Artykuł metodologiczny

Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

DOI:

10.3791/51726

⸱

12 czerwca 2014

 , 
1Ophthalmology Department, Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kijanki Xenopus laevis preferują pływanie po białej stronie czarno-białego zbiornika. W tym zachowaniu kieruje się ich wizją. Opierając się na tym zachowaniu, przedstawiamy prosty test do testowania funkcji wzrokowej kijanek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar funkcji wzrokowych u kijanek żaby, Xenopus laevis, pozwala na badania przesiewowe w kierunku ślepoty u żywych zwierząt. Odpowiedź optokinekińska to odruchowe zachowanie oparte na widzeniu, które zaobserwowano u wszystkich badanych kręgowców. Oczy kijanki są małe, więc reakcja odwrócenia ogona została użyta jako alternatywna miara, która wymaga przeszkolonego technika do zarejestrowania subtelnej reakcji. Opracowaliśmy alternatywny test zachowania oparty na fakcie, że kijanki wolą pływać po białej stronie zbiornika, gdy zostaną umieszczone w zbiorniku zarówno po czarnej, jak i białej stronie. Przedstawiony tutaj test jest niedrogą, prostą alternatywą, która tworzy odpowiedź, którą można łatwo zmierzyć. Zestaw składa się ze statywu, kamery internetowej i zagnieżdżonych zbiorników testowych, które są łatwo dostępne w większości laboratoriów Xenopus. Ten artykuł zawiera film pokazujący zachowanie kijanek przed i po przecięciu nerwu wzrokowego. W celu zbadania funkcji jednego oka dołączamy również reprezentatywne wyniki kijanki, w której każde oko poddawane było aksotomii siatkówki w kolejnych dniach. Przyszłe badania mogą opracować zautomatyzowaną wersję tego testu do testowania wzroku wielu kijanek jednocześnie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis zostały użyte jako organizm modelowy do badania tworzenia oczu. Oczy rozwijają się szybko, osiągając dojrzałość w mniej niż tydzień w celu przetestowania genów lub szlaków, które mają wpływ na rozwój i funkcjonowanie wzroku. Aby przetestować funkcje wzrokowe, wykorzystano odpowiedź optokinetyczną i optomotoryczną odpowiednio u kijanek danio pręgowanego i Xenopus 1,2 . Ponieważ oczy kijanek Xenopus są stosunkowo mniejsze niż danio pręgowanego, test ten wymaga użycia specjalistycznego sprzętu i przeszkolonego personelu do wykrycia subtelnego machania ogonem i ruchu gałek ocznych u Xenopus. Bardziej solidnym zachowaniem w Xenopus jest preferencja do pływania w zbiorniku z białym tłem, co jest opisane w niniejszym3. Po umieszczeniu kijanki w półczarnym/półbiałym zbiorniku, wstępnie metamorficzna kijanka szybko przepływa na białą stronę zbiornika. Wcześniej używaliśmy tego testu do określenia, czy oczy pochodzące z komórek pluripotencjalnych są funkcjonalne4. Tutaj przedstawiamy szczegółową wersję tego testu, którą można wykorzystać do przetestowania funkcji wzrokowej premetamorficznych kijanek Xenopus.

Ten test jest prostszy niż test odpowiedzi optomotorycznej, ponieważ wymaga jedynie zamontowanej kamery cyfrowej, oprogramowania kamery cyfrowej i standardowego sprzętu, który można znaleźć w większości laboratoriów Xenopus. Ponadto nagrana odpowiedź nie wymaga specjalnego szkolenia w celu zliczania wyników. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że ta sama grupa kijanek, po przejściu podwójnej aksotomii siatkówki, pływa losowo wokół zbiornika. Dołączyliśmy również wyniki testu behawioralnego z reprezentatywnej kijanki, pokazujące, w jaki sposób można przetestować jedno oko pod kątem reakcji wzrokowej. Dołączono arkusz roboczy, aby można było wprowadzać i analizować liczby uzyskane podczas testu. Ten arkusz roboczy może być użyty do określenia, czy testowane kijanki mają reakcję wzrokową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami

Kijanki Xenopus laevis użyte w tym badaniu były hodowane, hodowane i leczone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez IACUC Uniwersytetu Medycznego Upstate oraz Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.

