Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

Summary

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Abstract

Dojrzałe komórki mogą zostać przeprogramowane do stanu pluripotencjalnego. Te tak zwane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są w stanie dać początek wszystkim typom komórek organizmu, a co za tym idzie, mają ogromny potencjał w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej. Tradycyjnie komórki iPS są generowane przez wirusowe wprowadzenie czynników transkrypcyjnych Oct-4, Klf-4, Sox-2 i c-Myc (OKSM) do fibroblastów. Jednak przeprogramowanie jest nieefektywnym procesem, w którym tylko 0,1-1% komórek powraca do stanu pluripotencjalnego, co utrudnia badanie mechanizmu przeprogramowywania. Sprawdzoną metodologią, która pozwoliła na zbadanie procesu przeprogramowywania, jest oddzielenie rzadkich produktów pośrednich reakcji od ogniotrwałej populacji masowej. W przypadku mysich fibroblastów embrionalnych (MEF), my i inni wykazaliśmy wcześniej, że przeprogramowanie komórek przechodzi wyraźną serię zmian w profilu ekspresji markerów powierzchni komórek, które można wykorzystać do separacji tych komórek. We wczesnych stadiach ekspresji OKSM komórki z powodzeniem przeprogramowują utratę markera tożsamości fibroblastów Thy-1.2 i regulowanego w górę markera pluripotencji związanego z pluripotencją Ssea-1. Końcowe przejście podzbioru komórek Ssea-1 dodatnich w kierunku stanu pluripotencjalnego jest zaznaczone przez ekspresję Epcam w późnych stadiach przeprogramowania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis metodologii zastosowanej do izolacji produktów pośrednich przeprogramowania od kultur przeprogramowywania MEF. W celu zwiększenia odtwarzalności eksperymentalnej używamy reprogramowalnego szczepu myszy, który został zaprojektowany do ekspresji transaktywatora transkrypcji (m2rtTA) pod kontrolą locus Rosa26 i OKSM pod kontrolą promotora reagującego na doksycyklinę. Komórki wyizolowane od tych myszy są izogeniczne i wyrażają OKSM jednorodnie po dodaniu doksycykliny. Szczegółowo opisujemy tworzenie reprogramowalnych myszy, wyprowadzanie MEF-ów, a następnie izolację produktów pośrednich podczas przeprogramowania do komórek iPS poprzez fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowanych (FACS).

Introduction

Embrionalne komórki macierzyste (ES) pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej zarodków w stadium blastocysty¹. W odpowiednich warunkach hodowlanych samoodnawiają się i pozostają pluripotencjalne. W 2006 roku Yamanaka i współpracownicy wykazali, że dojrzałe komórki mogą być przeprogramowane w tzw. indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) ². Komórki iPS, podobnie jak komórki ES, mogą dać początek wszystkim typom komórek organizmu, jednak są wolne od ograniczeń etycznych związanych z wytwarzaniem komórek ES³. Co więcej, komórki iPS niosą ze sobą obietnicę spersonalizowanej medycyny regeneracyjnej i mają ogromny potencjał w zastosowaniach, takich jak modelowanie chorób i badania przesiewowe leków in vitro ^4,5. Aby technologia przeprogramowania mogła wykorzystać ten potencjał, podstawowy mechanizm przeprogramowania jądrowego musi być w pełni zrozumiany. Jednak wysiłki zmierzające do zbadania szlaku przeprogramowania są utrudnione przez fakt, że tylko bardzo mała liczba komórek ulega przeprogramowaniu (0,1-1%). Doniesiono, że udane przeprogramowanie fibroblastów przechodzi odrębną serię zdarzeń, w tym przejście mezenchymalne do nabłonkowego ^6-10 i, w końcowych etapach przeprogramowania, aktywację endogennej sieci pluripotencji rdzeniowej ^11-14. My i inni ^12,13,15-17 zidentyfikowaliśmy ostatnio zestaw markerów powierzchni komórek, który pozwala na oddzielenie rzadkich produktów pośrednich od opornej na leczenie populacji masowej. Przeprogramowywanie mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) ulega zmianom w ekspresji Thy-1.2, Ssea1 i Epcam (między innymi) podczas trwającego 2 tygodnie procesu przeprogramowania¹⁵. Na wczesnym etapie przeprogramowania podzbiór MEF obniża ekspresję markera tożsamości fibroblastów (Thy-1.2), a następnie zaczyna wyrażać marker związany z pluripotencją Ssea-1¹². Podczas końcowych etapów przeprogramowania komórek Ssea1-dodatnich reaktywuje endogenne geny pluripotencji, takie jak Oct-4^10-13,15. To ostatnie przejście jest zaznaczone na powierzchni komórki przez wykrywalną ekspresję Epcam (patrz Ryc. 1) lub w późniejszym etapie Pecam ¹⁵. Ostatnio O'Malley i in. poinformowali o zastosowaniu CD44 i iCAM1 jako alternatyw lub uzupełnień Thy-1.2 i Ssea-1 do identyfikacji produktów pośrednich przeprogramowywania. Wcześniej FACS wyekstrahował półprodukty przeprogramowania z kultur przeprogramowujących Dzień 0, Dzień 3, Dzień 6, Dzień 9 i Dzień 12, a także z ustalonych linii komórkowych iPS opartych na tych markerach powierzchni komórek ^15,18. Dla opisanego poniżej systemu i warunków przeprogramowania wykazaliśmy na poziomie pojedynczej komórki, że chociaż populacje są cicho jednorodne, istnieje pewien stopień heterogeniczności w zidentyfikowanych populacjach pośrednich. Należy zauważyć, że tylko podzbiór komórek w tych populacjach jest w stanie przejść do odpowiedniego następnego etapu procesu przeprogramowania i dać początek koloniom komórek iPS o różnej wydajności, które zostały wcześniej szeroko scharakteryzowane^15,19. Co więcej, skuteczność przeprogramowania tych populacji będzie również zależała od warunków ponownego posiewu i hodowli. Aby zwiększyć odtwarzalność eksperymentalną, używamy reprogramowalnego szczepu myszy, który został zaprojektowany do ekspresji transaktywatora transkrypcji (m2rtTA) pod kontrolą locus Rosa26 i policistronicznej kasety OKSM pod kontrolą promotora reagującego na doksycyklinę^20,21. Wykorzystanie tego modelu mysiego pozwala uniknąć niepożądanych skutków ubocznych tradycyjnych metod generowania komórek iPS przez wirusy, tj. niejednorodnej populacji wyjściowej ze zmiennością między komórkami pod względem liczby i lokalizacji miejsc integracji wstawek wirusa. Dwa transgeniczne szczepy myszy (OKSM, m2rtTA), dostępne jako homozygotyczne zwierzęta założycielskie w Jackson Laboratory, muszą zostać skrzyżowane w celu ustalenia reprogramowalnego modelu myszy (patrz Rysunek 2). W tym manuskrypcie szczegółowo opisujemy, jak wyprowadzać MEF, generować komórki iPS i izolować produkty pośrednie przeprogramowania na różnych etapach procesu konwersji przez FACS.

