Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immunofluorescencyjna metoda charakteryzacji komórek przełyku Barretta

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51741

⸱

20 lipca 2014

 ,  , 
1Center for Thoracic Disease and Transplantation, Heart and Lung Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Istnieje wyraźna potrzeba poprawy informacji na temat molekularnych czynników napędzających przełyk Barretta. Barwienie immunofluorescencyjne jest przydatną techniką do zrozumienia wpływu sygnalizacji komórkowej na morfologię komórki. Przedstawiamy prosty, skuteczny protokół stosowania barwienia immunofluorescencyjnego do oceny leczenia terapeutycznego w komórkach przełyku Barretta.

Streszczenie

Gruczolakorak przełyku (EAC) ma ogólny wskaźnik przeżycia mniejszy niż 17%, a częstość występowania EAC dramatycznie wzrosła w ciągu ostatnich dwóch dekad. Jednym z głównych czynników ryzyka EAC jest przełyk Barretta (BE), metaplastyczna zmiana normalnego przełyku płaskonabłonkowego w odpowiedzi na przewlekłą zgagę. Pomimo dobrze ugruntowanego związku między EAC i BE, badanie zdarzeń molekularnych, w szczególności zmienionych szlaków sygnałowych obejmujących progresję BE do EAC, jest słabo poznane. W dużej mierze wynika to z braku odpowiednich modeli in vitro do badania tych chorób. Ostatnio unieśmiertelnione linie komórkowe BE stały się dostępne komercyjnie, co pozwala na badania in vitro BE. W niniejszej pracy przedstawiono metodę barwienia immunofluorescencyjnego unieśmiertelnionych linii komórkowych BE, pozwalającą na scharakteryzowanie in vitro sygnalizacji i struktury komórki po ekspozycji na związki terapeutyczne. Zastosowanie tych technik pomoże w uzyskaniu wglądu w mechanizmy związane z progresją BE do EAC i zapewni potencjalne możliwości leczenia i zapobiegania EAC.

Wprowadzenie

Przełyk Barretta (BE) jest metaplastyczną zmianą w normalnym nabłonku płaskonabłonkowym przełyku i konsekwencją przewlekłej ekspozycji na treść żołądkową wynikającą z choroby refluksowej przełyku (GERD)1. Uważa się, że BE jest mechanizmem ochronnym w odpowiedzi na GERD, jednak obecność BE zwiększa ryzyko gruczolakoraka przełyku (EAC), choroby, która wiąże się ze znacznie słabym przeżyciem1. Obecne szacunki sugerują, że do 5,6% populacji amerykańskiej ma BE, jednak ponieważ BE często przebiega bezobjawowo, uważa się, że większość BE pozostajeniezdiagnozowana2. Ponieważ wskaźniki zapadalności zarówno na GERD, jak i EAC stale rosną3, ważne stało się zrozumienie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w progresję BE do EAC, zwłaszcza że informacje te mogą potencjalnie dostarczyć podejść terapeutycznych w celu zapobiegania progresji BE do EAC.

Badania prowadzone przez pacjentów doprowadziły do powstania obecnego paradygmatu patogenezy BE-EAC1. Przewlekłe stany zapalne, urazy i uszkodzenia genotoksyczne wynikające z długotrwałej ekspozycji na treść żołądkową wywierają selektywny nacisk na zmianę BE, sprzyjając progresji nowotworu do EAC. Podczas progresji BE do EAC zidentyfikowano szereg zmian genetycznych. Jednak pomimo tego istnieje wyraźny brak zrozumienia dokładnych zmian w sygnalizacji komórkowej i ich wpływu na strukturę i funkcję komórki.

