Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych

Summary

Ten artykuł skupi się na rozwijaniu powierzchni pokrytych polimerem do długotrwałej, stabilnej hodowli ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Abstract

Obecnie jednym z głównych ograniczeń w biologii komórki jest utrzymanie zróżnicowanego fenotypu komórki. Matryce biologiczne są powszechnie stosowane do hodowli i utrzymywania pierwotnych i pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Chociaż matryce biologiczne są przydatne, pozwalają na krótkotrwałą hodowlę hepatocytów, co ogranicza ich powszechne zastosowanie. Podjęliśmy próbę pokonania tych ograniczeń za pomocą syntetycznej powłoki polimerowej. Polimery reprezentują jedną z najszerszych klas biomateriałów i posiadają szeroki zakres właściwości mechanicznych, fizycznych i chemicznych, które można dostosować do określonego celu. Co ważne, takie materiały mogą być skalowane do standardów gwarantowanej jakości i wykazywać spójność między partiami. Jest to niezbędne, jeśli komórki mają być namnażane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w przemyśle farmaceutycznym lub do terapii komórkowej. Poliuretany (PU) to jedna z grup materiałów, które okazały się obiecujące w hodowlach komórkowych. Przedstawiono i omówiono nasze ostatnie postępy w optymalizacji powierzchni pokrytej poliuretanem do długotrwałej hodowli ludzkich hepatocytów o stabilnym fenotypie.

Introduction

Materiały biologiczne są szeroko stosowane w utrzymaniu i różnicowaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych ¹. Chociaż to możliwe, te biologiczne substraty często zawierają niezliczoną ilość niezdefiniowanych składników. Matrigel jest powszechnie stosowanym substratem do hodowli i różnicowania komórek macierzystych. Niestety, jego zmienny skład wpływa na funkcjonowanie komórki i fenotyp. Chociaż zastosowano wiele alternatywnych, bardziej zdefiniowanych matryc biologicznych ^2-7, ich zwierzęce pochodzenie lub słaba skalowalność sprawiają, że nie są one odpowiednimi kandydatami do produkcji przemysłowej. Dlatego też identyfikacja syntetycznych alternatyw, o określonym składzie i niezawodnym działaniu, jest kluczowym celem w badaniach nad komórkami macierzystymi.

Próbując przezwyciężyć ograniczenia niezdefiniowanych substratów do hodowli komórkowych, interdyscyplinarna współpraca między chemią a biologią zidentyfikowała materiały syntetyczne, które mogą wspierać fenotyp komórki. Podłoża syntetyczne są skalowalne, opłacalne i mogą być wytwarzane w złożone struktury 3D, naśladując środowisko in vivo. Ze względu na te właściwości, syntetyczne substraty są szeroko stosowane do wspomagania i stymulowania różnicowania wielu typów komórek ^8-10.

Zaawansowane i wysokoprzepustowe testy ułatwiły szybkie badania przesiewowe materiałów syntetycznych z dużych bibliotek i dostarczyły nowatorskich materiałów o elastycznych właściwościach o szerokich zastosowaniach w badaniach i rozwoju biomedycznym ^11-13. Wykorzystując wysokowydajną technologię badań przesiewowych mikromacierzy polimerowych, szybko zidentyfikowaliśmy prosty poliuretan (PU134), odpowiedni do utrzymania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych. Stwierdzono, że polimer ten jest lepszy od substratów pochodzenia zwierzęcego pod względem różnicowania i funkcji hepatocytów ^14-16. Następnie zoptymalizowaliśmy warunki powlekania, topografię i proces sterylizacji, aby uzyskać dostęp do wpływu na wydajność polimeru w stabilizacji funkcji i żywotności hepatocytów. Ma to istotne implikacje w odniesieniu do zrozumienia podstaw biologii hepatocytów w modelowaniu komórkowym i zastosowaniach medycyny regeneracyjnej.

Opisana tutaj technologia stanowi przykład tego, jak powierzchnia syntetycznego polimeru może być zoptymalizowana w celu zachowania fenotypu komórki. Wierzymy, że połączenie tej technologii z wydajnym protokołem różnicowania hepatocytów wolnych w surowicy może zapewnić skalowalną produkcję hepatocytów do wykorzystania w modelowaniu in vitro i medycynie regeneracyjnej.

