Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51723

⸱

26 września 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2School of Chemistry, University of Edinburgh, 3MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł skupi się na rozwijaniu powierzchni pokrytych polimerem do długotrwałej, stabilnej hodowli ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Streszczenie

Obecnie jednym z głównych ograniczeń w biologii komórki jest utrzymanie zróżnicowanego fenotypu komórki. Matryce biologiczne są powszechnie stosowane do hodowli i utrzymywania pierwotnych i pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Chociaż matryce biologiczne są przydatne, pozwalają na krótkotrwałą hodowlę hepatocytów, co ogranicza ich powszechne zastosowanie. Podjęliśmy próbę pokonania tych ograniczeń za pomocą syntetycznej powłoki polimerowej. Polimery reprezentują jedną z najszerszych klas biomateriałów i posiadają szeroki zakres właściwości mechanicznych, fizycznych i chemicznych, które można dostosować do określonego celu. Co ważne, takie materiały mogą być skalowane do standardów gwarantowanej jakości i wykazywać spójność między partiami. Jest to niezbędne, jeśli komórki mają być namnażane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w przemyśle farmaceutycznym lub do terapii komórkowej. Poliuretany (PU) to jedna z grup materiałów, które okazały się obiecujące w hodowlach komórkowych. Przedstawiono i omówiono nasze ostatnie postępy w optymalizacji powierzchni pokrytej poliuretanem do długotrwałej hodowli ludzkich hepatocytów o stabilnym fenotypie.

Wprowadzenie

Materiały biologiczne są szeroko stosowane w utrzymaniu i różnicowaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych 1. Chociaż to możliwe, te biologiczne substraty często zawierają niezliczoną ilość niezdefiniowanych składników. Matrigel jest powszechnie stosowanym substratem do hodowli i różnicowania komórek macierzystych. Niestety, jego zmienny skład wpływa na funkcjonowanie komórki i fenotyp. Chociaż zastosowano wiele alternatywnych, bardziej zdefiniowanych matryc biologicznych 2-7, ich zwierzęce pochodzenie lub słaba skalowalność sprawiają, że nie są one odpowiednimi kandydatami do produkcji przemysłowej. Dlatego też identyfikacja syntetycznych alternatyw, o określonym składzie i niezawodnym działaniu, jest kluczowym celem w badaniach nad komórkami macierzystymi.

Próbując przezwyciężyć ograniczenia niezdefiniowanych substratów do hodowli komórkowych, interdyscyplinarna współpraca między chemią a biologią zidentyfikowała materiały syntetyczne, które mogą wspierać fenotyp komórki. Podłoża syntetyczne są skalowalne, opłacalne i mogą być wytwarzane w złożone struktury 3D, naśladując środowisko in vivo. Ze względu na te właściwości, syntetyczne substraty są szeroko stosowane do wspomagania i stymulowania różnicowania wielu typów komórek 8-10.

Zaawansowane i wysokoprzepustowe testy ułatwiły szybkie badania przesiewowe materiałów syntetycznych z dużych bibliotek i dostarczyły nowatorskich materiałów o elastycznych właściwościach o szerokich zastosowaniach w badaniach i rozwoju biomedycznym 11-13. Wykorzystując wysokowydajną technologię badań przesiewowych mikromacierzy polimerowych, szybko zidentyfikowaliśmy prosty poliuretan (PU134), odpowiedni do utrzymania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych. Stwierdzono, że polimer ten jest lepszy od substratów pochodzenia zwierzęcego pod względem różnicowania i funkcji hepatocytów 14-16. Następnie zoptymalizowaliśmy warunki powlekania, topografię i proces sterylizacji, aby uzyskać dostęp do wpływu na wydajność polimeru w stabilizacji funkcji i żywotności hepatocytów. Ma to istotne implikacje w odniesieniu do zrozumienia podstaw biologii hepatocytów w modelowaniu komórkowym i zastosowaniach medycyny regeneracyjnej.

Opisana tutaj technologia stanowi przykład tego, jak powierzchnia syntetycznego polimeru może być zoptymalizowana w celu zachowania fenotypu komórki. Wierzymy, że połączenie tej technologii z wydajnym protokołem różnicowania hepatocytów wolnych w surowicy może zapewnić skalowalną produkcję hepatocytów do wykorzystania w modelowaniu in vitro i medycynie regeneracyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza PHNGAD (poli[1,6-heksanodiol/neopentyloglikol/di(etylenoglikol)-alt-kwas adipinowy]diol)

Schemat syntezy poliestru; zawiera struktury chemiczne, warunki reakcji oraz zastosowanie katalizatora.