Unieśmiertelnione linie komórkowe in vitro są użytecznymi narzędziami do badania efektów sygnalizacji komórkowej, szczególnie do badania efektów docelowych związków terapeutycznych. Niedawna komercyjna dostępność unieśmiertelnionych linii komórkowych BE pozwala na takie badania. Chociaż testy wysokoprzepustowe, takie jak szeroko stosowane testy żywotności, mogą być cenne w ocenie wpływu terapii celowanych na proliferację komórek i przeżycie4-6, testy te nie są przydatne do badania wpływu sygnalizacji komórkowej na morfologię komórki. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) jest przydatną techniką badania wpływu terapii celowanych na cechy morfologiczne, wzrost i przeżycie komórek i zaangażowanych białek. Nasze laboratorium dostosowało te metody do unieśmiertelnionych linii komórkowych BE, wykorzystując IF do oceny wpływu klinicznie dostępnego leku na linie komórkowe BE w nadziei na nakreślenie możliwego leczenia chemoprewencyjnego i biomarkera leczenia farmakologicznego7. Podobnie, zastosowanie tych technik w EAC, BE i unieśmiertelnionych liniach komórkowych przełyku nakreśliło krytyczne wyniki dotyczące progresji BE do EAC8-10. Stwierdziliśmy, że analiza IF komórek BE leczonych terapiami celowanymi ma wartość, pozwalając na scharakteryzowanie zmian w strukturze komórki i lokalizacji białek. W tym miejscu przedstawiamy nasze metody IF unieśmiertelnionych komórek BE w celu scharakteryzowania leczenia farmakologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Utrzymanie linii komórkowej

  1. Unieśmiertelnione ludzkie linie komórkowe dysplastyczne (CP-B, CP-C, CP-D) i metaplastyczne (CP-A) ludzkiego BE przez stabilną transfekcję ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy (TERT)11.
  2. Utrzymuj linie komórkowe BE w pożywkach keratynocytowych uzupełnionych bydlęcym ekstraktem z przysadki mózgowej (BPE), naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aminokwasami endogennymi (NEAA), penicyliną-streptomycyną-neomycyną (PSN) i standardowymi warunkami hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2, 98% wilgotności).

2. Poszycie komórek BE

  1. Przygotowanie 12-dołkowej płytki/szkiełek nakrywkowych. Umieść szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w szklanej szalce Petriego i w autoklawie. Przenieść autoklawowane szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 18 mm do 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych za pomocą sterylnej szklanej pipety podłączonej do rurki próżniowej. Umyj szkiełko nakrywkowe sterylnym PBS i pożywką.
  2. Trypsynizuj i policz unieśmiertelnione komórki BE. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Rozcieńczyć komórki w pożywce hodowlanej do stężenia 20 000-40 000 komórek/ml.
  3. Umieścić 1 ml komórek w każdym dołku zawierającym szkiełko nakrywkowe, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek 20 000-40 000 komórek/studzienkę.
  4. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do dna studzienki, aby upewnić się, że komórki przyczepią się do szkiełka nakrywkowego.

