Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Summary

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Abstract

Zarówno u ssaków, jak i owadów, informacje neuronalne są przetwarzane w różnych ośrodkach mózgowych wyższego i niższego rzędu. Centra te są sprzężone za pomocą zbieżnych i rozbieżnych połączeń anatomicznych, w tym okablowania sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego. Co więcej, informacje tego samego pochodzenia są częściowo przesyłane równoległymi ścieżkami do różnych, a czasem do tych samych obszarów mózgu. Aby zrozumieć ewolucyjne korzyści, jak również obliczeniowe zalety tych strategii okablowania, a zwłaszcza ich czasowe zależności od siebie, konieczny jest jednoczesny dostęp do pojedynczych neuronów różnych dróg lub neurostosów w tym samym preparacie w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj koncentrujemy się na pszczołach miodnych, demonstrując unikalny zewnątrzkomórkowy długoterminowy dostęp do rejestrowania aktywności wielu jednostek w dwóch kolejnych neurostosach¹, płacie antenowym (AL), pierwszym etapie przetwarzania węchowego i ciele grzyba (MB), centrum integracji wyższego rzędu zaangażowanym w uczenie się i tworzenie pamięci, lub dwóch równoległych szlakach neuronalnych² połączenie AL z MB. Ten ostatni został wybrany jako przykład i zostanie w pełni opisany. Na filmie instruktażowym zademonstrowano budowę i trwałe wprowadzenie elastycznych wielokanałowych drutów elektrodowych. Różnicowe wzmocnienie parami kanałów elektrod mikrodrutowych drastycznie zmniejsza szum i sprawdza, czy źródło sygnału jest ściśle związane z położeniem końcówki elektrody. Elastyczność mechaniczna zastosowanych elektrod drucianych pozwala na stabilne, inwazyjne, długotrwałe zapisy przez wiele godzin do kilku dni, co stanowi wyraźną zaletę w porównaniu z konwencjonalnymi technikami poza- i wewnątrzkomórkowego zapisu in vivo.

Introduction

Pszczoły miodne, podobnie jak większość innych owadów, w dużym stopniu polegają na węchu. Między innymi wykorzystują wskazówki węchowe do orientacji, krycia, komunikacji z przedstawicielami tego samego gatunku i żerowania. Ich dobrze opracowany układ węchowy przyczynia się do bogatego repertuaru zachowań edukacyjnych związanych z bodźcami zapachowymi kwiatów. Zachowania te można łatwo badać w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (przegląd patrz^3-5). Ich "mini mózgi" (^cp.6) ze stosunkowo niewielką liczbą neuronów sprawiają, że pszczoła miodna jest dobrze przystosowanym organizmem modelowym do badania kodowania węchowego i uczenia się podczas monitorowania aktywności neuronalnej.

System węchowy zarówno u owadów, jak i u ssaków wykazuje analogiczną organizację w dużym stopniu (dla przeglądu patrz^7,8). U pszczół miodnych około 80 000 neuronów receptorowych⁹ zlokalizowanych w czubkach wzdłuż czułków^10,11 przekształca bodziec zapachowy w sygnał neuronalny. Aksony z neuronów receptorów węchowych unerwiają płat czułkowy (AL), który ma organizację kłębuszkową porównywalną z opuszką węchową kręgowców. AL składa się z około 164 kłębuszków nerkowych połączonych ze sobą około 4000 lokalnych interneuronów (LN) (przegląd patrz¹²). Szczególnie w przypadku pszczół miodnych wykazano niedawno, że LN zapewniają niejednolitą łączność boczną i że różne subpopulacje posiadają elementarne i konfiguracyjne właściwości kodowania węchowego^13,14 . Wykazano, że AL jest podzielony na brzuszny i grzbietowy płat hemi, dając początek przyśrodkowej i bocznej drodze płata czułkowego (m- i l-ALT; wcześniej określane jako m- i l-APT dla przyśrodkowego i bocznego płata czułka protocerebral way^15-17). W tym miejscu zostanie użyta nowa terminologia traktatowa, wprowadzona przez niedawne wysiłki na rzecz ujednolicenia nomenklatury mózgu owadów¹⁸. Oba ALT (l- i m-ALT) łączą 410 (l-ALT) lub 510 (m-ALT) neuronów projekcyjnych (PN) jednokłębuszkowych, odpowiednio^15,16,19. Ostatnio wykazano, że PN obu szlaków kodują zapachy równolegle² (dla przeglądu patrz^17,20), a oba szlaki synaptycznie tworzą rozbieżne połączenia z komórkami Kenyona (KC), głównymi neuronami ciała grzyba (MB). Każdy MB zawiera około 172 000 KC^21-23. Wiadomo, że MB są zaangażowane w integrację bodźców, uczenie się i tworzenie pamięci. Dendryty axo KC tworzą szypułkę (łodygę grzyba), która ma dwa główne obszary wyjściowe: wierzchołek lub płat alfa i płat poziomy lub beta^22,24. Wynik MB zbiega się tylko do około 400 neuronów zewnętrznych (EN)²⁴. EN odpowiedzialne za przetwarzanie informacji węchowych unerwiają głównie brzuszną część płata pionowego²². Ostatnio wykazano, że ENs zarejestrowane w tym obszarze kodują asocjację nagrody za zapach²⁵.

