Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Streszczenie

Komórki macierzyste dzielą się asymetrycznie, tworząc dwie komórki potomne o nierównym potencjale losu: samoodnawiającą się komórkę macierzystą i komórkę różnicującą. Biorąc pod uwagę ich znaczenie dla rozwoju i choroby, zrozumienie mechanizmów rządzących asymetrycznym podziałem komórek macierzystych jest solidnym obszarem badań. Ponieważ są one genetycznie podatne i przechodzą kolejne rundy podziału komórkowego mniej więcej raz na godzinę, komórki macierzyste ośrodkowego układu nerwowego Drosophila, czyli neuroblasty, są niezbędnymi modelami do badania podziału komórek macierzystych. Około 100 nerwowych komórek macierzystych znajduje się w pobliżu powierzchni każdego z dwóch płatów mózgowych larw, co czyni ten system modelowy szczególnie przydatnym do badań mikroskopowych obrazowania na żywo. W tej pracy dokonujemy przeglądu kilku podejść szeroko stosowanych do wizualizacji podziałów komórek macierzystych i zajmujemy się względnymi zaletami i wadami tych technik, które wykorzystują zdysocjowane i nienaruszone tkanki mózgowe. Szczegółowo opisujemy również nasz uproszczony protokół używany do eksplantacji całych mózgów z larw trzeciego stadium rozwojowego do obrazowania żywych komórek i zastosowań związanych z analizą ustaloną .

Wprowadzenie

Komórki macierzyste utrzymują równowagę różnicowania i samoodnawiania, aby generować różnorodność komórkową we wczesnym okresie rozwoju i zastępować uszkodzone komórki w dorosłych tkankach. Regulacja tej homeostazy zapobiega zarówno utracie, jak i nadmiernej ekspansji populacji komórek macierzystych, co może skutkować szkodliwą degeneracją tkanek lub nowokształceniem.

Neuroblasty (NBs) to szeroko badane nerwowe komórki macierzyste ośrodkowego układu nerwowego Drosophila (Rysunek 1A), które po raz pierwszy powstają w stadium embrionalnym ^1,2. NB przechodzą powtarzające się rundy asymetrycznego podziału komórkowego (ACD) w celu wytworzenia dwóch nierównych losów: samoodnawiającej się komórki macierzystej i komórki różnicującej. ACD jest prowadzony przez centrosomy, organelle niebłoniaste, które działają jako centra organizujące mikrotubule większości komórek³. Podczas mitozy centrosomy NB organizują i orientują dwubiegunowe wrzeciono mitotyczne wzdłuż osi polaryzacji wierzchołkowo-podstawowej. Po rozszczepieniu dzielącego się NB, wierzchołkowe determinanty losu, które określają los komórek macierzystych, oraz determinanty losu podstawowego, które określają różnicowanie, są segregowane na nierówne komórki potomne.

W centralnym mózgu larwy można rozróżnić dwa typy NB na podstawie ich liczby, położenia, ekspresji czynnika transkrypcyjnego i linii komórkowej (Rysunek 1A)^4-6. Typ I NB są najliczniejsze, a około 90 z nich zasiedla przednią i tylną stronę każdego płata wzrokowego mózgu⁷. Te NB wyrażają czynnik transkrypcyjny Asense (Ase) i charakterystycznie dzielą się na jedną samoodnawiającą się NB i jedną mniejszą komórkę macierzystą zwoju (GMC; Rysunek 1B). Każdy GMC przechodzi pojedynczy końcowy podział w celu wytworzenia dwóch neuronów lub komórek glejowych (ryc. 1B). W przeciwieństwie do tego, osiem NB typu II, które wypełniają tylną stronę każdego płata wzrokowego, nie ma ekspresji Ase⁵. Przechodzą ACD w celu wytworzenia jednego samoodnawiającego się NB i jednego pośredniego progenitora neuronalnego (INP).

INP, z kolei, dzieli się asymetrycznie od trzech do pięciu razy. Każdy z tych podziałów skutkuje regeneracją INP i produkcją pojedynczego GMC⁴. Podsumowując, specyficzna tożsamość NB i czasowy porządek narodzin GMC powodują zdumiewającą różnorodność neuronalną dorosłego ośrodkowego układu nerwowego.

