Artykuł metodologiczny

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/51737

⸱

15 września 2014

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony dopaminergiczne (DA) w istocie czarnej pars compacta (znane również jako neurony A9 DA) są specyficznym typem komórek, który jest tracony w chorobie Parkinsona (PD). Istnieje duże zainteresowanie pozyskiwaniem neuronów A9 DA z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do regeneracyjnej terapii zastępczej komórek w chorobie Parkinsona. Podczas rozwoju neuronalnego neurony A9 DA pochodzą z prekursorów płytki podłogowej (FP) znajdujących się w brzusznej linii środkowej ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu zoptymalizowaliśmy warunki hodowli pod kątem stopniowego różnicowania hPSC do neuronów A9 DA, co naśladuje rozwój neuronów DA w zarodku. W naszym protokole najpierw opisujemy efektywne wytwarzanie komórek prekursorowych FP z hPSC przy użyciu metody małocząsteczkowej, a następnie przekształcamy komórki FP w neurony A9 DA, które mogą być utrzymywane in vitro przez kilka miesięcy. Ten skuteczny, powtarzalny i kontrolowany protokół działa dobrze w przypadku ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) od zdrowych osób i pacjentów z chorobą Parkinsona, w których można uzyskać neurony A9 DA do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków oraz terapii przeszczepu komórek in vivo w kierunku PD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony dopaminergiczne (DA) można znaleźć w kilku obszarach mózgu, w tym w śródmózgowiu, podwzgórzu, siatkówce i opuszkach węchowych. Neurony A9 DA w istocie czarnej pars compacta (SNpc) kontrolują zachowanie i ruch, rzutując na prążkowie w przodomózgowiu i tworząc pozapiramidowy układ ruchowy. Zwyrodnienie neuronów A9 DA prowadzi do choroby Parkinsona (PD), która jest drugą najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną u ludzi i obecnie nieuleczalną. Terapia zastępcza jest jedną z najbardziej obiecujących strategii leczenia PD1, dlatego istnieje duże zainteresowanie pozyskiwaniem neuronów A9 DA z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), w tym zarówno ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), jak i niedawno indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Wiele badań próbowało wyprowadzić neurony A9 DA z hPSC przy użyciu różnych metod. Najwcześniejsze doniesienia o wszystkich neuronach DA zostały wygenerowane przez stadium progenitorowe rozety neuronalnej. Poprzez wspólną hodowlęz 3-5 komórkami zrębu MS52 lub PA6 z zewnętrznymi czynnikami wzrostu lub bez nich przez 2-4 tygodnie, L. Studer i współpracownicy oraz trzy inne grupy z powodzeniem indukowali hESC do wytwarzania rozet nerwowych. Następnie wzbogacili te rozety poprzez mechaniczną preparację lub trawienie enzymatyczne w celu dalszego różnicowania. W innych raportach naukowcy wygenerowali rozety neuronalne poprzez różnicowanie kultur pływających w ciele embrionalnym (EB)6-9. Później naukowcy opracowali metodę różnicowania opartą na monowarstwach10,11, w której posiali hESC i hiPSC na matrycy pozakomórkowej, dodali różne czynniki wzrostu do hodowli, aby indukować różnicowanie hPSC do neuronów DA, co naśladuje rozwój embrionalnych neuronów DA in vivo. Chociaż we wszystkich tych badaniach uzyskano komórki eksprymujące hydroksylazę tyrozyny (TH) z pewnymi cechami neuronów DA, cały proces różnicowania jest czasochłonny i pracochłonny, ogólnie nieefektywny, a co ważniejsze, tożsamość A9 tych neuronów nie została wykazana w większości badań, z wyjątkiem jednego z ekspresją ektopową LMX1a12. Niedawno opracowano nowy protokół oparty na płytce podłogowej (FP)13-16, w którym prekursory FP z potencjałem neuronu DA były najpierw generowane przez aktywację szlaków sygnałowych sonic hedgehog i kanonicznych Wnt we wczesnym etapie różnicowania, a następnie te komórki FP zostały następnie określone w neuronach DA. Chociaż ten protokół jest bardziej wydajny, nadal występują pewne problemy; na przykład cały proces różnicowania trwa długo (co najmniej 35 dni) i jest zależny od komórki zasilającej15 lub jest zależny od EB16 lub tożsamość A9 nie została wykazana14.