1. Ustawienie przed zachowaniem: Kijanki

  1. Pozyskać zapłodnione zarodki Xenopus z dostępnego na rynku źródła lub zapłodnić oocyty in vitro, jak opisano wcześniej6.
  2. Umieścić blastulę na zarodkach w stadium płytki nerwowej w temperaturze 18 °C na 60 mm szalkach Petriego zawierających 0,1X MMR [10 X Zmodyfikowany roztwór Ringera Marca (MMR) (10 mM MgCl2; 20 mM KCl; 20 mM CaCl2 ; 50 mM HEPES; 1 M NaCl; dostosowany do pH 7,5, autoklawowany i przechowywany w temperaturze pokojowej)] z 50 μg/ml antybiotyku gentamycyny. Zmieniaj 0,1 raza MMR każdego dnia i usuń martwe zarodki.
  3. Gdy zarodki osiągną stadium Nieuwkoop i Faber ~27 - 307, zamień zarodki na 0,1X MMR bez antybiotyku, aby umożliwić wzrost bakterii jelitowych.
  4. Hoduj kijanki, aż osiągną etap karmienia (etap 45) i przenieś je na 100-milimetrowe szalki Petriego wypełnione 0,1X MMR. Podawaj im supernatant z pokrzywy w proszku co drugi dzień przez tydzień, zmieniając 0,1 razy MMR w międzydniu.
  5. Po tygodniu na szalce Petriego o średnicy 100 mm przenieś zwierzęta do półgalonowych zbiorników wypełnionych wodą z żab [0,5 g/l natychmiastowego oceanu i 2 mM dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4: mw 141,96) pH 6,8]. Karm je jak w kroku 2.4, ale zmieniaj wodę tylko 2-3 razy w tygodniu, gdy woda jest mętna. Utrzymuj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światła/12 ciemnych świateł, gdy światła włączają się o 6 rano.
  6. Umieść półgalonowy zbiornik z osobami badanymi na białej powierzchni, takiej jak podkładka stołu laboratoryjnego, co najmniej 12 godzin O/N, przed badaniem.
  7. Przetestuj kijanki na etapach od 45 do 50, jak opisano w kroku 3 poniżej.

2. Wstępna konfiguracja zachowania: Sprzęt

  1. Odłóż na bok obszar laboratorium na test zachowania. Powinien znajdować się w cichym miejscu o małym natężeniu ruchu ze standardowym oświetleniem fluorescencyjnym.
  2. Przygotuj zbiorniki do testów dla zwierząt.
    Zagnieżdżone, półgalonowe zbiorniki testowe składają się z dwóch części: zbiornika wewnętrznego, który pomieści wodę i kijanki; i zewnętrzny zbiornik z bodźcem wizualnym.
    1. W przypadku zbiornika wewnętrznego zrób mały znak na zewnętrznych rogach za pomocą sharpie, 5 cm od dna; to jest linia wodna (Rysunek 1A, zielona przerywana linia).
    2. Również w przypadku zbiornika wewnętrznego napełnij wgłębienia w zbiorniku (w rogach i środku) obojętnym związkiem, takim jak elastomer Sylgard. UWAGA: Kijanki pozostaną w tych obszarach, jeśli nie zostaną wypełnione.
    3. W przypadku zbiornika zewnętrznego przykryj dokładnie jedną połowę zewnętrznej części jednego zbiornika czarną taśmą izolacyjną, a drugą połowę białą bibułą Rysunek 1B.
  3. Umieść zbiorniki na talerzu obrotowym do zaszczepiania.
  4. Ustaw kamerę internetową/statyw tak, aby znajdowała się nad zbiornikami testowymi. Dostosuj kamerę, aby umożliwić wizualizację obszaru testowego, jak pokazano na rysunku 1C.
  5. Podłącz kamerę internetową do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem QuickTime Player5. Włącz kamerę. W programie QuickTime Player, w obszarze Plik, wybierz opcję "Nowe nagranie filmu". Konfiguracja testu zachowania będzie od razu widoczna na komputerze.
  6. Ułóż lekką bawełnianą szmatkę na całym zestawie, aby zredukować zewnętrzne sygnały, które mogą wpływać na zachowanie kijanki, a także zmniejszyć odbite światło na powierzchni wody.
  7. Upewnij się, że luminancja pod tkaniną wynosi 35-50 cd/m2.