Aspekty czasowe w systemie węchowym owadów i kręgowców stały się ważnym i znaczącym aspektem jako potencjalna zasada kodowania^26-29. Aby móc jednocześnie rejestrować wiele neuronów z różnych miejsc w wysokiej rozdzielczości czasowej, opracowaliśmy techniki podwójnego nagrywania wielojednostkowego przy użyciu niestandardowych wielokanałowych elektrod drucianych wprowadzanych do różnych obszarów docelowych w układzie węchowym pszczoły. Takie podejście pozwala nam analizować i porównywać procesy czasowe w układzie węchowym pszczoły miodnej na poziomie pojedynczych neuronów i populacji neuronów między równoległymi szlakami węchowymi, podwójnym szlakiem węchowym² lub między różnymi kolejnymi neuropilami¹. Niedawno, dzięki podobnemu podejściu eksperymentalnemu w układzie węchowym szarańczy³⁰ przy użyciu innej konfiguracji elektrod, byliśmy w stanie przeanalizować mechanizm kodowania czasoprzestrzennego w celu rozpoznawania zapachów niezmiennych w tle³¹. W ten sposób ustalone podwójne zapisy umożliwiają gromadzenie informacji przestrzennych o jednoczesnych profilach aktywności neuronalnej.

W porównaniu do szerszego próbkowania przestrzennego uzyskanego z obrazowania wapnia, ta metoda pozwala na zapis tylko z dwóch miejsc. Jednak zaletą w porównaniu z technikami obrazowania wapniowego jest wysoka precyzja czasowa zapisów potencjału czynnościowego, której nie można zapewnić ani przez konwencjonalne obrazowanie CCD, ani przez akwizycję obrazowania 2-fotonowego. Opisane tutaj elektrody zewnątrzkomórkowe są na stałe wszczepione i zamocowane względem mózgu i torebki głowy, unikając dryfu elektrody. Jest to wyraźna zaleta w porównaniu z zastosowaniem ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych. Kolejną zaletą w porównaniu z zapisami wewnątrzkomórkowymi i obrazowaniem wapnia jest wydłużony czas obserwacji neuronalnej, wynoszący od wielu godzin do kilku dni. Jest to ważny warunek wstępny do zbadania neuronalnych korelatów uczenia się i tworzenia pamięci. Dodatkowe korzyści płynące z nagrań wielostanowiskowych są bardziej szczegółowo opisane w sekcji dyskusji.

W tym przeglądzie metodologicznym zostanie pokazana procedura produkcji elektrod drucianych o niestandardowych projektach, dostosowana z^32,33 i dostosowana do długoterminowych zapisów wielojednostkowych w mózgu pszczoły miodnej. Dodatkowo^pokazano przykład, w jaki sposób tego typu elektrody są na stałe wszczepiane w dwóch różnych miejscach zapisu w układzie węchowym pszczoły miodnej, aby rejestrować jednocześnie l- i m-ALT przez długi czas, aby umożliwić wiele protokołów stymulacji. W celu weryfikacji pozycji zapisu podano przykład i protokół barwienia oraz wizualizacji miejsc rejestracji po nagraniu.

Protocol

1. Budynek elektrody (Rysunek 1)

1. Produkcja adaptera elektrody pasującego do płytki interfejsu elektrody komercyjnych wielokanałowych systemów wzmacniaczy^1,2,25.
   1. Użyj małej płytki z pleksiglasu przyklejonej do 18-pinowej podstawy złącza.
   2. Podłącz podstawę za pomocą 3 krótkich odcinków izolowanego drutu do 3 oddzielnych końcówek lutowniczych przykręconych do płytki z pleksiglasu (Rysunek 1 A1-A3).
   3. Włóż rowek w płytkę z pleksiglasu, w którym szklana kapilara może się łatwo przesuwać i być utrzymywana na miejscu za pomocą (Rysunek 1 B1).
   4. Przedłuż szklaną kapilarnę o około 5 mm za pomocą szpilki do drobniczka.
   5. Przymocuj druty mikroelektrody wzdłuż maleńkiego kołka i szklanej kapilary, aby zagwarantować stabilizację i wsparcie.
2. Wielokanałowa produkcja mikrodrutów (zaczerpnięta z Ryuichy Okada^32,33)
   1. Rozpięte są 3 mikrodruty (drut miedziany pokryty poliuretanem, średnica 15 μm) w taki sposób, aby były umieszczone obok siebie (Rysunek 1 B2).
   2. Za pomocą igły lutowniczej 12 V częściowo rozprowadź cienką warstwę niskotopliwego wosku dentystycznego (50 °C) wzdłuż drutów, aby je skleić (końcówka elektrody) (Rysunek 1 B3). Pozostaw kilka centymetrów nieprzyklejonych (koniec elektrody), ponieważ ta sekcja zostanie później wykorzystana do połączenia mikroprzewodów z adapterem elektrody.
3. Podłącz wielokanałowy mikroprzewód do adaptera elektrody
   1. Wyjmij szklaną kapilarnę z uchwytu i przymocuj ją za pomocą kołka minutien do końcówki elektrody. Ustaw go w pozycji równoległej do mikroelektrody (rysunek 1 B3).
   2. Przyklej końcówkę elektrody do szpilki minutowej za pomocą niskotopliwego wosku dentystycznego i odetnij mikroelektrodę na końcówce, wystającą 2-3 cm z końcówki minuty i na końcu elektrody (małe strzałki Rysunek 1 B3).
   3. Lekko wsuń kapilarę z powrotem do adaptera elektrody. Użyj, aby go zamocować (Rysunek 1 B4).
   4. luźne końce trzech przewodów do końcówek lutowniczych za pomocą pistoletu lutowniczego o temperaturze około 360 °C, aby zapewnić stopienie izolacji (Rysunek 1 B4). Po należy upewnić się, że jest odpowiedni kontakt elektryczny (~300 kOhm).
   5. Zamontuj jedną z elektrod (master) na płytce interfejsu elektrody sceny głównej i zamocuj drugą elektrodę wielokanałową (podrzędną) na osobnym adapterze. Podłącz kanały urządzenia podrzędnego do elektrody głównej (Rysunek 1 C1). Dodatkowo elektrody odniesienia i mięśniowe do podstawy elektrody głównej (rysunek 1 C2).