Protocol

1. Synteza PHNGAD (Poli[1,6-heksanodiol/glikol neopentylowy/di(glikol etylenowy)-kwas alt-adypinowy]diol)

Schemat 1: Synteza PHNAGD. Schematyczne przedstawienie syntezy PHNAGD. PHNAGD otrzymano w reakcji 1,6-heksanodiolu, glikolu dietylenowego, glikolu neoppentylowego i kwasu adypinowego. PHNAGD, poli[1,6-heksanodiol/glikol neopentylowy/di(glikol etylenowy)-kwas alt-adypinowy]diol.

1. Poddać działaniu ciepła monomery 1,6-heksanodiol, di(glikol etylenowy) i glikol neopentylowy w temperaturze 40 °C przez 48 godzin w piecu próżniowym w celu usunięcia resztek wody. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT w próżni.
2. Dodać 22 mmol każdego monomeru i kwasu adypinowego (55 mmol) do kolby okrągłodennej z dwiema szyjkami, wyposażonej w mieszadło i podłączonej do aparatu Deana-Starka.
3. Umieścić cały zestaw pod próżnią i delikatnie podgrzewać szkło w temperaturze 40 °C przez 6 godzin, aby uniknąć wchłaniania wilgoci podczas dodawania substancji chemicznej do kolby.
4. Dodać za pomocą strzykawki, kropla po kropli, 0,0055 mola butotlenku tytanu (IV) w katalizatorze.
5. Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze 180 °C, w atmosferze_N2 przez 24 godziny, a następnie zebrać pozostałą wodę w pułapce Deana-Starka. Pozwól produktowi ostygnąć do temperatury pokojowej.

2. Synteza PU134

Schemat 2: Synteza PU134. Schematyczne przedstawienie syntezy poliuretanu 134. PU134 otrzymano w reakcji 1,0 ekwiwalentu PHNGAD z 2,0 ekwiwalentem 4,4′-metylenobisu (izocyjanianu fenylu), a następnie przez dodanie 1,0 ekwiwalentu przedłużacza łańcucha 1,4-butanodiolu.

1. Zmieszać jeden równoważnik poliolu PHNGAD (Mn ~ 1,800 Da, 3,2 mmol) z dwoma odpowiednikami 4'4-metylenobis(izocyjanian fenylu) (6,4 mmol) w bezwodnym N,N-dimetyloformamidzie (12 ml).
2. Wymieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 70 °C, w atmosferze_N2.
3. Dodawać za pomocą strzykawki, kropla po kropli katalizator butotlenek tytanu (IV) (0,8% wag.).
4. Po 1 godzinie dodać jeden odpowiednik przedłużacza łańcucha 1,4-butanodiol (3,2 mmol). Zwiększyć temperaturę do 90 °C i mieszać przez 24 godziny w atmosferze_N2.
5. Po reakcji zebrać poliuretan przez wytrącanie, dodając eter dietylowy (można również użyć heksanu lub wody) kroplami do roztworu reakcyjnego, aż do wystąpienia wytrącenia.
6. Odwirować roztwór o stężeniu 5 300 x g przez 5 minut.
7. Zdekantować supernatant i wysuszyć w temperaturze 40 °C w piecu próżniowym do momentu odparowania rozpuszczalnika.
   Uwaga: W celu zapewnienia, że końcowy produkt reakcji posiada prawidłowe parametry dotyczące rozkładu masy cząsteczkowej, grup funkcyjnych polimeru oraz temperatur topnienia i zeszklenia, można stosować różne techniki i metody analityczne, takie jak chromatografia żelowa lub spektroskopia FITR.