Schemat 1: Synteza PHNAGD. Schematyczne przedstawienie syntezy PHNAGD. PHNAGD otrzymano w wyniku reakcji 1,6-heksanodiolu, glikolu dietylenowego, glikolu neopentylowego i kwasu adypinowego. PHNAGD, Poly[1,6-hexanodiol/neopentyl glycol/di(ethylene glycol)-alt-adipic acid]diol.

  1. Monomery 1,6-heksandiol, glikol di(etylenowy) oraz neopentyloglikol poddać obróbce termicznej w temperaturze 40 °C przez 48 hr w piecu próżniowym w celu usunięcia pozostałości wody. Pozostawić do ochłodzenia do RT w warunkach próżni.
  2. Do dwuszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne i połączonej z aparatem Dean-Starka dodać po 22 mmol każdego monomeru oraz kwas adypinowy (55 mmol).
  3. Cały układ umieścić w próżni i delikatnie ogrzewać szklane elementy w temperaturze 40 °C przez 6 hr, aby uniknąć pochłaniania wilgoci podczas dodawania substancji chemicznych do kolby.
  4. Za pomocą strzykawki dodać kroplami 0,0055 mol katalizatora, którym jest butylek tytanu(IV).
  5. Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze 180 °C w atmosferze N2 przez 24 hr, zbierając pozostałą wodę w pułapce Dean-Starka. Pozostawić produkt do ochłodzenia do RT.

2. Synteza PU134

Schemat syntezy poliuretanu; proces reakcji chemicznej z detalami dotyczącymi katalizatora i przedłużacza łańcucha.

Schemat 2: Synteza PU134. Schematyczne przedstawienie syntezy poliuretanu 134. PU134 przygotowano poprzez reakcję 1,0 ekwiwalentu PHNGAD z 2,0 ekwiwalentami 4,4′-metylenobis(izocyjanianu fenylu), a następnie dodanie 1,0 ekwiwalentu 1,4-butanodiolu jako przedłużacza łańcucha.

  1. Zmieszać jeden ekwiwalent poliolu PHNGAD (Mn ~1,800 Da, 3,2 mmol) z dwoma ekwiwalentami 4’4-metylenobis(fenyloizocyjanianku) (6,4 mmol) w bezwodnym N,N-dimetyloformamidzie (12 ml).
  2. Mieszaninę reakcyjną mieszać w temperaturze 70 °C w atmosferze N2.
  3. Za pomocą strzykawki dodać kroplami katalizator: butylek tytanu(IV) (0,8% masowo).
  4. Po 1 h dodać jeden ekwiwalent przedłużacza łańcucha 1,4-butanodiolu (3,2 mmol). Zwiększyć temperaturę do 90 °C i mieszać przez 24 h w atmosferze N2.
  5. Po zakończeniu reakcji odzyskać poliuretan poprzez precypitację, dodając kroplami eter dietylowy (można również zastosować heksan lub wodę) do roztworu reakcyjnego aż do wystąpienia wytrącenia.
  6. Odwirować roztwór przy 5,300 x g przez 5 min.
  7. Odlać nadfiltr i suszyć w 40 °C w suszarce próżniowej do odparowania rozpuszczalnika.
    Uwaga: Aby upewnić się, że końcowy produkt reakcji posiada prawidłowe parametry w zakresie rozkładu masy cząsteczkowej, grup funkcyjnych polimeru oraz temperatur topnienia i przejścia szklistego, można zastosować różne techniki i metody analityczne, takie jak chromatografia żelowa lub spektroskopia FTIR.

3. Przygotowanie roztworów PU134

  1. Odważ 200 mg PU134 do szklanej butelki.
  2. Rozcieńcz PU134 do stężenia końcowego 2% w kilku rozpuszczalnikach: chloroformie, mieszaninie chloroformu i toluenu w stosunku 1:1, tetrahydrofuranie oraz mieszaninie tetrahydrofuranu i dichlorometanu w stosunku 1:1.
    Uwaga: Wybór odpowiedniego rozpuszczalnika zależy od użytego polimeru. Różne rozpuszczalniki mają różne temperatury wrzenia, co może wpływać na solubilizację polimeru.
  3. Wstrząśnij roztworem intensywnie przez 20 min w RT za pomocą wytrząsarki z prędkością 200 mot/min, aż roztwór stanie się jednorodny i nie będzie widoczny osad.

