Opracowano protokoły do efektywnego przygotowania jednorodnych próbek przędziorków, inwazji eksperymentalnych roślin i oceny uszkodzeń roślin, wymaganych do badań interakcji roślina-szkodnik
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae do badań interakcji między roślinami a szkodnikami
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przędziorek dwuplamisty, Tetranychus urticae, jest wszechobecnym polifagicznym stawonogiem roślinożercą, który żywi się niezwykle szerokim wachlarzem gatunków, z ponad 150 wartościami ekonomicznymi. Jest głównym szkodnikiem upraw szklarniowych, zwłaszcza psiankowatych i dyniowatych (np. pomidorów, bakłażanów, papryki, ogórków, cukinii) i roślin ozdobnych szklarniowych (np. róż, chryzantem, goździków), jednorocznych upraw polowych (takich jak kukurydza, bawełna, soja i buraki cukrowe) oraz w uprawach wieloletnich (lucerna, truskawki, winogrona, cytrusy i śliwki)1,2. Oprócz ekstremalnej polifagii, która czyni go ważnym szkodnikiem rolniczym, T. urticae ma tendencję do rozwijania odporności na szeroką gamę insektycydów i akarycydów, które są stosowane do jego zwalczania3-7.
T. urticae jest doskonałym organizmem doświadczalnym, ponieważ ma szybki cykl życia (7 dni w temperaturze 27 °C) i może być łatwo utrzymywany w dużym zagęszczeniu w laboratorium. Opracowano metody oznaczania ekspresji genów (w tym hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciał) oraz inaktywacji ekspresji endogennych genów przędziorków za pomocą interferencji RNA8-10. Ostatnio opisano sekwencję całego genomu T. urticae, co stworzyło okazję do rozwoju tego roślinożercy jako organizmu modelowego o równoważnych zasobach genomowych, które już istnieją w niektórych roślinach żywicielskich (Arabidopsis thaliana i pomidor Solanum lycopersicum)11. Łącznie te organizmy modelowe mogą dostarczyć informacji na temat molekularnych podstaw interakcji między roślinami a szkodnikami.
Tutaj opisana jest skuteczna metoda szybkiego i łatwego zbierania dużej liczby dorosłych samic roztoczy, ich zastosowania na eksperymentalnym żywicielu rośliny, oraz oceny uszkodzeń roślin spowodowanych żerowaniem przędziorków. Przedstawiony protokół umożliwia szybkie i efektywne pobranie setek osobników na każdym etapie rozwoju (jaja, larwy, nimfy, dorosłe samce i samice), które mogą być wykorzystane do późniejszej aplikacji eksperymentalnej.
Wprowadzenie
Interakcja między roślinami a szkodnikami to temat o dużym znaczeniu naukowym i ekonomicznym. Historycznie badano go zarówno przy użyciu roślin uprawnych (takich jak pomidor), jak i rośliny modelowej, A. thaliana. W obu przypadkach podatność roślin na zwierzęta roślinożerne można zmierzyć albo bezpośrednio poprzez ocenę fenotypu rośliny po ataku roślinożerców, albo pośrednio poprzez ocenę wydajności agrofagów.
Bezpośrednie pomiary podatności roślin były wcześniej wykorzystywane dla wielu gatunków szkodników owadzich przy użyciu różnych metod. Na przykład roślinożerność larw lepidoptera mierzy się jako oszacowanie porcji tkanki roślinnej spożywanej przez Plutella xylostella (diamentowa) lub Trichoplusia ni (chwytacz kapusty) gołym okiem za pomocą siatki12. Istnieją również metody, które wykorzystują cyfrowe obrazowanie uszkodzeń liści z późniejszą ilościową analizą obrazu. Metody te zastosowano w badaniach interakcji A. thaliana z Frankliniella occidentalis (wciornastki zachodnie)13, Scaptomyza flava (drosophila kopiąca liście)14 i T. ni15.