3. Przygotowanie roztworów PU134

1. Odważyć 200 mg PU134 w szklanej butelce.
2. Rozcieńczyć PU134 do końcowego stężenia 2% w kilku rozpuszczalnikach: chloroform, mieszanina chloroformu i toluenu w stosunku 1:1, tetrahydrofuran oraz mieszanina tetrahydrofuranu i diklorometanu w stosunku 1:1.
   Uwaga: Wybór odpowiedniego rozpuszczalnika różni się w zależności od użytego polimeru. Różne rozpuszczalniki mają różne temperatury wrzenia, które mogą wpływać na rozpuszczalność polimeru.
3. Potrząsać roztworem energicznie przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wytrząsarki z prędkością 200 mot/min, aż roztwór stanie się jednorodny i nie będzie można zaobserwować osadu.

4. Powlekanie szkiełek PU134

1. Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 15 mm² na powlekarce wirowej.
2. Nanieść 50 μl roztworu PU134 na każdy za pomocą pipety. Dostosuj objętość roztworu PU134 odpowiednio do wymaganego rozmiaru szkiełka nakrywkowego, zachowując proporcjonalny stosunek objętości do powierzchni.
3. Wiruj każde szkiełko nakrywkowe przez 7 sekund przy 23 x g.
4. Szkiełko nakrywkowe suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny przed sterylizacją.

5. Napromieniowanie szkiełka nakrywkowego

1. Napromieniować promieniami gamma szkiełko nakrywkowe pokryte polimerem, nakładając dawkę 10 Grays za pomocą promiennika laboratoryjnego przez 12 minut.
2. Naświetlanie UV szkiełka nakrywkowego pokrytego polimerem za pomocą żarówki UV o mocy 30 W przez 16 minut z każdej strony.
3. Umieścić szkiełko nakrywkowe pokryte polimerem na odpowiedniej płytce do hodowli tkankowej zgodnie z rozmiarem szkiełka.

6. Skaningowa mikroskopia elektronowa

1. Szkiełko nakrywkowe z polimeru pokrytego złotem przez rozpylanie przez 200 sekund w atmosferze ciśnienia 5 x ^10-1 milibara.
2. Uchwyć mikrofotografie szkiełka nakrywkowego pokrytego polimerem za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego przy narastającym napięciu 20 kV w trybie wtórnego obrazowania elektronów.

7. Obserwacje mikroskopowe sił atomowych

1. Zeskanuj obszar powierzchni polimeru o wymiarach 20 x 20 μm.
2. Ustaw częstotliwość skanowania od 1,32 Hz do 1,60 Hz.
3. Ustaw rozdzielczość 512 x 512 pikseli w skanowanym regionie.
4. Obliczyć średnią kwadratową (RMS lub Rq) powłoki, korzystając ze średniej odchyleń wysokości pobranej ze średniej płaszczyzny danych obrazu, wyrażonej jako:
   
   Gdzie Zi to bieżąca wartość Z, a N to liczba punktów w danym obszarze.
5. 7.5 Oblicz odchylenie lub średnią chropowatość powierzchni (Ra) obrazu za pomocą,
   
   Gdzie Z (x) jest funkcją opisującą analizowany profil powierzchni pod względem wysokości (Z) i położenia (x) próbki na długości oceny "L". Ra reprezentuje średnią wartość powierzchni względem płaszczyzny środkowej.

8. Hodowla komórkowa i różnicowanie

1. Hodowla i różnicowanie ludzkiej linii embrionalnych komórek macierzystych (hESC) H9 zgodnie z opisem w Hay ¹⁷.
2. Odłączyć komórki za pomocą odczynnika dysocjacyjnego i ponownie umieścić je na szkiełkach pokrytych PU134 w 9 dniu procesu różnicowania, w obecności pożywki wolnej od surowicy, jak opisano w Szkolnicka ^18,19.
   Uwaga: Zastosowanie enzymatycznej dysocjacji komórek jest preferowane niż fizyczne odłączanie komórek.

9. Test funkcjonalny cytochromu p450

1. Zmierzyć aktywność CYP3A zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Inkubować hepatocyty pochodzące z hESC w dniu 13 lub dniu 19 i pożywkę bez komórek - jako kontrolę ujemną, z odpowiednim substratem przez 5 godzin w temperaturze 37 °C.
3. Zebrać supernatanty z komórek i pożywki, przeprowadzić test zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Zmierzyć poziom aktywności CYP i znormalizowany w stosunku do pola powierzchni (cm²).