4. Powlekanie szkiełek przedmiotowych PU134

  1. Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o powierzchni 15 mm2 na wirówce do nanoszenia warstw (spin coater).
  2. Nanieś za pomocą pipety 50 μl roztworu PU134 na każde szkiełko. Dostosuj objętość roztworu PU134 do wymaganego rozmiaru szkiełka nakrywkowego, zachowując proporcjonalny stosunek objętości do powierzchni.
  3. Wirować każde szkiełko przez 7 sec przy 23 x g.
  4. Suszyć szkiełka na powietrzu w RT przez co najmniej 24 hr przed sterylizacją.

5. Naświetlanie szkiełka nakrywki

  1. Poddać szkiełko nakrywkowe powlekane polimerem napromieniowaniu gamma, stosując dawkę 10 Grays za pomocą irradiatora laboratoryjnego przez 12 min.
  2. Poddać szkiełko nakrywkowe powlekane polimerem napromieniowaniu UV, używając żarówki UV o mocy 30 W przez 16 min z każdej strony.
  3. Umieścić szkiełko nakrywkowe powlekane polimerem w odpowiedniej płytce do hodowli tkanek, dopasowanej do rozmiaru szkiełka.

6. Skaningowa mikroskopia elektronowa

  1. Pokryć polimerowe szkiełko dekrywacyjne warstwą złota metodą rozpylania przez 200 s w atmosferze o ciśnieniu 5 x 10-1 millibars.
  2. Wykonać mikrofotografie pokrytego polimerem szkiełka dekrywacyjnego przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego przy napięciu przyspieszającym 20 kV w trybie obrazowania elektronów wtórnych.

7. Obserwacje z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

  1. Zeskanuj obszar 20 x 20 μm powierzchni polimeru.
  2. Ustaw częstotliwość skanowania w zakresie od 1.32 Hz do 1.60 Hz.
  3. Ustaw rozdzielczość 512 x 512 pikseli w skanowanym obszarze.
  4. Oblicz średnią kwadratową (RMS lub Rq) powłoki, korzystając ze średniej odchyleń wysokości od średniej płaszczyzny danych obrazu, wyrażoną jako:
    Szorstkość powierzchni, wzór na Rq, przedstawiający obliczanie średniej kwadratowej wysokości.
    Gdzie Zi jest aktualną wartością Z, a N to liczba punktów w danym obszarze.
  5. 7.5 Oblicz odchylenie lub średnią szorstkość powierzchni (Ra) obrazu, korzystając z wzoru:
    Wzór na arytmetyczną średnią szorstkość, Ra=∫|Z(x)|dx, formuła stosowana w analizie powierzchni.
    Gdzie Z (x) jest funkcją opisującą analizowany profil powierzchni pod kątem wysokości (Z) i pozycji (x) próbki wzdłuż długości pomiarowej „L”. Ra reprezentuje średnią wartość powierzchni względem płaszczyzny środkowej.

8. Hodowla i różnicowanie komórek

  1. Hodować i różnicować linię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) H9 zgodnie z opisem w publikacji Hay 17.
  2. Odłączyć komórki przy użyciu odczynnika dysocjującego i ponownym wysiać je na szkiełka pokryte PU134 w 9. dniu procesu różnicowania, w obecności medium bezsurowiczego, zgodnie z opisem w publikacji Szkolnicka 18,19.
    Uwaga: Preferowane jest zastosowanie enzymatycznej dysocjacji komórek zamiast fizycznego odłączania.

9. Analiza funkcjonalna cytochromu p450

  1. Zmierz aktywność CYP3A zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Inkubuj hepatocyty pochodzące z hESC w 13. lub 19. dniu, a także medium bez komórek – jako kontrolę negatywną – z odpowiednim substratem przez 5 hr w temperaturze 37 °C.
  3. Zbierz nadsączki z komórek i medium, a następnie przeprowadź analizę zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Zmierz poziom aktywności CYP i znormalizuj go względem powierzchni (cm2).

10. Immunobarwienie

  1. Przemyć hepatocyty pochodzące z hESC buforem PBS przez 1 min; powtórzyć dwukrotnie.
  2. Dodać lodowaty 100% metanol w celu utrwalenia komórek, a następnie pozostawić w temperaturze -20 °C przez 10 min.
  3. Przemyć komórki buforem PBS przez 5 min; powtórzyć dwukrotnie.
  4. Inkubować komórki w roztworze PBS/T (0,1% tween)/10% BSA przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  5. Odssać roztwór PBST i dodać odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA; inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w warunkach łagodnego mieszania.
  6. Przemyć komórki roztworem PBS/T (0,1% tween)/1% BSA przez 5 min; powtórzyć trzykrotnie.
  7. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciało w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA, dodać do komórek i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 h w warunkach łagodnego mieszania.
  8. Przemyć komórki buforem PBS przez 5 min; powtórzyć trzykrotnie.
  9. Do każdej studzienki dodać MOWIOL 488 (zawierający DAPI w stosunku 1:1 000), a następnie ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywki, aby zminimalizować liczbę pęcherzyków powietrza. Utrwalone komórki przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Obserwować barwienie za pomocą mikroskopu z odpowiednim filtrem i lampą fluorescencyjną. Zoptymalizowane przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe wymieniono w Tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozpuszczalnik polimeru wpływa na topografię powierzchni powleczonej polimerem