Zrozumienie biologii komórki, która leży u podstaw NB ACD, zostało znacznie ulepszone dzięki zastosowaniu technik obrazowania żywych komórek. Opublikowane protokoły wykorzystywane przez badaczy do obrazowania NB na żywo są bardzo zróżnicowane. Ogólnie rzecz biorąc, metody te można podzielić na dwie ogólne kategorie, różniące się tym, czy mózg larwy pozostaje nienaruszony, czy mechanicznie zdysocjowany. Obie techniki mają wyraźne zalety i wady w zależności od zastosowania badacza.

Wczesne doniesienia ujawniające żywe podziały komórek NB obejmują pewien stopień ręcznej dysocjacji mózgu larw. Protokoły te szczegółowo opisują rozmazywanie⁸ lub rozdzielanie⁹ mózgu w celu wyhodowania krótkoterminowych pierwotnych kultur NB na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Aby poprawić obrazowanie, okrągłe NB są zwykle spłaszczane na szkiełkach nakrywkowych za pomocą szkiełek^{podstawowych 8} lub padów agarozowych⁹. Chociaż spłaszczone komórki mają lepszą optykę, techniki te często prowadzą do defektów mitotycznych NB, w tym regresji bruzdy rozszczepienia i niemożności podziału więcej niż jeden raz. Dlatego protokoły, które obejmują zarówno ręczną dysocjację, jak i fizyczne zniekształcenie larwalnej tkanki mózgowej, są na ogół odpowiednie tylko do bardzo krótkoterminowych (tj. Jeden cykl komórkowy lub mniej) zastosowań. Podobnie, częściowe zgniecenie lub całkowite spłaszczenie nienaruszonych mózgów między szkiełkami szkiełkowymi a szkiełkami nakrywkowymi ogranicza czas, jaki można poświęcić na obrazowanie danej próbki do około 30^minut. Pomimo tego ograniczenia, podejście to jest z powodzeniem stosowane^11-14.

Ostatnie próby zobrazowania na żywo zdysocjowanych NB ograniczają fizyczne zniekształcenia izolowanych komórek. Techniki te są szczególnie przydatne w zastosowaniach, w których konieczne jest utrzymanie kultur komórkowych przez wiele cykli podziału komórkowego. Na przykład rozproszone komórki z ręcznie zdysocjowanych mózgów mogą być częściowo osadzone w skrzepie utworzonym z mieszaniny fibrynogenu i trombiny¹⁵ w celu długoterminowego obrazowania¹⁶. Alternatywnie, eksplantowane mózgi mogą być najpierw chemicznie zdysocjowane za pomocą enzymu kolagenazy, następnie ręcznie przerwane przez wielokrotne przejście przez końcówkę pipety, a następnie posiane na szklanych szalkach pokrytych poli-L-lizyną^17,18. Powlekanie szklanych naczyń fibrynogenem lub poli-L-lizyną sprzyja przyczepianiu się i lekkiemu rozprzestrzenianiu się okrągłych komórek, zbliżając je jak najbardziej do szkiełka nakrywkowego bez większych zniekształceń fizycznych. Ponadto metody te obejmują hodowlę NB w pożywce, która może być łatwo wymieniona na eksperymenty z zaburzeniami farmakologicznymi¹⁸. Ogólnie rzecz biorąc, bezpośrednie powlekanie rozproszonych nanoogniw NB poprawia optykę obrazowania bez poświęcania długoterminowych możliwości obrazowania. Ostatnio szczegółowo opisano protokół opisujący długoterminową hodowlę zdysocjowanych nano-nanolitów¹⁹.

Jednak to podejście nie jest pozbawione ograniczeń. Istnieje kilka zastrzeżeń dotyczących obrazowania na żywo zdysocjowanych NB. Na przykład w dziedzinie rozproszonych komórek trudno jest zidentyfikować konkretne linie NB, które są przestrzennie zorganizowane w nienaruszonym mózgu¹. Podobnie, rozróżnienie NB typu I i typu II w zdysocjowanej tkance jest również trudne bez ekspresji znaczników linii lub transgenów specyficznych dla podtypu, takich jak worniu-GAL4, asense-GAL80²⁰. Chociaż te transgeny są bardzo przydatne w niektórych zastosowaniach, ograniczają badaczy do tych transgenów, które ulegają ekspresji pod kontrolą elementu wzmacniającego UAS²¹ i wymagają bardziej złożonych schematów genetycznych. Badania, które dotyczą przestrzennego lub czasowego rozwoju NB, wymagają zatem obrazowania in vivo w kontekście nienaruszonej tkanki.