Protocol

1. Ustawienia instrumentu/Przygotowanie odczynników/Genotypowanie

1. Przygotuj pożywkę komórkową iPS: Uzupełnij 500 ml pożywki Knockout DMEM z 75 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml L-glutaminy, 5 ml aminokwasów endogennych, 500 μl β-merkaptoetanolu, 5 x 10⁵ jednostek czynnika hamującego białaczkę (LIF). Prosimy o zapoznanie się z Listą materiałów w celu uzyskania informacji o produkcie i zakupie odczynników używanych w kontekście tego manuskryptu.
2. Przygotuj pożywkę MEF: Uzupełnij 500 ml pożywki DMEM o 50 ml FBS, 5 ml L-glutaminy, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml pirogronianu sodu, 500 μl β-merkaptoetanolu.
3. Przygotuj pożywkę do zamrażania: Na 10 ml połącz 9 ml FBS z 1 ml DMSO.
4. Przygotuj potrawy pokryte żelatyną Dodać 3-5 ml 0,1% roztworu żelatyny wieprzowej do kolby T75, inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut i odsysać bezpośrednio przed użyciem.
5. Przygotuj podłoże do etykietowania FACS: Na 10 ml połącz 9,9 ml PBS z 0,1 ml FBS.
6. Wykonaj genotypowanie PCR dla locus Rosa26 m2rtTA: Przeprowadź reakcje z polimerazą DNA Taq zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj zmodyfikowanego stężenia MgCl₂ 3,5 mM i następujących 3 starterów: oIMR8052: 5' GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG ATG 3'. Warunki jazdy na rowerze: 94 °C przez 3 min; 35 cykli (94 °C przez 30 sekund, 65 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min); 72 °C przez 2 min; przechowywać w temperaturze 12 °C. Oczekiwana wielkość produktu: 650 pz dla allelu typu dzikiego i 340 pz dla allelu zmutowanego.
7. Wykonaj genotypowanie PCR dla locus Collagen-StemCa/OKSM: Przeprowadź reakcje z polimerazą DNA Taq zgodnie z instrukcjami. Użyć zmodyfikowanego stężenia MgCl₂ wynoszącego 2,5 mM i następujących 3 starterów: col/frt-B: 5' CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col/frtA1: 5' GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col/frtC1: 5' GCAGAAGCGGGCCGTCTGG 3'. Warunki cyklu: 95 °C przez 1 min: 2 cykle (94 °C przez 30 sekund, 70 °C przez 45 sekund), 6 cykli (94 °C przez 30 sekund, 68 °C przez 45 sekund) i 30 cykli (94 °C przez 20 sekund, 60 °C przez 1 min); 72 °C przez 5 min; przechowywać w temperaturze 12 °C. Oczekiwany rozmiar produktu: 331 pz dla allelu dzikiego i 551 pz dla allelu zmutowanego.
8. Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.