2. Przygotowanie pszczół (Rysunek 2)

W tych opisanych eksperymentach używana jest pszczoła miodna (Apis mellifera), która jest zwierzęciem bezkręgowym i dlatego nie wymaga specjalnych etycznych pozwoleń na użycie.

1. Złap zbieraczkę pszczół miodnych (A. mellifera) przy wejściu do ula rano, jak pokazują inni^34,35.
2. Schłodź pszczoły na kruszonym lodzie do momentu unieruchomienia (5 do 10 minut) i zamocuj jedną w standardowym uchwycie z pleksiglasu lub metalowej rurce w taki sposób, aby głowa była odsłonięta (ryc. 2 A). Aby zminimalizować ruchy głowy, użyj niskotopliwego wosku dentystycznego (~50 °C) i ostrożnie przymocuj głowę do uchwytu wokół podstawy oczu złożonych i szyi.
3. Użyj wosku o niskiej temperaturze topnienia, aby przymocować kości szkieletowej czułków do torebki głowy (ryc. 2 B) bez dotykania wici. Wić anteny musi być skierowana do przodu. Upewnij się, że pszczoła może swobodnie poruszać trąbką.
4. Ogol kapsułkę na głowę, aby zapewnić niezakłócony widok i dostęp do czubka głowy.
5. Nakarm pszczołę 30% roztworem sacharozy aż do nasycenia, aby zapewnić wystarczające nawilżenie tkanki mózgowej i dobrą żywotność zwierzęcia (ryc. 2 C).
6. Wykonaj ostrożne nacięcia pionowo wzdłuż granic oczu złożonych i poziomo nad podstawami czułków, a także pod oczkami i usuń poluzowany kawałek naskórka (ryc. 2 D).
7. Ostrożnie odłóż na bok gruczoły podgardłowe i usuń tchawicę, aby zapewnić wyraźny widok i dostęp do mózgu przed wprowadzeniem elektrod (ryc. 2E, 2F).

3. Wprowadzenie elektrody

W przykładowym przypadku zilustrowanym na rysunku 2, jedna elektroda jest skierowana na l-ALT, a druga na m-ALT². Korzystając z określonych punktów orientacyjnych, możliwe są również inne regiony docelowe, na przykład obszary wyjściowe AL i MB¹.

1. Umieść elektrody za pomocą mikromanipulatorów w obszarze zainteresowania (Rysunek 2G i 3A). Aby celować w m-ALT, umieść elektrodę między AL i przyśrodkowo od pionowego płata MB. Upewnij się, że miejsce wprowadzenia znajduje się powyżej punktu rozgałęzienia przyśrodkowych bocznych PN ALT. Wysuń elektrodę do mózgu na głębokość około 180 μm (ryc. 2E). W przypadku zapisu l-ALT PN umieść elektrodę poniżej bocznego protocerebrum (LH) w środku wyimaginowanej linii między boczną stroną płata pionowego a środkiem AL. Wprowadź elektrodę na głębokość około 300 μm (Rysunek 2E)
2. Włóż odniesienie (srebrny drut o średnicy około 25 μm) do ipsilateralnego oka złożonego przez małe nacięcie w naskórku. Włóż kolejny srebrny drut do obszaru projekcji mięśni poniżej bocznej oczki. UWAGA: W razie potrzeby zachowanie pszczół w zakresie uczenia się może być monitorowane z dużą precyzją czasową, rejestrując mięsień M17, który bierze udział w odpowiedzi na wydłużenie trąbki (PER) pszczoły³⁶, jak opisano w²⁵.
3. Aby solidnie zakotwiczyć elektrody w mózgu i torebce głowy, przykryj całą przestrzeń nad mózgiem dwuskładnikowym krzemem (ryc. 2H), co zapobiegnie wysychaniu mózgu. UWAGA: nagrania mogą trwać od wielu godzin do kilku dni, a pszczoły mogą być na przykład rejestrowane podczas klasycznej procedury kondycjonowania (ryc. 2H) lub stymulowane dużym panelem różnych zapachów.

4. Akwizycja danych i wstępne przetwarzanie

1. Użyj odpowiedniego oprogramowania do akwizycji, które spełnia następujące wymagania: częstotliwość próbkowania min 25 kHz; analogowe^1,25 lub cyfrowe 2 różnicowanie krzyżowe między kanałami elektrod; filtr pasmowo-przepustowy od 300 Hz do 8 000 Hz w celu wyodrębnienia zdarzeń skokowych.
2. Użyj dostępnego oprogramowania do sortowania spajków, aby wyodrębnić aktywność pojedynczej jednostki, na przykład techniki dopasowywania szablonów zawarte w oprogramowaniu Spike2 (Rysunek 3).
3. Do dalszej analizy należy wykorzystać znaczniki czasu wyodrębnionych jednostek do obliczenia uśrednionych reakcji na zapach pojedynczej jednostki (rysunek 4) lub do obliczenia wektorów populacji do analizy głównych składowych (PCA) (rysunek 5) przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania. Aby dokładniej przeanalizować opóźnienie odpowiedzi pojedynczej jednostki i populacji, porównaj najnowsze publikacje^1,2,25.