Ponadto, badania zdysocjowanych embrionalnych NB wskazują, że fizyczny kontakt sąsiednich komórek jest krytyczny dla lokalizacji interfazowej kluczowych determinantów polaryzacji^22,23. Badania te pokazują, że całkowicie izolowane NB nie utrzymują już niezmienniczej osi wrzeciona mitotycznego. Zamiast tego komórki te wykazują bardziej losową oś wrzeciona i szerokie kąty separacji między kolejnymi pąkami GMC, być może z powodu utraty wierzchołkowego pozycjonowania centrosomów²². Chociaż związek między larwalnymi NB a sąsiednimi komórkami nie został dokładnie zbadany, warto wziąć pod uwagę, że mikrośrodowisko larwalnych komórek macierzystych może wpływać na polaryzację komórek lub inne zachowania. Aby zachować fizjologiczny kontekst larw NB, obrazujemy ACD z całych mózgów.

Biorąc pod uwagę nieodłączne ograniczenia związane z obrazowaniem zdysocjowanych NB, nasze laboratorium i inni ustalili protokoły obrazowania kolejnych rund NB ACD z całych mózgów larw. Techniki obrazowania nienaruszonych mózgów często zastępują sztywną powierzchnię szkła po jednej stronie komory hodowlanej elastyczną membraną, aby zapobiec zniekształceniu lub uszkodzeniu tkanek i umożliwić wymianę gazową. Niektóre metody polegają na umieszczeniu eksplantowanych mózgów w mieszaninie pożywki do hodowli owadów, surowicy i kwasu askorbinowego z ciałami tłuszczowymi wyizolowanymi z dziesięciu larw²⁴. Wyizolowane ciała tłuszczowe są dodawane, ponieważ wydzielają mitogen, o którym wiadomo, że stymuluje podział komórek NB²⁵. Protokół ten zachowuje integralność tkanki przez ponad 3 godziny i dlatego jest podatny na długotrwałe obrazowanie ^24,26-28. Ostatnio^{szczegółowo opisano} protokół opisujący długoterminowe obrazowanie nienaruszonych mózgów larw w obecności kwasu askorbinowego, surowicy i ciał tłuszczowych. Co ważne, ponieważ tkanka nie jest ani odsłonięta, ani unieruchomiona, podejście to jest mniej przydatne w zastosowaniach, w których dochodzi do wymiany pożywki hodowlanej (np. badania leków, utrata odporności itp.).

Nasze laboratorium uprościło całe przygotowanie żywych mózgów larwalnych do długoterminowego obrazowania^30,31. Główną przewagą naszego protokołu nad innymi jest jego prostota: nasze obserwacje wskazują, że ani surowica, ani kwas askorbinowy, insulina, ani ciała tłuszczowe nie są niezbędnymi dodatkami do obrazowania kolejnych rund NB ACD. Chociaż dodatki, takie jak insulina, są przydatne do przedłużonego obrazowania podziałów komórek macierzystych³² i zbiorowej migracji komórek w jajnikach Drosophila ³³, wydają się być zbędne w przypadku NB ACD, ponieważ nasze podłoże do obrazowania składa się z prostej mieszaniny standardowej pożywki do hodowli komórek owadów uzupełnionej antybiotykiem i antybiotykiem przeciwgrzybiczym, aby zapobiec zakażeniu. Dzięki zastosowaniu naczyń wielokrotnego użytku przepuszczających gaz lub ze szklanym dnem udało nam się utrzymać kilka rund kolejnych NB ACD. Te same eksplantowane próbki można z łatwością wykorzystać do immunofluorescencji i innych procedur z utrwaloną tkanką. W tym protokole szczegółowo opisujemy sekcję nienaruszonych mózgów larw, a także przygotowanie mózgów zarówno do analizy żywej, jak i stałej.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów potrzebnych do eksplantacji mózgów larwalnych trzeciego stadium rozwojowego