Tutaj, na podstawie wiedzy z badań nad embrionalnymi neuronami DA in vivo oraz opublikowanych wyników innych badaczy, zoptymalizowaliśmy warunki hodowli dla efektywnego generowania neuronów DA zarówno z hESC, jak i hiPSC. Najpierw wygenerowaliśmy komórki prekursorowe FP poprzez aktywację kanonicznej sygnalizacji Wnt za pomocą CHIR99021 drobnocząsteczkowej i sygnalizacji sonic hedgehog za pomocą małych cząsteczek SAG i purmorfaminy. Te komórki FP wyrażają FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 i NESTIN. Następnie określiliśmy te komórki FP do neuronów DA z czynnikami wzrostu, w tym BDNF, GDNF itp. Wygenerowane neurony DA są typu komórek A9, ponieważ są dodatnie dla GIRK2, a ujemne dla Calbindin17. Protokół ten jest niezależny od komórki zasilającej lub EB, wysoce wydajny i powtarzalny. Korzystając z tego protokołu, można uzyskać neurony DA w czasie krótszym niż 4 tygodnie z hESC lub hiPSC zdrowych osób do badania przeszczepu komórek lub z hiPSC pacjentów z PD do modelowania in vitro PD lub testowania potencjalnych środków terapeutycznych dla PD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych

  1. Przygotować pożywkę dla mysich fibroblastów zarodkowych (MEF), łącząc następujące elementy: 445 ml DMEM, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml 100-krotnego roztworu podstawowego penicyliny/ampicyliny. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 14 dni.
  2. Przygotować pożywkę hodowlaną hPSC zawierającą surowicę, łącząc następujące elementy: 385 ml DMEM/F12, 100 ml zamiennika surowicy nokautującej (KSR), 5 ml 100 x roztwór podstawowy aminokwasów endogennych, 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny, 5 ml 100 x roztwór podstawowy merkaptoetanolu i 10 ng/ml bFGF. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.
  3. Przygotować pożywkę bez surowicy mTeSR1, łącząc następujące elementy: 400 ml podłoża podstawowego mTeSR1, 100 ml 5x suplementu i 5 ml 100x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny. Podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.
  4. Przygotować 10x roztwór podstawowy kolagenazy dożylnie: odważyć 0,5 g kolagenazy w mocy dożylnej, rozpuścić w 50 ml DMEM/F12 i wysterylizować filtrem. Przygotuj porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C przez miesiące.
  5. Przygotować 0,1% roztwór żelatyny: odważyć 0,5 g żelatyny (ze skóry bydlęcej typu B) i rozpuścić w wodzie dejonizowanej. Przechowuj wysterylizowany roztwór w autoklawie w temperaturze pokojowej przez tygodnie.
  6. Przygotować pożywkę różnicującą KSR, łącząc następujące elementy: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100 x nieistotny roztwór podstawowy aminokwasów, 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny, 5 ml 100 x roztwór podstawowy -merkaptoetanolu. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.
    UWAGA: KSR różni się w zależności od partii, co może mieć wpływ na skuteczność różnicowania. Dlatego lepiej jest przetestować kilka partii KSR, aby znaleźć najlepszą do zróżnicowania.
  7. Przygotować pożywkę różnicującą N2, łącząc następujące elementy: 98 ml DMEM, 1 ml 100 x suplement N2 i 1 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.
  8. Przygotować pożywkę różnicującą B27, łącząc następujące elementy: 480 ml pożywki neurobazalnej, 10 ml 50 x suplementu B27, 5 ml 100 x roztwór podstawowy glutamax i 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.

2. Hodowla hESC i hiPSC na komórkach zasilających MEF

H9 hESC zostały uzyskane z WiCell Research Institute, a hiPSC zostały ustanowione w laboratorium Reijo Pera poprzez retrowirusową transdukcję czynników Yamanaka OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC18.