2. Generacja fibroblastów embrionalnych myszy

1. Przeprowadzić krycie na czas między zwierzęciem szczepu OKSM a osobnikiem płci przeciwnej szczepu m2rtTA. Zbierz zarodki w 13,5 dniu embrionalnym, dokonując uboju matki i usuwając róg macicy. Przed usunięciem rogu macicy spryskaj okolicę brzucha 80% roztworem etanolu, aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
2. Przenieś róg macicy do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Użyj wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć róg macicy na kawałki zawierające jeden zarodek (patrz ryc. 3A,B).
3. Użyj mikroskopu preparacyjnego (najlepiej umieszczonego w kapturze do hodowli tkanek) i wysterylizowanych kleszczy, aby ostrożnie usunąć otoczkę macicy i błony pozazarodkowe otaczające każdy zarodek. Przenieść każdy zarodek do oddzielnego naczynia o średnicy 10 cm z 10 ml PBS.
4. Kontynuuj od usunięcia głowy, kończyn, ogona i narządów wewnętrznych zarodka (serca, wątroby, jelita itp.) za pomocą kleszczy (patrz ryc. 3C). Przenieś głowę zarodka do probówki o pojemności 1,5 ml i zamroź, aby w razie potrzeby można ją było wykorzystać do genotypowania.
5. Przenieś tułów zarodka na pustą płytkę o średnicy 10 cm i za pomocą dwóch ostrzy chirurgicznych mielej zarodek przez 2 minuty. Dodać 200 μl roztworu trypsyny/EDTA na wierzch rozdrobnionego zarodka i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuuj mielenie przez dodatkowe 2 minuty, dodaj 2 ml pożywki MEF, aby dezaktywować trypsynę, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
6. Użyj pipety o pojemności 1 000 μl, aby dodatkowo mechanicznie zdysocjować tkankę poprzez delikatne pipetowanie. Przenieść do 10 cm pokrytego żelatyną naczynia i dodać dodatkowe 10 ml pożywki MEF. Uwaga: Do hodowli można używać zarówno inkubatorów normoksycznych, jak i hipoksyjnych, więcej informacji można znaleźć w dyskusji.
7. Po 24-48 godzinach płyta powinna być gęsto pokryta MEF-ami.
8. Alternatywnie komórki można następnie dalej rozmnażać lub zamrażać. W celu zamrożenia komórek należy usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać naczynie 10 ml PBS w celu usunięcia śladów pożywki i nałożyć 3 ml roztworu trypsyny/EDTA. Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C, dezaktywować trawienie trypsyny przez dodanie 5 ml pożywki MEF i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować i ponownie zawiesić granulat w 3 ml pożywki do zamrażania. Przenieś do 3 kriowialiów i zamroź w pojemniku do zamrażania komórek.

3. Przeprogramowanie MEFów

UWAGA: Komórki osadkowe należy odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i użyć inkubatorów do hodowli tkanek w normoksykach do przeprogramowania. Korzystne może być wyprowadzanie i rozszerzanie MEF w warunkach niedotlenienia (5% tlenu, więcej informacji można znaleźć w dyskusji).