5. Wizualizacja względnej pozycji elektrody (Rysunek 4)

1. Zanurz końcówki elektrod w roztworze 5% hydrazydu Alexa 568 lub 5% hydrazydu Alexa 488, który rozpuszcza się w 0,5 M roztworze chlorku potasu przed eksperymentami rejestracyjnymi.
2. Po eksperymentach ostrożnie usunąć elektrody i pokrywający je krzem, przepłukać mózg roztworem Ringera pszczelego, usunąć gruczoły i tchawicę i wprowadzić drobne kryształki dekstranu tetrametylorhodaminy lub wprowadzić 5% roztwór rozpuszczony w 1,0 M octanie potasu do AL, aby oznaczyć ALT w kierunku następczym. Wykonaj następujące czynności w ciemności.
3. Pozwól, aby barwnik został pobrany i przetransportowany przez neurony projekcyjne wzdłuż ich dróg aksonalnych (30-45 min) (ryc. 4A), a następnie umyj mózg roztworem Ringera pszczół trzy razy przez kolejne 30-45 minut.
4. Schłodź pszczołę na lodzie do momentu unieruchomienia i ostrożnie wyjmij mózg z torebki głowy. Utrwalić mózg, płucząc go w 0,1 M roztworze PBS zawierającym 4% formaldehydu i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Odczekaj co najmniej 12 godzin przed dwukrotnym umyciem mózgu w 0,1 M PBS (10 minut każdy).
6. Myj mózg 3x przez 20 minut w 0,2% Triton X-100 rozcieńczonym w 0,1 M PBS przed odwodnieniem w serii alkoholi rosnących (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% etanolu, 20 min każdy krok).
7. Osadź odwodniony mózg w salicylanie metylu na szkiełku mikroskopowym i uszczelnij go szkiełkiem nakrywkowym.
8. Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i skanuj mózg jako wycinki optyczne co 2-5 μm za pomocą obiektywu apochromatycznego Harmonic Compound Plan (zanurzenie 10X 0,4 NA). Wzbudzić tkankę za pomocą długości fali 568 nm dla dekstranu tetrametylorrodaminy i długości fali 488 nm dla położenia elektrody.
9. Zrekonstruuj poplamione struktury mózgu i ścieżki elektrod ze stosów obrazów w 3D za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji (np. AMIRA lub Fidżi) (Rysunek 4).

Results

"Obecny protokół pozwala na jednoczesne zapisy na dwóch różnych etapach przetwarzania u poszczególnych pszczół miodnych i dodatkowo pozwala na testowanie podstawowych mechanizmów uczenia się i pamięci, np. poprzez warunkowanie PER u ograniczonych pszczół miodnych." Jest to warunek wstępny do analizy czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego. Metodę tę można łatwo dostosować do różnych podejść naukowych w celu rozwikłania sieci neuronalnej układu węchowego pszczoły. Na przykład metoda ta jest stosowana (i) do analizy czasowego przetwarzania PN w podwójnym szlaku węchowym pszczoły miodnej, PN l- i m-ALT (ryc. 5). Na rysunku 5A jeden przykład PN l-ALT zarejestrowanego jednocześnie z PN m-ALT jest podany jako średnia z dziesięciu prób i ilustruje ich siłę odpowiedzi i opóźnienie w odniesieniu do pięciu różnych stężeń zapachu jako kolorowy wykres cieplny. Średnio u siedmiu pszczół z 11 l- i 13 m-ALT PN (ryc. 5B, 5C) pokazuje, że zarówno siła odpowiedzi, jak i opóźnienie odpowiedzi w pewnym stopniu odzwierciedlają stężenie substancji zapachowej. W ten sposób PN w tym przykładzie zwiększają swoją siłę odpowiedzi, podczas gdy wraz ze wzrostem stężenia nawania ich opóźnienie odpowiedzi spada (ryc. 5B, 5C). Wynik ten jest raczej ograniczony i ważny tylko dla analizowanego nawaniacza, ale nadal jest zgodny z najnowszymi modelami obliczeniowymi AL³⁷. To, czy kodowanie stężenia zapachu w AL pszczoły leży u podstaw obliczeń nieliniowych, czy też leży u podstaw innych właściwości kodowania, nadal wymaga analizy w przyszłości. Ponadto metoda ta może być wykorzystana (ii) do porównania aspektów czasowych aktywności populacji na dwóch kolejnych etapach przetwarzania, AL i MB (Rysunek 6). Analiza głównych składowych (PCA) pokazuje, że obliczanie zapachu jest przedłużone i trwa dłużej niż cała prezentacja zapachu na poziomie PN, podczas gdy w EN tylko zapach włączony i przesunięty był reprezentowany w aktywności populacji (rysunek 6). W ten sposób populacja EN osiągnęła swoją maksymalną aktywność już w momencie, gdy aktywność PN wciąż się rozwija (por. film 1).

Rysunek 1. Produkcja trójkanałowych elektrod mikrodrutowych.A1) Zakończenia trzech przewodów są przylutowane do złącza pinowego IC w pozycjach 11, 13 i 16. A2) Cztery końcówki lutownicze są przykręcone do plastikowej płyty podstawy z pleksiglasu; Maleńki szpilka jest wkładana w końcówkę szklanej kapilary, która jest następnie przymocowana do plastikowej płytki. A3) Plastikowa płytka jest przyklejona na górze złącza pinowego IC, a wolny koniec każdego przewodu jest przylutowany do jednego z górnych końcówek lutowniczych. B1) Aby wyposażyć uchwyt elektrody w cienkie druty miedziane, kapilar musi zostać ponownie wyjęty. B2) Podstawa uchwytu jest następnie mocowana w specjalnie wykonanym urządzeniu wyrównującym. Trzy mikrodruty miedziane są wyrównane wzdłuż rowka i przymocowane taśmą klejącą na każdym końcu. Klasa B3) Równoległe mikrodruty są sklejane ze sobą woskiem dentystycznym, a kapilara jest umieszczana z powrotem na miejscu (długie strzałki); Sklejone mikrodruty są następnie mocowane do kapilary za pomocą wosku dentystycznego, a jej końce są odcinane (krótkie strzałki). B4) Trzy luźne końce przewodów miedzianych są przylutowane do trzech górnych końcówek lutowniczych, dzięki czemu stykają się elektrycznie ze złączem pinowym układu scalonego. C1) Dwie w pełni zmontowane elektrody można połączyć ze sobą w celu użycia z jednym stopniem głównym. C2) W tym celu kołki jednej elektrody (lewej, podrzędnej) są połączone izolowanymi przewodami z drugą elektrodą (prawą, główną), która jest podłączona do stopnia głównego; elektroda podłączona do sceny czołowej może również zbierać dane wejściowe z mięśnia (M17) i elektrody odniesienia (Ref).