3. Test zachowania

  1. Napełnij wewnętrzny zbiornik testowy do 5 cm znaku wodnego wykonanego w kroku 1.2.1 wodą z żab.
  2. Za pomocą małej siatki delikatnie przenieś zwierzę do wewnętrznego zbiornika testowego.
  3. Otwórz oprogramowanie QuickTime na komputerze i korzystając z zewnętrznego zbiornika jako przewodnika, upewnij się, że kamera jest w stanie wizualizować i rejestrować obszar testowy.
  4. Napisz imię zwierzęcia, datę i godzinę na kartce papieru i nagraj za pomocą aparatu.
  5. Umieść zbiornik testowy w zbiorniku zewnętrznym czarną stroną zbiornika po prawej stronie rysunku 2.
  6. Rozpocznij nagrywanie filmu natychmiast po ustawieniu zbiornika i ustawieniu timera na 2 min.
  7. Gdy zegar wyda sygnał dźwiękowy, wyjmij wewnętrzny zbiornik testowy, obróć zewnętrzny zbiornik o 180° i umieść wewnętrzny zbiornik testowy w zbiorniku zewnętrznym. Uruchom minutnik. Uwaga: strona powinna teraz znajdować się po drugiej stronie.
  8. Powtórz krok 3.7, jeszcze osiem razy, co daje w sumie dziesięć prób. Użyj rysunku 2 jako przewodnika, odhaczając każdą próbę.
  9. Powtórz test zachowania w dwóch oddzielnych dniach.

4. Aksotomia siatkówki

  1. Umieść zwierzę w 0,02% tricaine, aż przestanie reagować na uszczypnięcie ogona kleszczami #3.
  2. Rozpuść 1% agarozy w 0,1X MMR, a następnie dodaj do szalki Petriego o średnicy 60 mm. Po schłodzeniu zrób małe prostokątne wgłębienie w agarozie i dodaj kijankę do divot z odrobiną 0,02% tricainy, aby zwierzę było częściowo zanurzone w płynie.
  3. Przebij skórę pod kątem 45 stopni za grzbietową częścią oka igłą 25 G, jednocześnie opierając zwierzę o kleszcze po przeciwnej stronie.
  4. Uważając, aby nie przeciąć żyły, która leży obok nerwu wzrokowego, ostrożnie sięgnij do otworu kleszczami #5, odetnij nerw wzrokowy i odwróć go na bok. Jeśli wystąpi silne krwawienie z powodu przypadkowego przecięcia tętnicy, szybko umieść zwierzę w 2% tricaine w celu eutanazji. UWAGA: 2% roztwór tricainy może powodować drętwienie u ludzi. Z tym roztworem należy obchodzić się w rękawiczkach.
  5. Aby wyzdrowieć zwierzę po operacji, umieść zwierzę na 100-milimetrowej szalce Petriego z 0,7X MMR i 50 μg/ml gentamycyny na 20 minut. Następnie przenieś kijankę do zbiornika regeneracyjnego z wodą z żabą. Niech zwierzę odpoczywa O/N.
  6. Następnego ranka przetestuj funkcję wzrokową zgodnie z powyższym opisem (kroki 3.1-3.9).