3. Leczenie farmakologiczne komórek BE

  1. Rozcieńczyć wybrany lek w ciepłym (37 °C) podłożu do pożądanego stężenia i dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę lub używając mieszalnika wirowego. Określono empirycznie stężenia leków. Zabieg należy rozpocząć 24 godziny po początkowym wysiewie komórek BE, aby umożliwić przyczepienie się komórek do szkiełka nakrywkowego
  2. Dla porównania i kontroli, potraktuj dodatkowe szkiełko nakrywkowe komórek BE 0,1% nośnikiem (dimetylosulfotlenek [DMSO] lub środek stosowany do rozpuszczania związku) rozcieńczonym w pożywkach hodowlanych. Tabliczka znamionowa ze długopisem laboratoryjnym do identyfikacji próbek poddanych działaniu narkotyków i nośników. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 °C, 5% CO2, 98% wilgotności i inkubuj do żądanych punktów czasowych.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Utrwalenie
    1. Po pożądanym czasie inkubacji leczenia farmakologicznego, odessać pożywkę i szybko zmyć szkiełka nakrywkowe 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C).
    2. Odessać PBS i dodać 1 ml PBS zawierającego 4% PFA [4% PFA/PBS] do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Odessać 4% PFA/PBS i umyć szkiełka nakrywkowe 3 razy po 5 minut za pomocą PBS w temperaturze RT. W razie potrzeby przechowuj szkiełka nakrywkowe przez tydzień w PBS/0,1% PFA w temperaturze 4 °C.
  2. Przepuszczalność/Blokowanie
    Permeabilizuj utrwalone komórki PFA, aby umożliwić przeciwciału dostęp do celów wewnątrzkomórkowych. W przypadku zewnątrzkomórkowych białek powierzchniowych należy wykonać wszystkie kolejne kroki bez saponiny dodanej do 1x PBS/0,5% roztworu BSA.
    1. Zredukować tło przez inkubację z 50 mM NH4Cl rozcieńczonym w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przemywać RT PBS raz przez 5 minut.
    2. Inkubować komórki BE przez 30 minut w 100-300 μl PBS zawierającego 0,1% saponiny i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Rozcieńczyć saponinę z wysterylizowanego przez filtr 10% bulionu, przygotować w wodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zapobiega to niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z białkami komórkowymi poprzez blokowanie szkiełek nakrywkowych dzięki dodatkowi 0,5% BSA. Alternatywnie, zastąp BSA kozim surowicą rozcieńczoną do 5%, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
  3. Przygotowanie komory dla ludzi
    1. Przygotuj kwadratowe naczynie do testów biologicznych, układając dno komory mokrymi ręcznikami papierowymi i umieść warstwę Parafilmu na wierzchu.
    2. Delikatnie przenieść szkiełka nakrywkowe, komórkami skierowanymi do góry, na Parafilm za pomocą kleszczy i igły strzykawkowej.
    3. Oznacz Parafilm pisakiem laboratoryjnym, aby zidentyfikować szkiełka nakrywkowe.
  4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w PBS zawierające zarówno 0,5% BSA, jak i 0,1% saponiny.
    2. Delikatnie zetrzyj roztwór blokujący za pomocą tkanki laboratoryjnej i dodaj 100 μl roztworu przeciwciała pierwotnego. Inkubować pierwszorzędowe przeciwciało na komórkach BE przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
    1. Umyj szkiełka 3x PBS/0,5% BSA/0,1% saponiny przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone ze znacznikiem fluorescencyjnym w PBS / 0,5% BSA / 0,1% saponinie, aby przeciwciało drugorzędowe rozpoznało gatunek, w którym wyhodowano przeciwciało pierwszorzędowe.
    3. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Mycie i montaż szkiełek nakrywkowych
    1. Szkiełka nakrywkowe należy myć 3 razy po 5 minut w PBS/0,5% BSA/0,1% saponinie. Usunąć bufor do płukania i dodać 100-300 μl PBS do szkiełek nakrywkowych.
      UWAGA: W przypadku barwienia podwójnymi przeciwciałami powtórz kroki 4.4-4.5 z pożądanym dodatkowym przeciwciałem pierwszorzędowym i drugorzędowym, zgodnie z informacjami przedstawionymi w dyskusji.
    2. Za pomocą kleszczy delikatnie podnieś szkiełko nakrywkowe i zetrzyj PBS za pomocą laboratoryjnej chusteczki higienicznej lub ręcznika papierowego.
    3. Dodać 15 μl odpowiedniego podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu zawierającego 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) do szkiełka nakrywkowego i odwrócić szkiełko nakrywkowe, komórkami w dół, na szklane szkiełko mikroskopowe.
    4. Umieść szkiełka w folderze na szkiełka i inkubuj z dala od bezpośredniego światła przez noc w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utwardzenie twardego podłoża zapobiegającego blaknięciu, zgodnie z instrukcjami producenta. Po ustawieniu podłoża zapobiegającego blaknięciu szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do czasu wizualizacji mikroskopowej.

5. Mikroskopowa wizualizacja szkiełek nakrywkowych

Barwione komórki mogą być obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopu pionowego z możliwością IF. Chociaż mikroskopia konfokalna zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości na dyskretnych głębokościach, mikroskopia pionowa jest w stanie szybciej uzyskać użyteczne obrazy. Dla zwięzłości przedstawiono metodę obrazowania barwionych komórek BE przy użyciu standardowej mikroskopii. Ogólnie rzecz biorąc, do zobrazowania izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub podobnych fluoroforów (tj. białka zielonej fluorescencji), Texas Red i DAPI, potrzebny jest mikroskop z filtrami zdolnymi do rozróżniania tych fluoroforów. Sprawdź mikroskop przed rozpoczęciem protokołu, aby określić kompatybilne fluorofory.