Ryc. 2. Przygotowanie i stałe wprowadzenie elektrody do mózgu pszczoły.A) Pszczołę wkłada się do uchwytu z pleksiglasu po unieruchomieniu na lodzie. Wskazywane są czułki z wicią (FL) i łopatką (SC). B) Głowa i czułki są mocowane za pomocą wosku dentystycznego. C) Torebka na głowę jest ogolona, a pszczoła karmiona jest wodą z cukrem. D) Kapsuła na głowę jest otwarta. E) Po usunięciu gruczołów i tchawicy z górnej części mózgu, można łatwo rozróżnić różne neuropile i główne punkty orientacyjne. Trajektorie ALT są oznaczone oznaczeniem, w którym włożone są elektrody. (MB: Korpus grzyba, AL: Płat anteny, OL: Płat optyczny, α: Płat alfa lub płat pionowy, ALT: przewód płata antenowego, E1: strona wprowadzania elektrody do zapisów m-ALT, E2: strona wprowadzania elektrody do zapisów l-ALT). F) Elektrody referencyjne (Ref) i mięśniowe (M17) wprowadza się do torebki głowy przez małe otwory w naskórku lub oku złożonym. G) Druty elektrodowe są wprowadzane do mózgu w odpowiednich miejscach. H) Po zamocowaniu elektrod na miejscu za pomocą dwuskładnikowego krzemu, pszczoła nadal pokazuje PER i może być kondycjonowana (np. za pomocą wody z cukrem).

Ryc. 3. Zapis zewnątrzkomórkowy w dwóch drogach nerwowych i ekstrakcja pojedynczej jednostki (sortowanie kolców). A) Schematyczny rysunek układu eksperymentalnego. Pszczoła jest utrwalona w uchwycie z pleksi. Stymulacja zapachu odbywa się za pomocą szklanej rurki. Dwa trzonki elektrod rejestrują obraz z odsłoniętego mózgu pszczoły. B) Równoczesne zapisy z pn l- i m-ALT (ślady zielone i fioletowe) wykazujące reakcje pobudzające na obu drogach na stymulację zapachową miodu w roztworze wodnym o stężeniu 1:100 w temperaturze 33 °C o stężeniu 500 ms. Każda wykreślona linia reprezentuje zróżnicowane kanały jako kolorową etykietę z końcówek lutowniczych elektrod w A. Bar: 50 μV. C) Po procedurach sortowania impulsów pojedyncze potencjały czynnościowe są sortowane i kodowane kolorami. Nakładanie posortowanych jednostek obrazuje separację przebiegów. D) Histogram interwału spajków wskazuje jakość separacji posortowanych jednostek jako dowód odpowiedniego sortowania spajków. Należy pamiętać, że w okresie refrakcji urządzenia nie ma skoku. E) Dwa widoki (E1, E2) z klastra 3D posortowanej jednostki z analizą głównych składowych, która wskazuje odległość posortowanych jednostek od siebie. Okręgi wskazują 2,5-krotną odległość Mahalanobisa, która przypomina SD w przestrzeni i wskazuje na znaczne zróżnicowanie gromad w przestrzeni składnika głównego: F) Jednostki oznaczone kolorami przedstawiają potencjały czynnościowe widoczne w powiększeniu trzech kanałów z jednego nagrania traktowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Wizualizacja po nagraniu i rekonstrukcja 3D pozycji nagrywania. A) Widok projekcyjny orto-plasterków wzdłuż osi z maksymalnym natężeniem wyrównania antero i wstecznym zasypaniem neuronów projekcyjnych jednokłębuszkowych wystających z AL do MB i LH. Znacznik wewnątrzkomórkowy Microruby (dekstran tetrametylorodaminy) został wprowadzony do AL po eksperymentach rejestracyjnych. Barwione kłębuszki nerkowe wewnątrz AL potwierdzają prawidłowe barwienie PN. B) Widok projekcyjny warstw orto wzdłuż osi z maksymalnym wyrównaniem intensywności z barwienia dwóch elektrod hydrazydem Alexa 488 wskazującym położenie elektrod dla m-ALT (E1, strzałka) i l-ALT (E2, strzałka). Znacznik Alexa Hydrazide 488 migruje do tkanki otaczającej elektrodę i barwi miejsce wprowadzenia elektrody. Zauważ, że wyraźne zabarwienie w AL jest powierzchownym artefaktem. C) Rekonstrukcje 3D wybarwionych komórek docelowych (PN) i miejsca wprowadzenia elektrody od strony A,B (prawa strona) wraz ze schematycznym przeglądem układu węchowego pszczoły miodnej (lewa strona) ze wskazaniem trajektorii l- i m-ALT. Należy zauważyć, że pokazane są tylko jednokłębuszkowe odcinki PN. AN: nerw czułkowy, AL: płat czułkowy, LH: róg boczny, MB: ciało grzyba, E1,E2: miejsca wprowadzenia elektrody, m-ALT: przyśrodkowy płat czułkowy drogi, l-ALT: boczny płat czułkowy, c: ogonowy, r: rostralny, m: przyśrodkowy, l: boczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Przykład kodowania stężenia zapachu w obrębie podwójnego szlaku węchowego. A) Wykresy ciepła ilustrują reakcję pojedynczego l-ALT (zielony) i pojedynczego m-ALT PN (fioletowy) uzyskanego jednocześnie od pojedynczej pszczoły miodnej w odpowiedzi na sześciokątny nawaniacz przy rosnących stężeniach zapachu (od 1:^10-6 do 1:100). Każda linia to średnio dziesięć próbnych stymulacji. Szybkość wypalania jest pokazana jako względna zmiana intensywności, która jest szybkością wypalania w stosunku do odjętej spontanicznej aktywności. B) Opóźnienie odpowiedzi populacji wynoszące 11 l- i 13 m-ALT PN od 7 zarejestrowanych pszczół. U każdej pszczoły zarejestrowano jednocześnie PN z obu traktów. Latencja odpowiedzi populacji wykazuje malejące opóźnienie wraz ze wzrostem stężenia zapachu w PN z obu odcinków. Początek reakcji na zapach na antenach po 99 ms został zarejestrowany za pomocą elektroantennogramów i jest odejmowany od opóźnień odpowiedzi PN. Należy zauważyć, że przy najniższych stężeniach odpowiedzi są zbyt słabe do pomiarów opóźnienia i dlatego zostały wykluczone. C) Szybkość wystrzeliwania odpowiedzi populacji z tych samych PN co w B. Wraz ze wzrostem stężenia zapachu wzrasta siła reakcji. l-ALT wykazuje silniejszą siłę reakcji. W B,C podana jest średnia i SD.

