Artykuł metodologiczny

Immunofluorescencyjna metoda charakteryzacji komórek przełyku Barretta

DOI:

10.3791/51741

⸱

20 lipca 2014

 ,  , 
1Center for Thoracic Disease and Transplantation, Heart and Lung Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wyraźna potrzeba poprawy informacji na temat molekularnych czynników napędzających przełyk Barretta. Barwienie immunofluorescencyjne jest przydatną techniką do zrozumienia wpływu sygnalizacji komórkowej na morfologię komórki. Przedstawiamy prosty, skuteczny protokół stosowania barwienia immunofluorescencyjnego do oceny leczenia terapeutycznego w komórkach przełyku Barretta.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczolakorak przełyku (EAC) ma ogólny wskaźnik przeżycia mniejszy niż 17%, a częstość występowania EAC dramatycznie wzrosła w ciągu ostatnich dwóch dekad. Jednym z głównych czynników ryzyka EAC jest przełyk Barretta (BE), metaplastyczna zmiana normalnego przełyku płaskonabłonkowego w odpowiedzi na przewlekłą zgagę. Pomimo dobrze ugruntowanego związku między EAC i BE, badanie zdarzeń molekularnych, w szczególności zmienionych szlaków sygnałowych obejmujących progresję BE do EAC, jest słabo poznane. W dużej mierze wynika to z braku odpowiednich modeli in vitro do badania tych chorób. Ostatnio unieśmiertelnione linie komórkowe BE stały się dostępne komercyjnie, co pozwala na badania in vitro BE. W niniejszej pracy przedstawiono metodę barwienia immunofluorescencyjnego unieśmiertelnionych linii komórkowych BE, pozwalającą na scharakteryzowanie in vitro sygnalizacji i struktury komórki po ekspozycji na związki terapeutyczne. Zastosowanie tych technik pomoże w uzyskaniu wglądu w mechanizmy związane z progresją BE do EAC i zapewni potencjalne możliwości leczenia i zapobiegania EAC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przełyk Barretta (BE) jest metaplastyczną zmianą w normalnym nabłonku płaskonabłonkowym przełyku i konsekwencją przewlekłej ekspozycji na treść żołądkową wynikającą z choroby refluksowej przełyku (GERD)1. Uważa się, że BE jest mechanizmem ochronnym w odpowiedzi na GERD, jednak obecność BE zwiększa ryzyko gruczolakoraka przełyku (EAC), choroby, która wiąże się ze znacznie słabym przeżyciem1. Obecne szacunki sugerują, że do 5,6% populacji amerykańskiej ma BE, jednak ponieważ BE często przebiega bezobjawowo, uważa się, że większość BE pozostajeniezdiagnozowana2. Ponieważ wskaźniki zapadalności zarówno na GERD, jak i EAC stale rosną3<....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie linii komórkowej

  1. Unieśmiertelnione ludzkie linie komórkowe dysplastyczne (CP-B, CP-C, CP-D) i metaplastyczne (CP-A) ludzkiego BE przez stabilną transfekcję ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy (TERT)11.
  2. Utrzymuj linie komórkowe BE w pożywkach keratynocytowych uzupełnionych bydlęcym ekstraktem z przysadki mózgowej (BPE), naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aminokwasami endogennymi (NEAA), penicyliną-streptomycyną-neomycyną (PSN) i standardowymi warunkami hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2, 98% wilgotności).

2. Poszycie komórek BE<....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład wyników uzyskanych dzięki zastosowaniu opisanych procedur jest zilustrowany na rysunkach 1A-D. Szkiełka nakrywkowe z komórkami CP-D i CP-C BE traktowano przez 24 godziny 1 μM inhibitora rodziny Src, SKI-606 lub nośnika (DMSO) i barwiono przy użyciu powyższych procedur dla połączenia Adherens i białka sygnalizacyjnego Wnt, β-kateniny. Wizualizację β-kateniny uzyskano poprzez znakowanie anty-króliczą IgG sprzężoną z zielonym fluoroforem, podczas gdy znakowanie jądra komórkowego osiągnięto przez zn.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy metodę zastosowania IF komórek BE w celu wyjaśnienia fizjologicznych skutków terapii celowanych na te komórki. Chociaż opisaliśmy zastosowanie tych procedur w stosunku do komórek BE, stwierdziliśmy, że metody te mają również zastosowanie do wielu różnych typów komórek13,17,18. Co więcej, procedury te można zmienić na kilka sposobów, aby zoptymalizować barwienie dla określonych celów.

Znajdujemy jeden z parametrów, który ma bezpośredni wpływ na prawidłowe IF, jest wyb.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z St, Joseph's Foundation (AJF, LJI) i American Lung Association, RG-224607-N (LJI).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CP-A (linia komórek metaplastycznych)ATCCCRL-4027
CP-B (linia komórek dysplastycznych wysokiego stopnia)ATCCCRL-4028
CP-C (linia komórek dysplastycznych wysokiego stopnia)ATCCCRL-4029
CP-D (linia komórkowa wysokiego stopnia dysplastyczna)ATCCCRL-4030
Keratynocyte-SFM (1x),Liquid Life Technologies17005-042
0,25% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowa Life Technologies25200056
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, HILife Technologies10438026
Mieszanina antybiotyków PSNLife Technologies15640
PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies10010049
Pro-long Gold Anti-fade z DAPI Life TechnologiesP36931
Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe 18 mmFisher Scientific15-183-86
β-katenina Przeciwciało pierwotne (królik)Sygnalizacja komórkowa9562S
Alexa Fluor 488 (koza anty-królik)Life TechnologiesA11008
10 cm naczynie PS poddane obróbce TC, sterylneUSA ScientificCC7682-3394
12-dołkowa płytka PS poddana działaniu TC, sterylnaUSA Scientific5666-5180
DMSOSigma-Aldrich276855
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Chlorek amonuSigma-AldrichA9434
SaponinaSigma-Aldrich47036
Albumina surowicy bydlęcej - frakcja VSigma-Aldrich85040C
SKI-606 (Bosutinib)Selleck ChemicalsS1014
Kwadratowe naczynie do testów biologicznych Thermo Scientific240835
Parafilm VWR82024-546
Jednorazowe pipety Pasteura, szkło krzemienneVWR14672-380
Nexcelom Mini licznik komórekKomory liczące celometr Nexcelom Nexcelom
CHT4-SD100-014
Mikroskop Zeiss Apotome Zeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
  2. Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki prze yku Barrettabarwienie immunofluorescencyjnelokalizacja bia ekmikroskopia fluorescencyjnaanaliza struktury kom rkowejefekty dzia ania lek winkubacja z przeciwcia em pierwotnymkoniugacja przeciwcia a wt rnegoutrwalanie fiksacyjneprzygotowanie szkie ka nakrywki

Powiązane artykuły