1. Szybko rozmrozić kriowialny kriowial o niskim pasażu (P0-P1, 2-3 komórki Mio) w łaźni wodnej (37 °C) i przenieść zawartość do probówki z 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki MEF. Komórki osadkowe ponownie zawiesić w 12 ml świeżej pożywki MEF, przenieść do pokrytego żelatyną naczynia hodowlanego T75 i pozostawić komórkom do regeneracji przez 24-48 godzin przed kontynuowaniem. Uwaga: MEF-y mogą być również używane bezpośrednio po wyprowadzeniu.
2. Po usunięciu pożywek hodowlanych przemyć MEF PBS i dokonać celularizacji poprzez nałożenie roztworem trypsyny/EDTA (3 ml przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C). Ugasić trypsynę, dodając 5 ml pożywki MEF i dalej dysocjować komórki, delikatnie mieszając pipetą o pojemności 10 ml. Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
3. W celu przeprogramowania eksperymentów, zasiewa MEF na kolbach T75 pokrytych żelatyną o gęstości 6,7 x 10³ komórek/^cm2 (~0,5 Mio komórek na kolbę) w pożywkach iPSC zawierających 2 μg/ml doksycykliny. Zapoznaj się z tabelą 1 dotyczącą zaleceń dotyczących wysiewu, aby uzyskać około 2 mln półproduktów przeprogramowania dla każdego punktu czasowego. Uwaga: Przeprogramowanie rozpoczyna się od dodania pożywki uzupełnionej doksycykliną (2 μg/ml)
4. Przez pierwsze 6 dni co drugi dzień wymieniać pożywkę na świeżą pożywkę iPSC uzupełnioną doksycykliną (12 ml pożywki na kolbę T75). Po przekroczeniu tego punktu należy codziennie odnawiać nośniki, jeśli liczba komórek jest wysoka. Podwój objętość hodowli, jeśli zmiany pożywki można wykonywać tylko co drugi dzień.
5. Przeprogramowanie półproduktów pośrednich zbiorów w wymaganych punktach czasowych (sugestia: dni 3, 6, 9, 12) poprzez usunięcie pożywki, przepłukanie odpowiednią objętością PBS (10 ml dla kolby T75) i nałożenie roztworem trypsyny-EDTA (3 ml dla kolby T75). Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C i schłodzić, dodając 5 ml pożywki iPSC, a następnie delikatnie pipetować.
6. Zawiesinę komórek należy policzyć za pomocą hemocytometru (patrz wyżej), zawiesić osad przez odwirowanie, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS w celu usunięcia wszelkich śladów trypsyny. Ponownie zebrać ogniwa, odessać supernatant i przejść do kroku 4.1, aby wyizolować produkty pośrednie przeprogramowania. Uwaga: Komórki poddawane przeprogramowaniu mogą być kriokonserwowane i rozmrażane w celu izolacji FACS na późniejszym etapie.
7. Aby stworzyć w pełni przeprogramowane kultury iPS, hoduj komórki w pożywkach iPSC wolnych od doks przez kolejne 4-7 dni. Uwaga: Pomyślne przeprogramowanie kultur będzie zawierało dużą liczbę kolonii do 12 dnia (patrz rysunek 4). W tym czasie znikną nieprawidłowe komórki iPS, które nadal wymagają ekspresji OKSM.
8. Alternatywnie, w celu rozmnażania pozostałych, w pełni przeprogramowanych kultur iPS: na początku należy wysiać napromieniowane MEF-y o gęstości 15 x 10³ komórki/^cm2 w 12 ml pożywki iPSC na kolbę T75 pokrytą żelatyną na jeden dzień lub 6 godzin przed eksperymentami.
9. Następnie należy utylizować hodowle komórek iPS poprzez usunięcie pożywki, przepłukanie kolby T75 10 ml PBS, nałożenie 3 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubację przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C. Trypsynę ugasić dodając 5 ml pożywki iPSC, a następnie delikatnie wymieszać, przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwirować, a następnie ponownie zawiesić w 10 ml pożywki iPS.
10. Przenieść 500 μl tej zawiesiny komórek na napromieniowane MEF-y (kolba T75) i pozostawić kulturom do wzrostu przez 4-5 dni. Uwaga: Ugruntowane kultury iPS mogą być kriokonserwowane lub wykorzystywane do eksperymentów. Klonalne linie komórkowe można uzyskać, wybierając pojedyncze kolonie iPSC pod mikroskopem preparacyjnym ²².
11. Kriogeniczne zachowanie zlewających się kultur iPSC, jak opisano w 2.8 dla MEF.