Pośrednie pomiary podatności roślin są szeroko stosowane w badaniach interakcji między roślinami a szkodnikami. Na przykład podatność A. thaliana na mszycę brzoskwiniową Myzus persicae roślinożerną jest zwykle oceniana poprzez analizę płodności szkodników i opis ogólnej morfologii rośliny po interakcji16,17. Innym typowym pośrednim wskaźnikiem podatności A. thaliana na agrofaga jest ocena suchej lub mokrej masy roślinożercy. Parametr ten jest powszechnie stosowany do charakterystyki roślinożerności lepidotera, takich jak Pieris rapae (mały biały), P. xylostella lub T. ni w stadium larwalnym lub poczwarkowym15,17.
Przędziorki żywią się zawartością komórkową. Uszkodzenia wywołane przez roztocza są rozpoznawane jako zbiór chlorotycznych plam o kolorze od białego do bladozielonego. Podatność żywiciela rośliny na roślinożerność przędziorków była wcześniej oceniana albo pośrednio, poprzez analizę wydajności przędziorków w ciągu kilku dni po inwazji18,19, albo bezpośrednio przy użyciu ogólnej morfologii roślin kilka tygodni po inwazji18 lub przy użyciu cyfrowego obrazowania liści wystawionych na działanie roztoczy przez kilka dni z późniejszą automatyczną analizą obrazu19. Metody te były opracowywane i wykorzystywane do badań interakcji między roślinami pomidora a T. urticae i zazwyczaj wykorzystywały niewielką liczbę przędziorków (5-15 na zabieg), które zbierano z mieszanej populacji roztoczy i umieszczano na powierzchni liści za pomocą szczotki z miękkiego włosia. Jednak metody te nie nadają się do badań, w których konieczne jest zastosowanie większej liczby roztoczy. Ponadto, podczas gdy bezpośrednie przetwarzanie obrazów liści w oprogramowaniu do analizy obrazu, takim jak Adobe Photoshop (San Jose, CA) lub ImageJ20, może być wykorzystywane do analizy uszkodzeń pomidorów, protokoły te wymagają modyfikacji, aby można je było zastosować do liści, które mają większy współczynnik odbicia powierzchni lub są lekko zabarwione i mają dobrze widoczne trichomy (np. A. thaliana), które zakłócają automatyczną selekcję chlorotycznych plam oznaczających uszkodzenie rośliny. Co więcej, stadium rozwojowe przędziorków, które można łatwo wykorzystać poprzednimi metodami, jest ograniczone do najbardziej rozpowszechnionych i łatwych do zidentyfikowania dorosłych samic i wyklucza wykorzystanie innych etapów rozwojowych.
Pierwszym krytycznym krokiem w kierunku wysokoprzepustowej analizy interakcji roślina-przędziorek jest ustanowienie powtarzalnych, prostych i solidnych protokołów do walki z przędziorkami i wiarygodnej oceny wyników interakcji.
W tym filmie opisana jest skuteczna metoda szybkiego i łatwego zbierania dużej liczby dorosłych samic roztoczy, ich zastosowanie na eksperymentalnym żywicielu rośliny, oraz ocena szkód spowodowanych żerowaniem przędziorków. Przedstawiony protokół umożliwia szybkie i efektywne pobranie setek osobników na każdym etapie rozwoju (jaja, larwy, nimfy, dorosłe samce i samice), które mogą być wykorzystane do późniejszej aplikacji eksperymentalnej. Ponadto protokoły te można zastosować do dowolnej rośliny żywicielskiej roztoczy, ale są one wyraźnie wykazane w przypadku A. thaliana.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Utrzymanie populacji przędziorków
UWAGA: Przędziorki są hodowane na kalifornijskiej czerwonej fasoli (Phaseolus vulgaris).
- Uprawiaj rośliny fasoli z nasion przez 2-3 tygodnie przed inwazją.
- Wymieszaj te rośliny z porażonymi roślinami; dorosłe roztocza szybko skolonizują świeży materiał roślinny.
- Usuwaj stare porażone rośliny fasoli co 7-10 dni, zastępując je świeżymi roślinami.