  1. Co najmniej jeden dzień przed pasażem komórkowym przygotować kilka płytek żelatynowych, dodając 1 ml 0,1% żelatyny do 1 dołka z płytek 6-dołkowych i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
  2. Po inkubacji odessać żelatynę z płytek i napromieniować nasiona inaktywowanymi komórkami MEF na płytki o gęstości 1,6 x 105 komórek/dołek w pożywce MEF za pomocą hemocytometru do zliczenia komórek.
    UWAGA: Opcjonalnie należy przygotować karmniki MEF już na 3 dni przed pasażem komórkowym.
  3. Komórki pasażujące jeden dzień po posiewie karmników MEF: odessać pożywkę z hPSC, dodać 1 mg/ml kolagenazy IV do komórek w dawce 1 ml/dołek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Podczas tej inkubacji należy raz przemyć karmniki MEF PBS, a następnie dodać ciepłą (37 °C) pożywkę hodowlaną hPSC zawierającą surowicę w ilości 1,5 ml/studzienkę.
  5. Po 1 godzinie postukaj kilka razy w płytkę hodowlaną, aby większość niezróżnicowanych kolonii oderwała się od płytek, podczas gdy zróżnicowane kolonie pozostaną przyczepione. Ostrożnie zbierz pływające kolonie i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Delikatnie umyj płytkę ciepłym (37 °C) DMEM/F12 i przenieś DMEM/F12 do tej samej probówki o pojemności 15 ml.
  7. Odwirować probówki o masie 179 x g przez 3 minuty.
  8. Zassać pożywkę z probówek, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj ciepłą pożywkę hodowlaną hPSC, kilkakrotnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby rozbić je na małe skupiska i dobrze wymieszać.
  9. Przenieś komórki na nowe podajniki MEF w stosunku 1:3-1:6.
  10. Zmieniaj pożywkę codziennie i przechodź komórki co 5-6 dni.

3. Przygotowanie komórek do różnicowania

  1. Co najmniej jeden dzień przed przygotowaniem komórek należy przygotować kilka płytek Matrigel (zazwyczaj 3 dołki z płytki 6-dołkowej). Rozcieńczyć Matrigel zimnym (4 °C) DMEM/F12 w stosunku 1:40 i dodać 1 ml Matrigelu do dołka z płytkami 6-dołkowymi. Inkubować płytki Matrigel w temperaturze 4 °C przez noc. UWAGA: Płytki Matrigel można uszczelnić preparatem Parafilm i przechowywać w temperaturze 4 °C nawet przez tydzień.
  2. Użyj komórek (patrz krok 2) 4 dni po pasażu. Usuń wszystkie zróżnicowane kolonie z płytek. Odessać pożywkę z płytki hodowlanej, dodać 1 ml akutazy do dołka i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  3. Podczas inkubacji przygotuj kilka płytek żelatynowych, dodając 1 ml żelatyny do 1 dołka z płytek 6-dołkowych. Umieścić te płytki oraz płytki Matrigel przygotowane dzień wcześniej w inkubatorze.
  4. Po 5-minutowej inkubacji lub gdy komórki staną się półpływające, należy kilkakrotnie pipetować komórki w górę i w dół, aby przekształcić je w pojedyncze komórki.
  5. Zebrać pojedyncze komórki do probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 258 x g przez 3 minuty.
  6. Zawiesić komórki odpowiednią ilością surowicy zawierającej pożywkę hodowlaną hPSC i dodać tiazowiwinę do końcowego stężenia 2 μM.
  7. Przenieść komórki na płytki pokryte żelatyną w stosunku 1:1 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu usunięcia podajników MEF.
  8. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodać odpowiednią surowicę zawierającą pożywkę hPSC i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  9. Odwirować komórki przy 258 x g przez 3 minuty.
  10. Podczas wirowania dodać tiazowiwinę do odpowiedniej pożywki mTeSR1, aby uzyskać stężenie 2 μM.
  11. Po odwirowaniu odessać pożywkę i dodać odpowiednią pożywkę mTeSR1 z tiazowiwiną, tak aby pozostało 1,8 x 105 komórek/ml pożywki.
  12. Wyjąć płytki Matrigel z inkubatora, odessać Matrigel i dodać 2 ml zmieszanych komórek do 1 dołka z płytek 6-dołkowych.
    UWAGA: Gęstość komórek powinna wynosić 3,6 x 104 komórki/cm2 powierzchni.
  13. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom przyczepić się przez 24 godziny.
  14. 24 godziny po posianiu komórek, odessać starą pożywkę i dodać 2 ml nowej pożywki mTeSR1 do dołka i pozwolić komórkom rosnąć przez kolejne 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania.