4. Znakowanie przeciwciał

1. Zawiesić osady komórkowe kultur przeprogramowujących, jak przygotowano w sekcji 3, w pożywkach znakujących FACS uzupełnionych przeciwciałami (anty-Thy-1,2 błękit pacyficzny 1:400, anty-Ssea-1 biotyna 1:400 i anty-Epcam Fitc 1:400). Użyć 200 μl uzupełnionej mieszanki do znakowania na 5 milionów komórek i inkubować na lodzie.
2. Po 10 minutach delikatnie postukaj w probówkę, aby ponownie zawiesić komórki i inkubować przez dodatkowe 10 minut na lodzie. Dodać 10 ml zimnego PBS na probówkę i odwirować.
3. Dla każdej probówki, która ma być barwiona, należy przygotować 200 μl podłoża do etykietowania uzupełnionego 1 μl Streptawidyny-PeCy7 (1:200) na 5 milionów komórek. Gdy komórki osiągną granulat, ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości pożywki znakującej uzupełnionej streptawidyną-PeCy7.
4. Trzymaj komórki na lodzie przez 10 minut, stuknij, aby ponownie zawiesić, inkubuj przez kolejne 10 minut na lodzie, dodaj 10 ml zimnego PBS na probówkę, odwiruj i odessaj supernatant.
5. Zawiesić osady komórkowe w pożywce do znakowania uzupełnionej jodkiem propidyny (PI) (2 μg/ml) w stężeniu około 1 x 10⁷ komórek/ml. Usunąć grudki komórek, przepuszczając zawiesinę przez sitko o wielkości 70 μm. Przenieś komórki do odpowiedniej probówki FACS i trzymaj je na lodzie.
6. Przygotować oddzielne próbki z pojedynczymi przeciwciałami (anty-Thy-1,2, anty-Ssea-1 i anty-Epcam). UWAGA: Są one wymagane do przeprowadzenia kompensacji kolorów w trzech kanałach używanych w analizie. Ponadto potrzebne są nieoznakowane ogniwa do ustawiania napięć i bramek do sortowania. Idealnie do kompensacji stosuje się komórki iPS: zapasy 0,5-1 x 10⁶ komórek iPS utrzymywanych na napromieniowanych MEF-ach są przechowywane w kriowiałach w ciekłym azocie. Obecność MEF-ów jest niezbędna do uzyskania sygnału w kanale Thy-1.2.
7. Rozmrozić kriowialny komórek iPS zgodnie z opisem dla MEF (sekcja 3). Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w 800 μl buforu znakującego i 200 μl tej próbki odłożyć na bok jako nieznakowaną kontrolę.
8. Użyj pozostałych komórek jako formantów kompensacji. Podziel komórki między trzy probówki o pojemności 15 ml i dodaj przeciwciała w następujący sposób: Kontrola kompensacji Pacific Blue: dodać 0,5 μl przeciwciała anty-Thy-1,2 Pacific Blue. Probówka kompensacyjna Fitc: dodać 0,5 μl przeciwciała anty-Epcam-Fitc. Kontrola kompensacji Pe-Cy7: 0,5 μl przeciwciała anty Ssea-1-Biotyna.
9. Próbki przeciwciał komórkowych należy przechowywać na lodzie przez 10 minut, mieszać przez stukanie i inkubować przez 10 minut na lodzie.
10. Przemyć próbki 10 ml zimnego PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała, odwirować komórki w dół i odessać supernatant. Zawiesić granulki komórkowe w 200 μl podłoża do etykietowania FACS.
11. W przypadku próbek znakowanych anty-Ssea-1-biotyną dodać koniugat Streptawidyna-PeCy7 (1 μl na 200 μl komórek). Oznacz komórki zgodnie z opisem dla przeciwciała pierwszorzędowego (Ssea-1-Biotyna).
12. Wszystkie próbki, w tym nieznakowaną kontrolę, przepuścić przez sitko o średnicy 70 μm i dodać PI (2 μg/ml). Przenieś komórki do probówek FACS i trzymaj na lodzie, aż będzie to potrzebne.

5. Izolacja FACS produktów pośrednich

UWAGA: Komórki są sortowane za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją z laserami wzbudzającymi 405 nm, 488 nm i 560 nm oraz dyszą 100 μm.

1. Ustaw napięcia dla rozproszenia do przodu i bocznego, aby populacja komórek była prawidłowo zobrazowana. Narysuj bramkę wokół komórek, jak pokazano na rysunku 5A, aby wykluczyć zanieczyszczenia. Uwaga: Prawidłowa konfiguracja napięć w sortowniku ogniw może być złożona i wymaga doświadczonego operatora FACS.
2. Użyj wysokości rozproszenia do przodu (FSC) w stosunku do obszaru FSC, aby wykluczyć agregacje (Rysunek 5B).
3. Wizualizuj kanał PI w porównaniu z FSC, aby zabramować ujemne komórki PI na żywo (rysunek 5C).
4. Użyj nieoznakowanych ogniw, aby wyregulować napięcia dla kanałów fluorescencyjnych PB, Fitc/GFP, Pe-Cy7. Idealnie umieść populację komórek na dolnym końcu odpowiedniego kanału.
5. Ustaw bramki z nieznakowanymi komórkami kontrolnymi, jak pokazano na rysunku 6A, B, aby podfrakcjonować kultury przeprogramowujące populacje dnia 3, 6 i 9: komórki Ssea-1- / Thy-1,2+; Komórki Ssea-1-/Thy-1,2-; a przeprogramowanie pośrednie Komórki Ssea-1 + / Thy-1.2-.
6. Dalej podzielić frakcję Ssea-1 + / Thy-1.2- dnia 9 za pomocą plamy Pe-Cy7 w porównaniu z Fitc; narysuj bramki wokół komórek Sse-a1 + / Epcam + i komórek Ssea-1 + / Epcam-. Ustaw bramki z nieoznaczonymi komórkami sterującymi, jak pokazano na rysunku 6C,D.
7. Przed sortowaniem pożądanych subpopulacji należy wstępnie napełnić odpowiednie probówki zbiorcze pożywką z komórek iPS (1-2 ml) (patrz rysunek 7 dla reprezentatywnych profili FACS dla MEF, hodowli dnia 3/dnia 6/dnia 9/dnia 12 i komórek iPS).
8. Wykonaj sortowanie FACS zgodnie z protokołem producenta.
9. Po izolacji FACS poddaj komórki profilowaniu molekularnemu (ekstrakcja RNA / białka, immunoprecypitacja chromatyny, analiza metylomu DNA itp.). Alternatywnie można hodować różne frakcje komórek.

Results

Po rozebraniu, dezagregacji i posiewie zarodka myszy E13.5, oczekuje się, że 10-centymetrowa półka osiągnie zbieżność w ciągu około 1 do 2 dni. Na tym etapie normalne jest, że kultura zawiera pewne przylegające fragmenty tkanki, które nie zostały prawidłowo komórkowe. Znikną one po przejściu.