2. Zbieranie dorosłych samic roztoczy
- Zbieranie roztoczy metodą prania
- Aby zebrać roztocza, umieść świeżą roślinę fasoli w kontakcie z porażonymi roślinami na 1 do 2 dni przed eksperymentem.
- Użyj od 20 do 30 świeżych roślin fasoli, aby zebrać od 1,000 do 2,000 dorosłych żeńskich roztoczy .
- Przygotować roztwór Tween 20 o stężeniu 0,001%, używając wody z kranu o temperaturze pokojowej.
- Umyj porażone rośliny fasoli w roztworze Tween 20, używając 2 do 3 roślin na raz.
- Każda roślina jest myta 2-3 razy, aby zebrać wszystkie roztocza z liści.
- Wykonaj krok 2.1.4 w ciągu 10 minut, aby uniknąć śmiertelności roztoczy.
- Izolacja dorosłych samic roztoczy przez filtrację zawiesiny roztoczy przez sita o określonym rozmiarze oczek
- Przygotować sita o następujących rozmiarach oczek: 500 μm (w celu usunięcia zanieczyszczeń) i 300 μm (w celu zebrania dorosłych samic roztoczy) (rysunek 1A).
- Przefiltrować zawiesinę przez sito 500 μm.
- Ponownie przefiltrować zawiesinę przez sito 300 μm. Dorosłe samice roztoczy zostaną zachowane.
- Zanurz sito o średnicy 300 μm z dorosłymi samicami roztoczy w czystej wodzie z kranu, aby usunąć Tween 20.
- Rozłóż roztocza w jednej warstwie na dnie sita.
- Użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar wody z siatki i boków sita. UWAGA: Dzieje się tak, ponieważ roztocza muszą szybko wyschnąć, aby się zregenerować.
- Przygotuj zespół, jak pokazano na rysunku 1B; pozwoli to roztoczom na swobodne poruszanie się, ale zapobiegnie ich ucieczce.
- Umieść sitko z roztoczami na sitku, które służy jako podpora.
- Otocz dolne sito wodą, aby zapobiec rozpraszaniu się roztoczy. UWAGA: Roztocza zaczną się regenerować po około 5 minutach. Po około 30 minutach liczba poruszających się roztoczy jest wystarczająca do rozpoczęcia zbierania (ryc. 1D). Roztocza należy zebrać w ciągu 1 godziny, ponieważ wytwarzają jedwab, który będzie przeszkadzał w zbieraniu.
3. Inwazja roślin przez roztocza
UWAGA: Gdy dorosłe samice roztoczy wyzdrowieją, mogą być wykorzystane do infestacji roślin. Istnieją 2 metody stosowane do zarażania roślin doświadczalnych dorosłymi żeńskimi roztoczami: a) przy użyciu cienkiej szczotki (sekcja protokołu 3.1) i b) przy użyciu pompy lub przewodu próżniowego (sekcja protokołu 3.2).
- Inwazja roztoczy za pomocą szczotki
UWAGA: Inwazja przędziorków za pomocą pędzla służy do aplikacji do 30 roztoczy na roślinę.- Użyj pędzla artystycznego z miękkimi włosami w rozmiarze 00 lub mniejszym.
- Zwilż szczotkę wodą z kranu RT.
- Delikatnie zbierz roztocza z sitka za pomocą końcówki szczoteczki i przenieś je do rośliny.
- Inwazja roztoczy za pomocą Pump
UWAGA: Porażenie roślin roztoczami zebranymi przez pompę/przewód próżniowy stosuje się, gdy stosuje się więcej niż 30 roztoczy. Do tej metody można użyć pompy próżniowej do pobierania komponentów mikroelektronicznych lub linii próżniowej. Ważne jest, aby przepływ powietrza był stały i miał wystarczającą siłę (2-4 psi).- Przymocuj końcówkę pipety o pojemności 1 ml do probówki, która łączy się z pompą lub przewodem próżniowym, używając rurki wirówkowej o pojemności 1,5 ml wyciętej na dole jako adapter między pompą/rurką próżniową a końcówką.
