalnych wariantów liczby kopii.
Wprowadzenie
Od wielu lat wiadomo, że delecje lub dodatkowe kopie segmentów chromosomów powodują niepełnosprawność intelektualną, dysmorfię i wrodzone wady rozwojowe, a w niektórych przypadkach powodują zespoły genetyczne1. Jednak jedyną dostępną do połowy 2000 roku technologią do wykrywania tych zmian w całym genomie była analiza chromosomów z pasmem G, która ma rozdzielczość około 5-10 Mb, w zależności od regionu i charakteru nierównowagi, i która nie może wykryć nieprawidłowych chromosomów, w których materiał został zastąpiony regionem z innego chromosomu o tym samym schemacie prążkowania. Pomocnicze techniki cytogenetyczne, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Reakcja na etykietowanie
- Przed użyciem wstępnie wyznacznikowane cyjaniną 3 i 5 dUTP, nieznakowane nukleotydy i losowe startery w stężeniach zalecanych przez producenta umieścić na 96-dołkowych płytkach i przechowywać w temperaturze -20 C w stanie gotowym do użycia. Do celów niniejszego protokołu, do każdego dołka należy podwielokrotność 10,5 μl odpowiedniego znakowanego dUTP i 10,5 μl nieznakowanych nukleotydów i losowych starterów.
- Rozmrażać gotową do użycia 96-dołkową płytkę nukleotydów i starterów w temperaturze 4 °C przez około 1 godzinę, chroniąc ją przed światłem.
- Po rozmrożeniu należy zrównoważyć tę płytkę w temperaturze pokoj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Każda sonda na hybrydyzowanej macierzy jest wizualizowana jako mieszanina czerwonych i zielonych fluorochromów (patrz Rysunek 1). Stosunek czerwonego do zielonego sygnału fluorescencji dla każdej sondy jest kwantyfikowany przez skaner, a powiązane oprogramowanie przedstawia je jako stosunki log2 w zależności od ich pozycji genomowej i identyfikuje regiony wykraczające poza określone granice. Powstałe profile macierzy pozwalają na interpretację regionów zidentyfikowanych jako niezrównoważone genomowo. Na .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Array CGH nie wykryje zrównoważonych rearanżacji ani nieprawidłowości ploidalnych, takich jak triploidia. Co więcej, nierównowaga mozaiki niskiego poziomu może nie zostać wykryta. Jednak matryca CGH ma wyższą rozdzielczość wykrywania CNV niż analiza chromosomów w pasmach G, którą zastąpiła w wielu laboratoriach cytogenetycznych. Jest to zatem obecnie złoty standard w wykrywaniu CNV w całym genomie. W przyszłości może zostać zastąpiona przez technologie sekwencjonowania nowej generacji, ale obecnie ich koszt i złożoność t.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikromacierz CGH 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array płuczące CGH | Agilent | 5188-5226 | |
| Bufor hybrydyzacyjny CGH | Agilent | 5188-5380 | |
| Zestaw do oczyszczania Minelute | Qiagen | 28006 | |
| Array Zestaw do etykietowania CGH | Enzo | ENZ-42672-0000 |
Bibliografia
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