Różnicowanie komórek

  1. Rozpocznij różnicowanie 48 godzin po ponownym posadzeniu komórek na płytkach Matrigel.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną z płytki, przemyć komórki raz PBS i dodać 2 ml następującej pożywki różnicującej do dołka: pożywka różnicująca KSR uzupełniona 10 μM SB431542 i 100 nM LDN-193189. Oznacz ten dzień jako D0 zróżnicowania.
  3. Zmieniaj medium codziennie od D0 do D20.
    UWAGA: Pożywkę można przygotować do użycia nie dłużej niż 2 dni za jednym razem.
  4. Dla D1 i D2 należy użyć następującej pożywki: pożywki różnicującej KSR uzupełnionej o 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 μM SAG, 2 μM purmorfaminę i 50 ng/ml FGF8b.
  5. Dla D3 i D4 należy użyć następującego podłoża: pożywki różnicującej KSR uzupełnionej o 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 μM SAG, 2 μM purmorfaminę, 50 ng/ml FGF8b i 3 μM CHIR99021.
  6. Dla D5 i D6 należy użyć następującej pożywki: 75% pożywki różnicującej KSR plus 25% pożywki różnicującej N2 uzupełnionej 100 nM LDN-193189, 0,25 μM SAG, 2 μM purmorfaminy, 50 ng/ml FGF8b i 3 μM CHIR99021.
  7. Dla D7 i D8 należy użyć następującej pożywki: 50% pożywki różnicującej KSR plus 50% pożywki różnicującej N2 uzupełnionej 100 nM LDN-193189 i 3 μM CHIR99021.
  8. Dla D9 i D10 należy użyć następującej pożywki: 25% pożywki różnicującej KSR plus 75% pożywki różnicującej N2 uzupełnionej 100 nM LDN-193189 i 3 μM CHIR99021.
  9. Dla D11 i D12 należy użyć następującej pożywki: pożywki różnicującej B27 uzupełnionej o 3 μM CHIR99021, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 1 ng/ml TGF3, 0,2 mM kwasu askorbinowego i 0,1 mM cAMP.
  10. Do pozostałej części różnicowania należy użyć następującej pożywki: pożywki różnicującej B27 uzupełnionej 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 1 ng/ml TGF3, 0,2 mM kwasu askorbinowego i 0,1 mM cAMP.
  11. Przy około D16 różnicowania przygotuj płytki z poli-L-ornityną/laminą/fibronektyną. Rozcieńczyć roztwór podstawowy poli-L-ornityny zimnym (4 °C) PBS do 15 μg/ml, dodać 1 ml do 1 dołka z płytek 6-dołkowych i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  12. Odessać roztwór poli-L-ornityny, umyć płytki 3 razy sterylną wodą, a następnie wysuszyć płytki na powietrzu.
  13. Rozcieńczyć roztwór podstawowy lamininy zimnym (4 °C) PBS do 1 μg/ml, dodać 1 ml do jednego dołka z płytkami 6-dołkowymi i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  14. Odessać roztwór lamininy, umyć płytki 3 razy sterylną wodą, a następnie wysuszyć płytki na powietrzu.
  15. Rozcieńczyć roztwór podstawowy fibronektyny zimnym (4 °C) PBS do 2 μg/ml, dodać 1 ml do 1 dołka z płytkami 6-dołkowymi i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  16. Uszczelnić płytki Parafilmem i umieścić je w temperaturze 4 °C na okres do dwóch tygodni.
  17. Po 20 dniach różnicowania należy ponownie umieścić komórki na płytkach z poli-L-ornityną/laminą/fibronektyną. Odessać pożywkę różnicującą, dodać 1 ml ciepłej (37 °C) akutazy do 1 dołka z płytek 6-dołkowych i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  18. Podczas inkubacji umieścić w inkubatorze płytki z poli-L-ornityną/laminą/fibronektyną.
  19. Po 5-minutowej inkubacji lub gdy komórki staną się półpływające, delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół kilka razy, aby przekształcić je w pojedyncze komórki.
  20. Zbierz pojedyncze komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i dodaj odpowiednią ilość podłoża neurobazalnego do zliczania komórek, które będzie się różnić w zależności od ekspansji (po 11 dniach różnicowania komórki mogą rozszerzyć się 15-20 razy). Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  21. Odwirować komórki przy 258 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki różnicującej B27 tak, aby stężenie komórek wynosiło 1 x 106 komórek/ml pożywki.
  22. Odessać fibronektynę z płytek, przemyć dwukrotnie PBS i dodać 2 ml komórek do 1 dołka z płytek 6-dołkowych.
    UWAGA: Gęstość komórek do ponownego powlekania powinna wynosić 2 x 105 komórek/cm2 powierzchni.
  23. Zmień pożywkę 24 godziny później, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone martwe komórki.