- Umieść kawałek ręcznika papierowego między końcówką pipety a adapterem (probówka wirówkowa o pojemności 1,5 ml). UWAGA: ma to na celu uwięzienie roztoczy wewnątrz końcówki pipety podczas procesu zasysania, a także zmniejszenie przepływu powietrza (rysunek 1C).
- Zbieraj roztocza bezpośrednio z sitka za pomocą końcówki pipety.
- Alternatywnie zbieraj roztocza jeden po drugim z porażonych liści za pomocą stereoskopu.
- Po zebraniu wymaganej liczby roztoczy wyjmij końcówkę pipety z tuby, upewniając się, że kawałek ręcznika papierowego z tyłu końcówki pipety nie jest naruszony.
- Zbierz roztocza, stukając w końcówkę pipety i zbijając roztocza razem. Następnie umieść je na liściu; W ciągu kilku sekund roztocza zaczną rozpraszać się na liściu.
4. Rejestrowanie i ocena szkód wyrządzonych roślinom
- Rejestrowanie uszkodzeń instalacji
UWAGA: W przypadku A. thaliana uszkodzenia roślin ocenia się po 4 dniach żerowania roztoczy. Uszkodzenie jest rejestrowane jako całkowita powierzchnia plam chlorotycznych. W celu pomiaru uszkodzeń cała rozeta jest wycinana i skanowana. Opisane parametry skanowania dotyczą skanera Epson V30, ale będą stanowić dobry punkt wyjścia dla każdego podobnego skanera płaskiego. Utrzymuj stałe parametry skanowania dla wszystkich eksperymentów, co pozwala na porównanie między poszczególnymi przebiegami eksperymentów.- Przykryj łoże skanera arkuszem przezroczystości, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni skanera materiałem roślinnym.
- Wytnij całą rozetę i umieść ją na łożu skanera tak, aby adaksjalna (górna) strona liści była skierowana w stronę źródła światła skanera i elementu przechwytującego. Alternatywnie, jeśli rozety są zbyt gęste, aby uchwycić pojedyncze liście bez nakładania się, przed umieszczeniem na łóżku skanera rozeta powinna podzielić rozetę na pojedyncze liście lub grupy niezachodzących na siebie liści. Wiele rozet może być skanowanych jednocześnie.
- Przykryj rozety lub liście kawałkiem białego papieru, aby zapobiec przywieraniu i zanieczyszczeniu pokrywy skanera.
- Zamknij pokrywę skanera i wykonaj skanowanie z następującymi parametrami: Rozdzielczość: 1 200 dpi; Tryb koloru: Adobe RGB; Jasność: +25; Typ pliku: JPEG najwyższej jakości.
- Zapisz pliki obrazów do późniejszej analizy uszkodzeń.
- Kwantyfikacja szkód w roślinach
UWAGA: Obszar uszkodzenia jest obliczany ręcznie za pomocą programu Photoshop. Ze względu na duże różnice w kształcie liści i intensywności koloru objawów w wyniku żerowania roztoczy, metody automatyczne były zawodne. W związku z tym do oceny szkód wyrządzonych przez rośliny stosuje się metodę siatki:- Otwórz obraz rośliny w Photoshopie.
- Utwórz nową warstwę, a następnie nałóż zeskanowany obraz na siatkę podziałów 0,25 mm x 0,25 mm (Widok lub Wyświetl – Pokaż – Siatka, skrót klawiaturowy Ctrl + ').
- Na nałożonej warstwie zaznacz uszkodzone obszary liści za pomocą kropki (użyj "Narzędzia ołówka", skrótu klawiaturowego B). Użyj jednej kropki na każdy kwadrat siatki, poniżej którego występują uszkodzenia pokrywające więcej niż połowę jednostki siatki. Rozmiar kropki jest zdefiniowany w pikselach (tj. 52 piksele na punkt).