Po indukcji doksycykliny, przeprogramowanie MEF ulega wyraźnym zmianom morfologicznym. Około 6 dnia powinny zacząć pojawiać się wczesne plamy przypominające kolonie (ryc. 4C). Będą one nadal rosły w miarę dalszej hodowli (patrz rysunek 4D,E). Dobry eksperyment z przeprogramowaniem powinien skutkować >500 koloniami na T75, który początkowo został obsiany 5 x 10⁵ komórkami (Rysunek 4E). Założone kultury iPS mają charakterystyczne kolonie w kształcie kopuły i w większości powinny być pozbawione zróżnicowanych komórek (ryc. 4F). Czasami może być konieczne dodatkowe pasażowanie kultur iPS w celu usunięcia niezróżnicowanych/częściowo przeprogramowanych komórek; zlewającą się kolbę komórek można rozłupać w stosunku 1:10 na warstwę zasilającą napromieniowanych MEF-ów.

Jak wspomniano powyżej, zmiany morfologiczne i molekularne podczas przeprogramowania są odzwierciedlane przez zmiany w profilach FACS dla Thy-1.2, Ssea-1 i ostatecznie Epcam (patrz Rysunek 7A-F). Jak informowano wcześniej^12,15, podczas gdy MEF są przeważnie dodatnie dla Thy-1,2 i ujemne dla innych markerów, kultury dnia 3 już wyglądają znacznie inaczej. Duża część komórek zaczęła obniżać ekspresję Thy-1.2, a bardzo mały podzbiór tych komórek Thy-1.2 ujemnych stał się dodatni dla Ssea-1, faktycznego produktu pośredniego przeprogramowania dla tego punktu czasowego. Liczba produktów pośrednich przeprogramowania, które można wyekstrahować z kultur dnia 3, jest bardzo nieprzewidywalna, ponieważ odsetek Ssea-1+/Thy-1,2- zwykle mieści się w zakresie od 1 do 10% żywotnych komórek. W dniach 6 i 9 można wykryć zwiększony odsetek komórek Ssea-1+, zwykle znacznie powyżej 10%. Około 12 dnia można wykryć podzbiór komórek Ssea-1-dodatnich, które również oznaczają dodatni dla Epcam. Kultury dnia 12, podobnie jak kultury dnia 3, stanowią wąskie gardło w oczyszczaniu produktów pośrednich, ponieważ odsetek komórek Ssea-1,2 + / Epcam + jest zmienny i zwykle mieści się w zakresie zaledwie 2-4% wszystkich żywych komórek. Oczekiwana liczba półproduktów do przeprogramowania przedstawiona w tabeli 1 służy jedynie jako przybliżenie. Uznane hodowle komórek iPS w dobrej wierze będą bardzo pozytywne dla Ssea-1 i Epcam.

Rysunek 1. Zmiany markera powierzchniowego podczas szlaku przeprogramowywania: Po regulacji w dół markera identyfikacyjnego fibroblastów Thy-1.2 następuje regulacja w górę Ssea-1. Przejście podzbioru komórek Ssea-1 dodatnich w kierunku stanu pluripotencjalnego jest wskazane przez nabycie Epcam około 12 dnia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie reprogramowalnego modelu myszy: ekspresja m2rtTA jest pod kontrolą wszechobecnie aktywnego locus Rosa26. W obecności doksycykliny (dox) białko m2rtTA wiąże się z promotorem zależnym od tetracykliny (tetOP) w locus kolagenu 1a1 (Col1a1), powodując ekspresję kasety czteroczynnikowej. Dwie kasety bicystroniczne są połączone wewnętrznym miejscem wejścia rybosomu (IRES). Otwarte ramki odczytu dla Oct-4/Klf-4 i Sox-2/c-Myc są łączone odpowiednio przez samodzielne rozszczepianie sekwencji F2A i E2A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Rozwarstwienie zarodka: (A) przenieść róg macicy do 10-centymetrowego naczynia wypełnionego 10 ml PBS i (B) pokroić na kawałki zawierające jeden zarodek. (C) Za pomocą kleszczy uwolnić zarodki od dodatkowej tkanki zarodkowej i usunąć głowę, kończyny, ogon i narządy wewnętrzne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Zmiany morfologiczne podczas przeprogramowywania. Plamy przypominające kolonie stają się widoczne w kulturach od 6 dnia. Prawdziwe iPSC charakteryzują się kopulastą morfologią. (A) Dzień 0/MEFs, (B) Dzień 3, (C) Dzień 6, (D) Dzień 9, (E) Dzień 12, (F) Hodowla komórek iPS. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Podstawowa konfiguracja FACS. (A) Wyklucz szczątki z plamą Side Scatter i Forward Scatter Area blot. (B) Wyklucz agregaty z innych niż szczątki poprzez bramkowanie na populacji pojedynczej komórki z obszarem rozproszenia do przodu i wysokim blotem rozproszenia do przodu. (C) Wyklucz martwe komórki z populacji pojedynczej komórki poprzez bramkowanie na niskich zdarzeniach PI z kanałem PI w porównaniu z plamą Forward Scatter Area. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Bramkowania. (A, B) Korzystając z nieznakowanych komórek kontrolnych, ustaw bramki dla komórek Thy-1.2+/Ssea-1*, komórek Thy-1.2- / Ssea-1- i komórek Thy-1.2- / Ssea-1+. (C) Użyj nieoznakowanych komórek kontrolnych, aby ustawić bramki dla komórek dodatnich i ujemnych Epcam. (D) Komórki Ssea-1 + / Thy-1.2- można podzielić na populację Epcam dodatnią i na populację Epcam ujemną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Thy-1.2 kontra Ssea-1 FACS plami się na różnych etapach procesu przeprogramowywania. (A) Dzień 0/MEFs, (B) Dzień 3, (C) Dzień 6, (D) Dzień 9, (E) Dzień 12, (F) Hodowla komórek iPS.