10. Barwienie immunologiczne

1. Przemyć hepatocyty pochodzące z hESC PBS przez 1 minutę, powtórzyć dwa razy.
2. Dodaj lodowato zimny 100% metanol do utrwalenia komórek, umieść w temperaturze -20 °C na 10 minut.
3. Myj komórki PBS przez 5 minut i powtórz dwukrotnie.
4. Inkubować komórki z PBS/T (0,1% tween)/10% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Odessać roztwór PBST i dodać odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA, inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem O/N.
6. Myj komórki PBS/T (0,1% tween)/1% BSA przez 5 minut i powtórz trzy razy.
7. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciało w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA, dodać do komórek i inkubować w ciemności w temperaturze RT przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
8. Myj komórki PBS przez 5 minut i powtórz trzy razy.
9. Do każdej studzienki dodać MOWIOL 488 (zawierający DAPI 1:1 000), delikatnie dodać szkiełko nakrywkowe, aby zmniejszyć liczbę pęcherzyków powietrza. Przechowywać stałe ogniwa w temperaturze 4 °C w ciemności. Obserwuj barwienie za pomocą mikroskopu z odpowiednim filtrem i świetlówką. Zoptymalizowane przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe wymieniono w tabeli 1.

Results

Rozpuszczalnik polimerowy wpływa na topografię powierzchni pokrytej polimerem

Poliuretan 134 został rozpuszczony w chloroformie, samodzielnie lub w połączeniu z toluenem, tetrahydrofuranem lub dichlorometanem, a szkiełka zostały pokryte różnymi preparatami. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i mikroskopia sił atomowych (AFM) zostały wykorzystane do scharakteryzowania właściwości fizycznych powłok polimerowych (ryc. 1). Powłoka uzyskana przy użyciu toluen...

Discussion

Wiele z obecnych metod stosowanych do generowania hepatocytów z komórek macierzystych opiera się na niezdefiniowanych matrycach pochodzenia zwierzęcego. Substraty te mogą być kosztowne i bardzo zmienne, wpływając na funkcję i stabilność komórek, stanowiąc istotną barierę w stosowaniu. W związku z tym przeprowadziliśmy badania przesiewowe dla materiałów syntetycznych, które wspomagają hodowlę hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Zidentyfikowaliśmy prosty poliuretan (PU134), utworzony przez polimeryzację PHNGA...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synteza, przygotowanie, powlekanie i charakterystyka szkiełek nakrywkowych pokrytych polimerem PU134
Shaker	Edmun Bü HLER	KS-15
Naświetlacz	CIS Biointernational	IBL 637
Specjalistyczny system powlekania	wirowego	P-6708
Skaningowy mikroskop elektronowy	Mikroskop sił atomowych Philips	XL30CPSEM
	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
Żarówka UV	ESCO
NanoScope	VEECO		wersja 1.20
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	TH45200	Użyj oprogramowania Volocity 4
Płytki do hodowli tkankowych	Corning, Wielka Brytania	3527
szkiełka	Materiały laboratoryjne MIC3308
Glikol dietylenowy	Sigma– Aldrich	93171
1,6-heksanodiol	Sigma– Aldrich	240117
Glikol neopentylowy	Sigma– Aldrich	408255
Kwas adypinowy	Sigma– Aldrich	9582
bezwodny N,N-dimetyloformamid	Sigma– Aldrich	227056
Eter dietylowy	Sigma– Aldrich	676845
butoksydan tytanu (IV)	Sigma– Aldrich	244112
1,4-butanodiol	Sigma– Aldrich	493732
Piec próżniowy	Thermoscientific
4,4'-Metylenobis(izocyjanian fenylu)	Sigma– Aldrich	101688
Tetrahydrofuran	Sigma– Aldrich	401757
Powlekarka do natryskiwania	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer sola fizjologiczna (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Przechowywać w temperaturze pokojowej
PBST, PBS z 0,1% TWEEN 20	Zaopatrzenie laboratoriów naukowych Sp. z o.o	. EC607
Metanol	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich, Wielka Brytania	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Składa się z Tris HCl i glicerolu zgodnie z instrukcjami
Hodowla komórkowa i test funkcjonalny
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013