Rysunek 6. Porównanie aktywności populacji na dwóch kolejnych etapach przetwarzania wzdłuż szlaku węchowego pszczoły miodnej. Dane zarejestrowano u 20 zwierząt, które stymulowano 1-heksanolem i 2-oktanonem. A) Każda linia reprezentuje fałszywie oznaczoną kolorem średnią szybkość wypalania jednego neuronu projekcyjnego (PN) obliczoną na podstawie 10 powtórzeń zapachu 1-heksanolu. Prezentacja zapachu rozpoczyna się o godzinie 0 i trwa trzy sekundy. B) Pokazuje to samo co w A), ale dla zewnętrznych neuronów ciała grzyba (EN). Matryca pokazana w A) może być postrzegana jako wektor populacji PN podczas stymulacji zapachu 1-heksanolem. Obliczyliśmy ten sam rodzaj wektora populacyjnego podczas stymulacji zapachu za pomocą 2-oktanonu i użyliśmy obu wektorów w analizie głównych składowych (PCA), zachowując wymiar czasowy. C) Pierwsze trzy główne składniki (PC1, 2 i 3) zostały wykreślone względem siebie, aby zilustrować separację zapachów w aktywności zespołu PN na wyjściu płata antenowego. Czas przed pojawieniem się zapachu jest zaznaczony na czarno. Aktywność podczas trzysekundowej stymulacji 1-heksanolem jest pokazana na niebiesko. Aktywność podczas stymulacji 2-oktanolem jest pokazana na czerwono. Ponadto pokazujemy 1,5 sekundy (post) aktywności po zapachu zestawu 1-heksanolu (jasnoniebieski) i 2-oktanonenu (różowy). Należy zauważyć, że na poziomie zespołu PN oba zapachy wywołujące bardzo różne trajektorie osadzają się w "stałym punkcie", który trwa przez cały okres stymulacji zapachowej. Dopiero po kompensacji zapachu trajektorie wracają do podstawowej aktywności bez stymulacji zapachem. D) Tę samą analizę przeprowadzono na poziomie zespołu EN, reprezentującego aktywność na wyjściu korpusu grzyba. W porównaniu z aktywnością PN, zapachy wywołują mniej wyraźną trajektorię. Co więcej, "punkt stały" nie jest obserwowalny. Początkowo trajektorie wywołane zapachem przenikają się z aktywnością wyjściową, chociaż zapach jest nadal obecny. Jedynie przesunięcie zapachu wywołało dodatkową trajektorię.

Film 1. Czasowo-rozdzielcza ocena trajektorii indukowanej zapachem po analizie głównych składowych wektora populacji PN (po lewej) i wektora populacji EN (po prawej; por. Rysunek 6). Górne części zawierają pierwsze trzy główne składniki (PC1, 2 i 3) wykreślone względem siebie. Dolne panele ilustrują ocenę PC1, 2 i 3 w czasie. Stymulacja zapachowa jest oznaczona szarym paskiem. Wszystkie panele zostały zsynchronizowane. Należy zauważyć, że aktywność populacji EN rozpoczyna się nieco przed aktywnością populacji PN, zjawisko, które wydaje się być sprzeczne z intuicją, ale można je wyjaśnić za pomocą łączności i właściwości zaangażowanych warstw, co zostało omówione wcześniej¹.

Discussion

W artykule przedstawiono produkcję i zastosowanie specjalnie zaprojektowanych wielokanałowych mikroelektrod. Opisane elektrody nadają się do rejestrowania zarówno aktywności pojedynczej jednostki, jak i populacji, co jest szczególnie przydatne do pomiarów opóźnień i innych właściwości odpowiedzi czasowej różnych neuronów i różnych neuropils w obrębie jednej próbki (szczegóły patrz^1,2,25). Dodatkowo pokazaliśmy, jak na stałe zaimplementować elektrody mikrodrutowe, aby umożliwić stabilne, długoterminowe zapisy u zachowujących się pszczół miodnych, które utrzymują się przez wiele godzin do kilku dni.