1. Przygotuj narzędzia potrzebne do mikrodysekcji.
   1. Wykuj dwa narzędzia preparacyjne (skalpel i hak), umieszczając najpierw pojedynczą szpilkę preparacyjną w każdym uchwycie szpilki. Mocno dokręć kołki ręcznie lub szczypcami (Rysunek 1C).
   2. Użyj pary starych kleszczy, aby zgiąć jedną szpilkę preparacyjną pod kątem około 120°. Zrób to pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że górna połowa szpilki leży płasko, gdy uchwyt szpilki jest trzymany w dłoni. To narzędzie będzie używane jako skalpel do przytrzymywania lub przecinania tkanki.
   3. Użyj pary starych kleszczy, aby zgiąć drugą szpilkę w haczyk, który będzie używany do przytrzymywania i zeskrobywania tkanki.
   4. Przykryj każde narzędzie preparacyjne końcówką pipety, aby chronić narzędzia przed uszkodzeniem. Przy zachowaniu ostrożności dobrze uformowane narzędzia mogą być używane do preparacji w nieskończoność. W razie potrzeby wymień uszkodzone lub zdeformowane kołki.
2. Przygotować podłoże preparacyjne.
   1. W kapturze do hodowli tkankowej rozcieńczyć suplement antybiotykowo-przeciwgrzybiczy w pożywce Schneidera. Zakręć mediami, aby włączyć suplement.
   2. Przygotować kilka 5 ml porcji uzupełnionej pożywki. Przechowuj wszystkie nośniki w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do użycia.
   3. Podgrzać 5 ml porcji dodanego podłoża do temperatury pokojowej. Pobrać pożywkę do sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml i przykręcić sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm.
3. Wybierz larwy do sekcji. Użyj sondy preparucyjnej, aby wybrać pełzające larwy trzeciego stadium rozwojowego, ponieważ mózg będzie najłatwiejszy do wypreparowania. Opcjonalnie: umieścić larwy na talerzu z agarem winogronowym.
   Uwaga: Nie używaj zbyt zatłoczonych fiolek lub butelek z "mokrą karmą", ponieważ mają one tendencję do zmuszania larw drugiego lub pierwszego stadium do przedwczesnego wypełzania.
   Uwaga: Niektóre tła genetyczne będą wymagały użycia młodszych larw. Nie ma to wpływu na protokół, ale utrudnia sekcję.