Tabela 1. Sugerowana gęstość wysiewu, liczba kolby i oczekiwany wynik dla P1 MEF zarodka heterozygotycznego dla OKSM i m2rtTA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

dzień	Liczba kolb T75 wysianych w dniu 0	Całkowita liczba komórek Ssea1+ po FACS	Całkowita liczba komórek Ssea1+/Epcam+ po FACS
3	8	2 miliony
6	4	2 miliony
9	4	2 miliony
12	10	10 milionów	2 miliony

Discussion

Aby skutecznie przeprogramować MEF na komórki iPS i oczyścić produkty pośrednie przeprogramowywania w dużych ilościach, należy zdawać sobie sprawę z czynników, które mają wpływ na ogólną wydajność. W szczególności szkodliwy wpływ może mieć partia FBS stosowana do uzupełniania pożywek iPS. Ogólnie rzecz biorąc, uzyskano pozytywne doświadczenia z zarodkowymi komórkami macierzystymi (ES) kwalifikowanymi komórkami macierzystymi (ES), ale testy seryjne surowic od różnych dostawców mogą zidentyfikować tańszą alternatywę.

Kolejnym czynnikiem, który wpływa na efektywność przeprogramowania, jest genotyp MEF ^15,20. Chociaż MEF-y pochodzące od myszy heterozygotycznych (het) zarówno dla locus OKSM, jak i m2rtTA przeprogramowują się, homozygotyczność w jednym lub obu loci skutkuje wyższą wydajnością przeprogramowywania. Rzeczywiście, MEF pochodzące od potomstwa krzyżówek OKSM i m2rtTA wykazują wzrost efektywności przeprogramowania w następującej kolejności (OKSM/m2rtTA): het/het < homo/het < het/homo < homo/homo (należy zauważyć, że liczby podane w tabeli 1 dotyczą zwierząt het/het). W rzadkich przypadkach zidentyfikowania samca zwierzęcia homo/homo można założyć harem kryjący z wieloma samicami m2rtTA. Całe potomstwo z tych krzyżówek będzie het/homo odpowiednio dla loci OKSM/m2rtTA. Ponadto zaleca się szybkie genotypowanie miotów, ponieważ większe mioty uzyskuje się przy użyciu młodszych myszy do hodowli (w wieku 6-15 tygodni).

Ponadto położono nacisk na wykorzystanie MEF o niskim przelocie do przeprogramowania ²³. Jeśli MEF-y zostały uzyskane i namnażone w normoksyjnym inkubatorze do hodowli tkankowych, zdecydowanie zalecamy stosowanie tych komórek tylko do pasażu 2. Jeśli jednak eksperymentator ma dostęp do inkubatora o niskiej zawartości tlenu (5% tlenu) do wyprowadzania i rozszerzania MEF, liczby pasaży tak wysokie jak 3 nadal przyniosą dobre wyniki ²³.

W przypadku, gdy eksperymentator napotka problemy związane z przeprogramowaniem, jak opisano, najbardziej prawdopodobnymi wyjaśnieniami są wysokie liczby pasaży w momencie dodawania dox, nieprawidłowy genotyp myszy lub użycie FBS, które nie sprzyja wytwarzaniu komórek iPS. Jednak w rzadkich przypadkach zaobserwowaliśmy, że MEF-y nie były w stanie przeprogramować się nawet w idealnych warunkach. W tych przypadkach jako podstawową przyczynę zidentyfikowano spontaniczną delecję de novo w otwartej ramce odczytu m2rtTA.