- Gdy wszystkie kwadraty siatki, które pokazują uszkodzenia roślin pokrywające co najmniej połowę jednostki siatki, są oznaczone kropką, użyj narzędzia histogramu (Okno - Histogram), aby określić całkowitą liczbę pikseli na warstwie. Narzędzie histogramu pozwala zmierzyć liczbę pikseli. Ponieważ każda kropka jest reprezentowana przez stałą i znaną liczbę pikseli, narzędzie histogramu zmierzy całkowitą liczbę pikseli, reprezentującą całkowitą liczbę kropek, a co za tym idzie, całkowitą liczbę zaznaczonych kwadratów.
- Oblicz liczbę "kropek" oznaczonych za pomocą wzoru:
Liczba punktów = całkowita liczba pikseli/liczba pikseli na kropkę. - Oblicz całkowity obszar uszkodzenia, mnożąc liczbę zaznaczonych punktów na obrazie przez powierzchnię 1 kwadratu siatki, ponieważ jedna kropka odpowiada jednemu kwadratowi siatki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując od 20 do 30 zainfekowanych roślin fasoli, można zebrać około 2 000 dorosłych samic roztoczy za pomocą sit. Czas potrzebny na zainfekowanie 10 roślin przez 20 roztoczy na roślinę wynosi około 15 min w przypadku użycia pędzelka do przenoszenia roztoczy. Połączenia metod zbierania i aplikacji przedstawiono na Rysunku 2.
Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników w zakresie uszkodzeń roślin, wykazując, że zebrane roztocza znajdują się w podobnym st...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten film pokazuje protokoły stosowane do izolowania i zarażania roślin dużą liczbą dorosłych żeńskich roztoczy. Chociaż przedstawiliśmy ten protokół przy użyciu A. thaliana, może on być stosowany w dowolnym systemie interakcji roślina-przędziorek, a obecnie jest z powodzeniem stosowany również na roślinach pomidorów i winorośli (Vitis vinifera). Protokół daje powtarzalne wyniki, wskazujące, że zebrane roztocza są w porównywalnym stanie fizjologicznym (ryc. 3).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt został sfinansowany przez Rząd Kanady poprzez Genome Canada i Ontario Genomics Institute (OGI-046) oraz Ontario Research Fund-Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (do M.G. i V.G.). T.V.L. jest adiunktem w Funduszu Badań Naukowych Flandrii (FWO).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiał roślinny: | |||
| kalifornijska czerwona fasola | Stokes, Thorold, ON, Kanada | 2 tygodnie, dobrze zaatakowana przędziorkami 2 lub 3 dni przed użyciem. Można stosować inne odmiany Phaseolus vulgaris. | |
| Chemikalia: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% roztwór podstawowy jest przygotowany w celu uproszczenia porcjowania |
| Woda | W temperaturze pokojowej szok cieplny i zimny wpływa na przeżywalność i wydajność roztoczy | ||
| Inne materiały i sprzęt: | |||
| Plastikowa taca | |||
| Zestaw nożyczek | |||
| Zlewki | |||
| Ręczniki | |||
| Zestawy sit | Wyprodukowano we własnym zakresie | Dostępne są szczegółowe instrukcje | |
| Cienka szczoteczka | |||
| Pipety | |||
| Końcówki | 0,2 i 1 ml | ||
| Probówki wirówkowe 1,5 ml | |||
| Pompa | Pompa typu akwariowego z odwróconym przepływem powietrza. Można użyć linii próżniowej. Wymagany spadek ciśnienia wynosi ok. 2-4 psi | ||
| Skaner stereoskopowy | |||
| Epson | V30 | Każdy skaner płaski umożliwiający niezbędny stopień kontroli nad jakością skanowania. Do naszych eksperymentów używamy Epson V30. | |
| Komputer | systemem Windows lub OS X, który jest kompatybilny ze skanerem i oprogramowaniem Adobe Photoshop. | ||
| Oprogramowanie Adobe Photoshop | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | różne | Dowolna wersja z dołączonym narzędziem Histogram. |
Bibliografia
- Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. Mites injurious to economic plants. , University of California Press. (1975).
- Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
- Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
- Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
- Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
- Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
- Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
- Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
- Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
- Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
- Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
- Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genetics. 161, 325-332 (2002).
- Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
- Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
- Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
- Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
- Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
- Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