Zewnątrzkomórkowe nagrania wielojednostkowe stały się korzystnym narzędziem do osiągania wysokiej rozdzielczości czasowej w połączeniu z informacją przestrzenną. W naszym przypadku są to albo równoległe drogi neuronalne², albo dwa różne neuropils¹. Wiele neuronów może być rejestrowanych i analizowanych na poziomie pojedynczego neuronu równolegle i w wysokiej rozdzielczości czasowej. Zapisy wielojednostkowe zastosowano najpierw u ssaków³⁸, a później także u owadów^39-41. Znaczny postęp osiągnięto dzięki opracowaniu i udoskonaleniu zewnątrzkomórkowych technik zapisu wielokanałowego^42,43. Obejmuje to na przykład opracowanie nowych elektrod⁴⁴ lub nowatorskich algorytmów sortowania i grupowania spajków⁴⁵. Ogólne metody zewnątrzkomórkowych technik zapisu wielojednostkowego są dobrze opisane^46-48. Samodzielnie zbudowane elektrody pokazane na tym filmie można dodatkowo dostosować, dodając więcej mikrodrutów na elektrodę lub mikrodruty można skręcić, aby uzyskać mierzalne stałe odległości między końcówkami. Obie procedury prowadziłyby jednak do zmniejszenia elastyczności i zwiększenia grubości elektrody.

W porównaniu z sondami krzemowymi powszechnie stosowanymi do zapisów zewnątrzkomórkowych u znacznie większych owadów, takich jak jastrzębiowa, szarańcza i karaluch^40,49–51 , opisane mikroelektrody drutowe są mniejsze, elastyczne i z łatwością radzą sobie z potencjalnymi ruchami mózgu, a zatem mogą być niezawodnie stosowane u małych owadów społecznych, takich jak pszczoły i mrówki, które wykazują znacznie szerszy repertuar behawioralny. Większość sond silikonowych ma struktury przypominające ostry trzpień, przecinające aksony i tkankę nerwową wzdłuż ich kanału wprowadzającego, podczas gdy opisane mikrodruty są okrągłe, elastyczne i mniejsze, a zatem są mniej szkodliwe dla otaczającej tkanki, co jest wyraźną zaletą, jeśli celem jest badanie długoterminowej plastyczności u nienaruszonego i zachowującego się zwierzęcia. Kolejną zaletą elektrod mikrodrutowych jest ich niski koszt produkcji i łatwa obsługa. Zamiast starannego czyszczenia drogiej sondy silikonowej, druty elektrod są świeżo cięte przed wprowadzeniem mózgu, dzięki czemu nie ma problemów z przekrwieniem. Ponadto możliwe jest użycie więcej niż jednej elektrody mikrodrutowej w tym samym preparacie, umieszczonej w różnych neurostosach¹ lub drogach² , jak pokazano tutaj. Takie podejście jest szczególnie korzystne do analizowania i porównywania aspektów czasowych, takich jak opóźnienia odpowiedzi i interakcje na różnych poziomach przetwarzania neuronowego.

Zdajemy sobie sprawę z faktu, że zarejestrowany sygnał zewnątrzkomórkowy nie odzwierciedla aktywności pojedynczej komórki jako takiej. Jest to zawsze związek aktywności napięciowej wokół końcówki elektrody. Aby wskazać źródło sygnału, zawsze obliczana jest różnica dwóch sąsiednich kanałów mikroprzewodowych w obrębie jednej elektrody. W związku z tym źródło sygnałów szczytowych używanych do wyodrębniania aktywności pojedynczej jednostki było zawsze bardzo blisko jednego lub drugiego kanału elektrody, co skutkowało łatwymi do odróżnienia przebiegami skoków. Sygnały z większej odległości, takie jak aktywność mięśni lub aktywność sąsiednich neuropils, docierają do obu elektrod w tym samym czasie, wywołując porównywalne kształty i amplitudy i zostaną odrzucone przez tę procedurę. Korzystając z techniki dopasowywania szablonów Spike2, jesteśmy bardzo pewni, że uzyskamy aktywność pojedynczej jednostki, która nie jest taka sama, ale bardzo zbliżona do aktywności pojedynczego neuronu. Jednak problemu sortowania kolców można uniknąć, stosując techniki rejestracji wewnątrzkomórkowej.

Zapisy pojedynczych komórek za pomocą ostrych elektrod lub pipet plastrowych pozwalają na dogłębną wiedzę na temat właściwości fizjologicznych pojedynczego neuronu. Jednak ze względu na mały rozmiar neuronów owadów i ich neurytów (np. mniej niż 1 μm dla PN pszczół miodnych ⁵²) możliwe jest przeprowadzenie tylko krótkoterminowych zapisów. Co więcej, zapisy wewnątrzkomórkowe mogą być inwazyjne i mogą uszkodzić komórkę, co może być kolejnym powodem ograniczeń czasowych. Zapisy wewnątrzkomórkowe in vivo u owadów rzadko trwają dłużej niż godzinę. Okno czasowe, które było wystarczające dla pionierskiej pracy^{Martina Hammera 53} , który zarejestrował wewnątrzkomórkowy z pojedynczego zidentyfikowanego neuronu, brzusznego niesparowanego neuronu szczękowego #1 (VUMmx1). Mógł powiązać jego aktywność bezpośrednio ze ścieżką nagrody. Juliane Mauelshagen⁵⁴ zarejestrowała wewnątrzkomórkowo aktywność zidentyfikowanego zewnętrznego neuronu ciała grzyba, neuronu zewnętrznego szypułki #1 (PE1) podczas warunkowania klasycznego. Ten sam neuron był w centrum zainteresowania Menzela i Manza⁵⁵ , kiedy znaleźli LTP po elektrycznej stymulacji komórek Kenyona. Jednak Okada i współpracownicy⁵⁶ mogli wykorzystać dobrze scharakteryzowany wewnątrzkomórkowo wzór skoków (podwójne i potrójne kolce) do identyfikacji PE1 podczas nagrań zewnątrzkomórkowych. W końcu połączenie obu metod, wewnątrzkomórkowych zapisów ze zidentyfikowanych neuronów i zewnątrzkomórkowych zapisów długoterminowych może być potężnym narzędziem dla przyszłych badań.