Poliuretan 134 rozpuszczono w chloroformie, samodzielnie lub w połączeniu z toluenem, tetrahydrofuranem lub dichlorometanem, a następnie na szkiełkach przedmiotowych naniesiono różne formulacje metodą spin-coatingu. Do charakterystyki właściwości fizycznych powłok polimerowych wykorzystano skaningową mikroskopię elektronową (SEM) oraz mikroskopię sił atomowych (AFM) (Rycina 1). Powł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiele z obecnych metod stosowanych do generowania hepatocytów z komórek macierzystych opiera się na niezdefiniowanych matrycach pochodzenia zwierzęcego. Substraty te mogą być kosztowne i bardzo zmienne, wpływając na funkcję i stabilność komórek, stanowiąc istotną barierę w stosowaniu. W związku z tym przeprowadziliśmy badania przesiewowe dla materiałów syntetycznych, które wspomagają hodowlę hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych. Zidentyfikowaliśmy prosty poliuretan (PU134), utworzony przez polimeryzację PHNGA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

D.C.H. jest CSO, dyrektorem, założycielem i udziałowcem FibromEd Products Ltd. M.B. i J.P.I. są udziałowcami-założycielami FibromEd Products Ltd.

Podziękowania

D.C.H., M.B. i F.K. były wspierane przez EPSRC Follow on Fund. B.L-V i D.S. byli wspierani przez stypendia doktoranckie MRC. Projekt K.C. otrzymał dofinansowanie z UK Instrumentative Medicine Platform.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Synteza, przygotowanie, powlekanie i charakterystyka szkiełek nakrywkowych pokrytych polimerem PU134
ShakerEdmun Bü HLERKS-15
NaświetlaczCIS BiointernationalIBL 637 
Specjalistyczny system powlekaniawirowegoP-6708
Skaningowy mikroskop elektronowy Mikroskop sił atomowych PhilipsXL30CPSEM
DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4PromegaV8902
Żarówka UVESCO
NanoScopeVEECOwersja 1.20
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusTH45200Użyj oprogramowania Volocity 4
Płytki do hodowli tkankowychCorning, Wielka Brytania 3527
szkiełkaMateriały laboratoryjne MIC3308
Glikol dietylenowySigma– Aldrich93171
1,6-heksanodiolSigma– Aldrich240117
Glikol neopentylowySigma– Aldrich408255
Kwas adypinowySigma– Aldrich9582
bezwodny N,N-dimetyloformamidSigma– Aldrich227056
Eter dietylowySigma– Aldrich676845
butoksydan tytanu (IV) Sigma– Aldrich244112
1,4-butanodiol Sigma– Aldrich493732
Piec próżniowyThermoscientific
4,4'-Metylenobis(izocyjanian fenylu)Sigma– Aldrich101688
TetrahydrofuranSigma– Aldrich401757
Powlekarka do natryskiwaniaBal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer sola fizjologiczna (-MgCl2, -CaCl2)Gibco10010031Przechowywać w temperaturze pokojowej
PBST, PBS z 0,1% TWEEN 20   Zaopatrzenie laboratoriów naukowych Sp. z o.o. EC607 
Metanol  Scientific Laboratory Supplies LtdCHE5010
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, Wielka BrytaniaA7906
MOWIOL 488 DAPICalbiochem475904Składa się z Tris HCl i glicerolu zgodnie z instrukcjami
Hodowla komórkowa i test funkcjonalny
CYP3A activity pGLO kitPromegaV8902
HepatozymeGibco17705021
TryLE expressLife Technologies12604013
Oprogramowanie do analizy producenta

Bibliografia

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112(2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

fenotyp hepatocytówpowłoka poliuretanowananoszenie wirowaniemprocedura sterylizacjiskaningowa mikroskopia elektronowamikroskopia sił atomowychtesty metabolizmu lekówhepatocyty pochodzące z komórek macierzystychnaświetlanie gamma
Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.