  1. Obrazowanie pod standardowym mikroskopem IF
    1. Wyjąć przechowywane szkiełka/szkiełka nakrywkowe z temperatury -20 °C lub 4 °C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. Włącz mikroskop i rtęciową lampę łukową.
    2. Umieść szkiełko mikroskopowe ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu na stoliku mikroskopu. Aby użyć obiektywu immersyjnego z olejkiem, dodaj kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe.
    3. Wybierz filtr DAPI i otwórz migawkę.
    4. Ustaw ostrość obiektywu, patrząc przez okulary, aż pojawi się obraz. Ponieważ wszystkie komórki będą barwić się DAPI, jądra powinny być łatwe do zaobserwowania.
    5. Zbieraj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład wyników uzyskanych po zastosowaniu opisanych procedur przedstawiono na rycinach 1A-D. Szkiełka podstawowe z komórkami BE CP-D i CP-C poddano 24-godzinnej inkubacji z 1 μM inhibitorem rodziny Src, SKI-606, lub nośnikiem (DMSO), a następnie zabarwiono zgodnie z powyższymi procedurami na białko połączeń przylegających i szlaku sygnałowego Wnt, β-catenin. Wizualizację β-catenin osiągnięto poprzez znakowanie przeciwciałem anty-rabbit IgG sprzężonym z zielonym fluorophorem, natomiast jądra komórkowe z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy metodę zastosowania IF komórek BE w celu wyjaśnienia fizjologicznych skutków terapii celowanych na te komórki. Chociaż opisaliśmy zastosowanie tych procedur w stosunku do komórek BE, stwierdziliśmy, że metody te mają również zastosowanie do wielu różnych typów komórek13,17,18. Co więcej, procedury te można zmienić na kilka sposobów, aby zoptymalizować barwienie dla określonych celów.

Znajdujemy jeden z parametrów, który ma bezpośredni wpływ na prawidłowe IF, jest wyb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z St, Joseph's Foundation (AJF, LJI) i American Lung Association, RG-224607-N (LJI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CP-A (linia komórek metaplastycznych)ATCCCRL-4027
CP-B (linia komórek dysplastycznych wysokiego stopnia)ATCCCRL-4028
CP-C (linia komórek dysplastycznych wysokiego stopnia)ATCCCRL-4029
CP-D (linia komórkowa wysokiego stopnia dysplastyczna)ATCCCRL-4030
Keratynocyte-SFM (1x),Liquid Life Technologies17005-042
0,25% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowa Life Technologies25200056
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, HILife Technologies10438026
Mieszanina antybiotyków PSNLife Technologies15640
PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies10010049
Pro-long Gold Anti-fade z DAPI Life TechnologiesP36931
Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe 18 mmFisher Scientific15-183-86
β-katenina Przeciwciało pierwotne (królik)Sygnalizacja komórkowa9562S
Alexa Fluor 488 (koza anty-królik)Life TechnologiesA11008
10 cm naczynie PS poddane obróbce TC, sterylneUSA ScientificCC7682-3394
12-dołkowa płytka PS poddana działaniu TC, sterylnaUSA Scientific5666-5180
DMSOSigma-Aldrich276855
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Chlorek amonuSigma-AldrichA9434
SaponinaSigma-Aldrich47036
Albumina surowicy bydlęcej - frakcja VSigma-Aldrich85040C
SKI-606 (Bosutinib)Selleck ChemicalsS1014
Kwadratowe naczynie do testów biologicznych Thermo Scientific240835
Parafilm VWR82024-546
Jednorazowe pipety Pasteura, szkło krzemienneVWR14672-380
Nexcelom Mini licznik komórekKomory liczące celometr Nexcelom Nexcelom
CHT4-SD100-014
Mikroskop Zeiss Apotome Zeiss

Bibliografia

  1. Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
  2. Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
  3. Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
  4. Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
  5. Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
  6. Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
  7. Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
  8. Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
  9. Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461(2011).
  10. Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
  11. Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
  12. Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
  13. Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
  14. Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
  15. Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
  16. Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
  17. Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
  18. Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki prze yku Barrettabarwienie immunofluorescencyjnelokalizacja bia ekmikroskopia fluorescencyjnaanaliza struktury kom rkowejefekty dzia ania lek winkubacja z przeciwcia em pierwotnymkoniugacja przeciwcia a wt rnegoutrwalanie fiksacyjneprzygotowanie szkie ka nakrywki
Immunofluorescencyjna metoda charakteryzacji komórek przełyku Barretta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.