5. Analizuj wyniki

  1. Po zakończeniu prób zmierz czas, przez jaki kijanka pozostaje po czarnej stronie zbiornika.
    1. Ręcznie view filmy za pomocą oprogramowania, które wyświetla czas i umożliwia częste wstrzymywanie. Spójrz na czas wyświetlania wideo. Zapisz początek dwuminutowej próby, kiedy zbiornik wewnętrzny pomyślnie zagnieżdża się w zbiorniku zewnętrznym i jest ustawiony do kwadratu w polu widzenia kamery.
    2. Użyj pozycji oczu kijanki, aby określić, po której stronie zbiornika pływają zwierzęta. Określ przejście z jednej strony zbiornika na drugą tylko wtedy, gdy oba oczy przekroczą czarno-białą linię.
  2. Zapisz początek i koniec każdego interwału (w sekundach), który zwierzę spędza po czarnej stronie. Wstrzymaj i przewiń wideo do tyłu, aby zapewnić dokładność. Suma sekund w każdej próbie.
  3. Wprowadź te liczby do załączonego arkusza zachowania. Arkusz obliczy stosunek czasu, jaki zwierzę spędziło po białej stronie, odejmując czas spędzony po czarnej stronie zbiornika od całkowitej próby trwającej 120 sekund i dzieląc przez całkowity czas w sekundach [(120 – całkowita liczba sekund spędzonych po czarnej stronie)/120 sekund]. Arkusz uśrednia ten współczynnik dla wszystkich 10 prób.
  4. Użyj testu T-studenta, sparowanego, dwustronnego rozkładu, aby określić, czy próby między dniami są istotne (P ≤ 0,05).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniejsze doniesienia wykazały, że przedmetamorficzne kijanki Xenopus preferują pływanie po białej stronie czarno-białego zbiornika; test ten nazwano testem preferencji koloru tła (Background Color Preference Assay)3 Zmodyfikowaliśmy ten test, aby móc sprawdzić funkcję wzrokową każdego z oczu kijanek w czasie krótszym niż tydzień. W ten sposób ich oczy mogą zostać pobrane do badania histologicznego.

Pokazujemy tutaj, że reakcja ta wynika z bodźców wzrokowych. W F...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj prosty test behawioralny sterowany wzrokiem, który można łatwo wykonać w mniej niż tydzień przez minimalnie przeszkolony personel laboratoryjny. Podczas gdy inne testy wymagają specjalistycznego sprzętu i wiedzy specjalistycznej w zakresie zachowania zwierząt, ten test pozwala na szybki test w celu określenia funkcji wzrokowych. Inny test behawioralny, test unikania wizualnego, został opracowany w celu określenia, w jaki sposób tectum przyczynia się do percepcji wzrokowej w Xenopus10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów z National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ) i EY019517 (ASV). Praca ta była również wspierana przez grant Research to Prevent Blindness Unrestricted dla Oddziału Okulistyki i Lions of Central New York. Chcielibyśmy również podziękować naszemu zootechnikowi, Matthew Mellini, za jego doskonałą opiekę nad zwierzętami i za udział w tym filmie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elastyczny zbiornik o pojemności 1/2 galona z pokrywąeNascoSB19271MRozmiar: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
taśma
Biała bibułka
Duży gramofon do inokulacjiVWR50809-022Rozmiar: Dia 114,3 x  H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Podkładka DurasorbVWR82004-836Rozmiar: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")
KimwipeKrackeler Scientific, Inc.1945-34155-CS
StatywRóżne Kamera
iSight lub kamera internetowaAppleM8817LL/ADobre dla większych kijanek, ale małe są trudne do zobaczenia
Komputer przenośnyApple/PCRóżneUżyliśmy 13-calowego MacBooka, Intel Core 2 Duo 2 GHz z systemem MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV kamera handycamSONYDCR-HC42Podłączony za pomocą firewire do komputera za pomocą 6-przewodowego i 4-przewodowego przewodu alfa FireWire 400 
Stacja HandycamSONYDCRA-C121Może być używana do podłączania przewodu ogniowego do
kamery Oprogramowanie QuickTime PlayerQuicktime Wersja 10.1
Igła 26 G (długość 5/8")VWRBD305115
Dumont #5Narzędzia do nauki precyzyjnej11295-10
Jednorazówki
Siarczan gentamycyny [50 mg/ml]Fisher Scientific17-528ZPrzechowywany w RT
Sylgard 184 elastomer silikonowyFisher ScientificNC9644388
Instant oceanLekarze Foster i SmithCD-116528Roztwór podstawowy = 100 g/L przechowywany w RT
Fosforan sodu dwuzasadowySigma AldrichS0876Roztwór podstawowy = 0,4 M przechowywany w RT
Zarodki zapłodnione in vitroeNascoLM00490MX100 zarodków/jednostkę
elektryczna standardowy Kleszcze

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
  2. Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
  3. Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
  5. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
  6. Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
  7. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  8. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
  9. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
  10. Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  11. Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
  12. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kijanki Xenopustest funkcji wzrokowychodpowied optokinetycznatest odruchu wygi cia ogonazachowanie fototaktyczneaksonotomia siatk wkizbiornik p czarno bia ypreferencje p ywawcze kijanekXenopus Laboratories

Powiązane artykuły