  24. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do uzyskania pożądanych punktów czasowych dla danego eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd protokołu różnicowania jest pokazany na rysunku 1. Skuteczność przedstawionego tutaj protokołu różnicowania zależy od statusu komórek startowych. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że po pierwsze usuwa się wszystkie zróżnicowane kolonie przed dysocjacją hPSC na pojedyncze komórki w celu różnicowania, a po drugie, wyczerpuje się większość, jeśli nie wszystkie, komórki zasilające MEF poprzez inkubację komórek na płytkach pokrytych żelatyną przez 30 minut, a po trzecie, umieszcza się pojedyncze k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (w tym zarówno hESC, jak i hiPSC) mogą być różnicowane in vitro w celu wytworzenia większości, jeśli nie wszystkich, typów komórek naszego ciała, w tym neuronów DA, co wykazano w poprzednich badaniach19. Tutaj, w oparciu o wiedzę z rozwoju embrionalnych neuronów dopaminergicznych20 i opublikowane protokoły z innych laboratoriów14,15, zoptymalizowaliśmy warunki hodowli neuronów DA z hESC i hiPSC. Protokół ten jest skuteczny, powtarzalny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom laboratorium Renee Reijo Pera za pomoc podczas opracowywania tego protokołu i podczas przygotowywania tego manuskryptu. Prace te są wspierane przez wspólne laboratorium Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) (CL-00518).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMLife Technologies10569-010
FBSLife Technologies26140
penicylina/ampicylinaLife Technologies15140-122
DMEM/F12Life Technologies10565-018
KSRLife Technologies10828-028
Endogenny aminokwasLife Technologie11140-050
b-merkaptoetanolMilliporeES-007-E
bFGFR& D Systems233-FB-025
mTesR1STEMCELL Technologies5850
Kolagenaza IVLife Technologies17104-019
ŻelatynaSigma-AldrichG9391
Suplement N2Life Technologies17502-048
B27 suplementLife Technologies17504-044
NeurobasalLife Technologies21103-049
GlutamaxLife Technologies35050-061
PBSLife Technologies10010-023
Matrigel o obniżonym czynniku wzrostuBD Biosciences354230
AccutaseMP Biomedicals1000449
TiazovivinSanta Cruz Biotechnologysc-361380
SB431542Tocris Bioscience1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
PurmorphamineSanta Cruz Biotechnologysc-202785
FGF8bR& D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TechnologyC2447-2S
BDNFR& D Systems248-BD-025
GDNFR& D Systems212-GD-010
TGF-beta3R& D Systems243-B3-002
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4034
cAMPSigma-AldrichD0627
Mysie przeciwciało anty ludzkie NESTINSanta Cruz Biotechnologysc-23927/1,000 rozcieńczenie
Królik anty ludzkie przeciwciało OTX2MilliporeAB95661/2,000 rozcieńczenie
Kozioł anty ludzkie przeciwciało FOXA2R& D SystemsAF24001/200 rozcieńczenie
królik przeciwciało przeciw ludzkiemu LMX1aMilliporeAB10533rozcieńczenie 1/1,000
Królicze przeciwciało anty ludzkie THPel FreezP40101rozcieńczenie 1/500
Kurczak anty ludzkie przeciwciało THMiliporeAB97021/500 rozcieńczenie
Mysz anty ludzkie przeciwciało TUJ1CovanceMMS-435P1/,2000 rozcieńczenie
Królicze przeciwciało anty ludzkie GIRK2Abcamab307381/300 rozcieńczenie
Królik anty ludzkie przeciwciało CalbindinAbcamab250851/400 rozcieńczenie
WirówkaEppendorf5804
1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
  4. Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
  5. Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
  6. Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  7. Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
  8. Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
  9. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
  10. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
  12. Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
  13. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
  14. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  15. Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
  16. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
  17. Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
  18. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  19. Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
  20. Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
  21. Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
  22. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Prekursory p ytki dnaneurony dopaminergiczne A9rozw j neuronalnymikroskopia immunofluorescencyjnapo ywki do hodowli kom rkowychzawiesina pojedynczych kom rekpoli L ornitynap ytki pokryte Matrigelem

Powiązane artykuły