Jednak użycie ostrych elektrod do jednoczesnego rejestrowania wielu komórek (jednostek) na różnych poziomach przetwarzania przez wiele godzin do kilku dni w celu analizy ich czasowych relacji reakcji i/lub nawet zmian plastycznych jest prawie niemożliwe.

Dzięki pierwszym metodom obrazowania wapnia u pszczoły miodnej^57,58 przy użyciu barwników wrażliwych na wapń, analiza przestrzennych wzorców reakcji na zapach była dostępna^59-62. Jednak w wielu przypadkach barwniki wrażliwe na wapń muszą zostać wprowadzone do tkanki mózgowej za pomocą inwazyjnych manipulacji, które ponownie ograniczają długość życia pszczół i wewnętrzne właściwości analizowanych komórek. Problem ten został rozwiązany w innych organizmach modelowych, takich jak muszka owocowa, przy użyciu genetycznie wprowadzonych czujników wapnia^63,64. Jednak ogólnie rzecz biorąc, czujniki wapnia mogą wprowadzać inne ograniczenia, ponieważ mogą działać jako wapniowe, które prawdopodobnie wpływają na czasowe właściwości reakcji zapachowych. Jednoczesne zapisy wewnątrzkomórkowe w połączeniu z obrazowaniem wapnia lub podejściami obliczeniowymi mogą udowodnić właściwą rozdzielczość czasową procesów obrazowania^65,66. Jednak rozdzielczość czasowa samego procesu obrazowania jest raczej ograniczona. Systemy akwizycji optycznej zwykle wykorzystują obrazowanie CCD z rozdzielczością czasową 5-20 Hz ⁶⁷, chociaż obrazowanie 2-fotonowe może być w stanie uzyskać szybsze sekwencje⁶⁸. Jednak zwiększenie częstotliwości próbkowania zawsze idzie w parze ze spadkiem rozdzielczości przestrzennej. Ponadto wrażliwe na wapń barwniki stosowane u pszczół miodnych ulegają bieleniu, co również skraca czas pozyskiwania⁶⁹.

W porównaniu z innymi technikami rejestracji fizjologicznej u owadów, nasze elastyczne, wielokanałowe elektrody mikrodrutowe zapewniają długotrwały dostęp do pojedynczej jednostki i aktywności neuronalnej populacji u zachowujących się pszczół.

Pokazaliśmy, jak używać dwóch z tych elektrod na różnych etapach przetwarzania u tego samego zwierzęcia, co ułatwia analizę aspektów kodowania czasowego między różnymi miejscami rejestracji. W zależności od problemu badawczego i modelu owada, podstawowa metoda budowy elektrod zaprezentowana tutaj jest łatwa do rozbudowy i/lub adaptacji. Na przykład można sobie wyobrazić użycie więcej niż trzech pojedynczych przewodów do produkcji elektrod wielokanałowych. Ponadto liczba miejsc rejestracji może być rozszerzona i możliwa jest obserwacja aspektów czasowych więcej niż dwóch dróg lub neuropilsów. Mamy nadzieję, że ta metoda zainspiruje wielu naukowców i pozytywnie przyczyni się do zrozumienia zaawansowanego przetwarzania neuronów w małych mózgach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olej parafinowy	Fluka	76235
Zapachy	Sigma Aldrich
PBS			pH 7,2
4% Formaldehyd	ThermoScientific	28908	metanolu
Triton X	BioChemica	A1388
Salicylan metylu	Roth	4529.1
Dekstran tetrametylorolodaminy, 10 000 MW (mikrorubin)	Invitrogen	D7162	zachowaj ciemne
Alexa 488 hydrazyd	Invitrogen	A-10436	keep dark
Alexa 568 hydrazyd	Invitrogen	A-10437	keep dark
Bee Ringer Solution	patrz Brill et al.2
Drut miedziany pokryty poliuretanem	Elektrisola	15 µ m średnicy i Izolacja
Wosk dentystyczny	Densply Detrey	64103015S1	umiarkowana temperatura topnienia
Wosk dentystyczny	Flexaponal	124-202-00	wosk niskotopliwy
KWIK SIl	WPI	03L
18 Pin Socket	Conrad Electronic	189634-62
Klej topliwy	Conrad Electronic	827673
Igła do	Conrad Electronics	830283	12 V
Końcówka lutownicza	Conrad Electronic	531901
Glaselectrodes	WPI	1B100F-3
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	V2A 0,2 x 12 mm
Przełączana scena czołowa	Tucer Davis Technologies	SH16
Moduł połączeniowy stacji czołowej	NPI	INT-03M
Moduł wzmacniacza	NPI	PDA-2F
Tablice akwizycji danych	National Instruments	NI-6123, Ni-6143
Oprogramowanie do akwizycji	National Instruments	Lab View 8.2	niestandardowy projekt
Sortowanie kolców	CED	Spike 2 v7.11
Matlab	Mathworks	R2008B
Mikromanipulator	Leitz		instrukcja
AG-wires	WPI	AGT05100
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Leica	TCS SP2 AOBS
AMIRA	Mercury Computer Systems	2000-02-05