Metodologia ta została z powodzeniem zaadaptowana do ekstrakcji produktów pośrednich Ssea-1+ poprzez magnetyczną izolację komórek (MACS). Istnieje wyraźna przewaga czasowa w stosowaniu MACS, jednak czystość populacji komórek Ssea-1+ jest zmniejszona do 80-90%, a nie więcej niż 95%, co w zależności od rodzaju eksperymentu, do którego komórki są przeznaczone, może stanowić problem. W związku z tym istnieje możliwość użycia MACS do wzbogacenia komórek Ssea-1 +, a następnie FACS w celu zwiększenia czystości i / lub frakcjonowania ich na komórki Ssea-1 + / Epcam + i Ssea-1 + / Epcam-.

Podczas gdy wykazano, że komórki iPS wytwarzane przez opisany protokół i model mysi są pluripotencjalne i skutecznie przyczyniają się do wszystkich tkanek zwierząt chimerycznych ^15,20, wykazano zmniejszoną zdolność do wytwarzania zarodków całkowicie złożonych z tych komórek iPS poprzez tetraploidalną komplementację ²⁴. Nieprawidłowe wzorce metylacji w klastrze genów Dlk-Dio3 zostały zidentyfikowane jako podstawowa przyczyna ²⁴. Jednak dodanie kwasu askorbinowego w stężeniu 50 μg/ml do pożywki podczas przeprogramowania spowoduje powstanie komórek iPS kompetentnych do tetraploidalnej komplementacji ²⁴. Należy pamiętać, że alternatywny reprogramowalny model myszy zaprojektowany do wyrażania czynników przeprogramowujących przy innej stechiometrii może wytwarzać tetraploidalne kompetentne komórki iPS nawet przy braku leczenia kwasem askorbinowym ²⁵. Jednak w naszych rękach komórki z tego szczepu przeprogramowują się ze znacznie niższą częstotliwością w porównaniu z używanym tutaj modelem myszy.

Metodologia opisana w tym manuskrypcie pozwala na oddzielenie produktów pośrednich przeprogramowywania od opornej na leczenie większości populacji i powinna być postrzegana jako cenne narzędzie do analizy i zrozumienia procesu przeprogramowywania, usuwając wcześniejsze ograniczenia związane z koniecznością użycia populacji niefrakcjonowanej do profilowania (np. wysoki szum sygnału z ogniw ogniotrwałych). Opisana w niniejszym dokumencie kombinacja przeciwciał pozwala na izolację produktów pośrednich z komórek myszy o wysokiej czystości, jednak możliwe jest, że w przyszłości zostaną odkryte dodatkowe markery powierzchni komórek, które pozwolą na otrzymanie produktów pośrednich o jeszcze wyższej czystości. Należy pamiętać, że ekspresja Ssea-1 nie jest cechą charakterystyczną indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych i jako taka protokół ten nie może być stosowany do przeprogramowania komórek pochodzenia ludzkiego. Podsumowując, przeprogramowanie produktów pośrednich po wyizolowaniu opisaną metodą można wykorzystać do analiz molekularnych, w tym profilowania ekspresji, immunoprecypitacji chromatyny, analizy metylomu i testów białek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anty-mysz CD90.2 (Thy1.2) Pacyficzny niebieski	eBionauka	48-0902-82
Anty-ludzka/mysia biotyna SSEA-1	eBionauka	13-8813
Streptawidyna PE-Cy 7	eBionauka	25-4317-82
Anty-Myszy CD326(Epcam) Fitc	eBionauka	48-5791-82
Pirogronian sodu	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11360-070
MEM Aminokwasy endogenne (NEAA)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11140-050
Kwalifikowana do zarodkowych komórek macierzystych płodowa surowica bydlęca (FBS)	Technologie życiowe
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Technologie życiowe	25200-056
Technologie GlutaMAX	Life	Nr kat. 35050-070
β-Merkaptoetanol	Technologie życiowe	21985-023
DMSO (Dimetylosulfotlenek)	Sigma-Aldrich	D8418
Penicylina/streptomycyna	Technologie życiowe	15140
Roztwór jodku propidyny (PI)	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Żelatyna ze skóry wieprzowej	Sigma-Aldrich	G1890
Hykulan doksycykliny	Sigma-Aldrich	33429-100MG-R
Czynnik hamujący białaczkę (LIF)	Milipore	ESG1107
DMEM Wysoki poziom glukozy	Technologie życiowe	11960-044
DPBS (sól fizjologiczna buforu fosforanowego Dulbecco)	Technologie życiowe	14190-144
Nokaut DMEM	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10829-018
Napromieniowane MEF-y	Technologie życiowe	S1520-100
75-cm2 Kolby do hodowli tkankowych	Corning/BD Bioscience
15-mililitrowe probówki wirówkowe	Corning/BD Bioscience
probówek wirówkowych o pojemności 50 ml	Corning/BD Bioscience
Jednorazowe ostrza chirurgiczne	Clifford Hallam	SM0501
Fiolki kriogeniczne	Corning/BD Bioscience
70 & mikro; m Sitko komórkowe	BD Bioscience	352340
Polimeraza DNA Taq	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10342-020