2. Rozwarstwienie ośrodkowego układu nerwowego

1. Na jednym szklanym szkiełku utwórz dwie kałuże o pojemności 50 ml z ciepłym środkiem preparacyjnym oddalone od siebie o około 3 cm. Jedna pula będzie używana do grubego rozwarstwienia, a druga do drobnej sekcji (rysunek 1C).
2. Przenieś kilka larw do jednej z kropli pożywki.
3. Przenieś szkiełko nakrywkowe z larwami do mikroskopu preparacyjnego. Powiększ basen zawierający larwy w taki sposób, aby można było dostrzec przednie i tylne końce larw.
4. Użyj pary kleszczy, aby chwycić środkową część pojedynczej larwy. Weź drugą parę kleszczy w drugą rękę i chwyć larwę blisko tego samego obszaru. Rozsuń dwie pary kleszczy, aby delikatnie rozerwać larwę na pół. Powtórz powyższe dwa kroki dla wszystkich larw na szkiełku nakrywkowym.
5. Pozbądź się tylnych połówek ciała larwalnego, przenosząc je do tkanki.
6. Powiększ larwę tak, aby przednie haczyki gębowe były wyraźnie widoczne. Użyj obu par kleszczy, aby utworzyć małe nacięcie lub wcięcie po przeciwnych stronach haczyków gębowych larw między trzecim pasmem piersiowym a pierwszym przednim pasmem ząbkowym.
7. Chwyć haczyki na usta kleszczami w ręce niedominującej. Za pomocą kleszczy w drugiej ręce delikatnie odklej naskórek w kierunku od przodu do tyłu. Kontynuuj powolne odklejanie naskórka, aż do odsłonięcia ośrodkowego układu nerwowego.
8. Odizoluj ośrodkowy układ nerwowy od reszty larwy, rozrywając tkanki kleszczami. Należy zachować ostrożność, aby nie zakłócić pracy ośrodkowego układu nerwowego.
   Krok krytyczny: Nie szarp ośrodkowego układu nerwowego! Wyrzuć uszkodzone próbki z rozerwanym brzusznym rdzeniem nerwowym (ryc. 2A) lub zniekształconymi płatami wzrokowymi (ryc. 2B i 2B').
9. Powtórz powyższe dwa kroki dla wszystkich larw na szkiełku nakrywkowym. Przenieść zdrową eksplantowaną tkankę do drugiej (czystej) puli pożywki na szkiełku nakrywkowym w celu przeprowadzenia etapu dokładnego rozwarstwienia.
10. Użyj narzędzi do preparowania, aby usunąć tkanki obwodowe (np. krążki oczu, skrzydeł i nóg) z mózgu. Wsuń skalpel między poszukiwaną (mózg) a niechcianą tkankę, przypinając tkankę łączną do szkła nakrywkowego. Za pomocą haczyka delikatnie zetrzeć niepożądaną tkankę, jednocześnie dociskając skalpel do szkiełka nakrywkowego ruchami przypominającymi piłę.
11. Krytyczny krok: Pracuj powoli i celowo, aby usunąć wszystkie dyski z każdego mózgu. Zachowaj ostrożność, aby nie zakłócić morfologii mózgu. Zdrowy mózg będzie miał nienaruszony brzuszny rdzeń nerwowy i symetryczne, okrągłe płaty wzrokowe (ryc. 2C).

3. Montaż eksplantowanych mózgów do obrazowania na żywo

1. Odwrócić przepuszczalną dla gazu naczynie hodowlaną o średnicy 50 mm przezroczystą folią skierowaną do góry (rysunek 2D). Wciśnij strzykawkę, aby nanieść niewielką kroplę (około 30 μl) pożywki na środek naczynia.
2. Przenieś izolowane mózgi, pojedynczo, do kropli pożywki na szalce. Użyj narzędzia do hakowania, aby zgarnąć mózg pod płatami optycznymi. Alternatywnie użyj kleszczy, aby chwycić aksony wystające z brzusznego rdzenia nerwowego.
3. Zbierz 5-10 mózgów w kropli pożywki. Zanurz mózgi za pomocą narzędzi do preparowania, aby popchnąć poszczególne mózgi na dno kropli pożywki, ponieważ wiele z nich zostanie uwięzionych w łąkotce (ryc. 2E).
4. Zorientuj mózgi za pomocą narzędzi do preparowania, aby wyrównać mózgi w zależności od NB, które mają być zobrazowane (ryc. 3A). Aby zobrazować grzbietowe NB, umieść brzuszny rdzeń nerwowy skierowany w dół (wzdłuż błony). Aby zobrazować przednio-brzuszne NB, umieść mózg z brzusznym rdzeniem nerwowym skierowanym do góry (z dala od błony). Ustaw mózgi tak, aby wszystkie brzuszne sznury nerwowe były skierowane w tym samym kierunku w płaszczyźnie x-y.
5. Za pomocą strzykawki lub plastikowej pipety transferowej umieść 4 krople oleju halowęglowego (HC) (około 30 μl każda) na membranie przepuszczającej gaz. Objętość każdej kropli oleju powinna być równa sobie nawzajem i kropli pożywki. Rozmieść krople oleju tak, aby odpowiadały czterem rogom szkiełka nakrywkowego wyśrodkowanego wokół kropli pożywki hodowlanej. Po ukończeniu, pięć kropli (cztery krople oleju i jedna kropla pożywki w środku) będzie przypominać pięć faset na kostkach w stylu zachodnim (Rysunek 3B).
6. Opuść szkiełko nakrywkowe #1.5 22 mm na zespole tak, aby uderzyło we wszystkie 5 kropli w tym samym czasie. Utrzymanie równomiernego ciśnienia w próbkach zmniejsza prawdopodobieństwo ich zakłócenia. Odczekaj około 3 minut, aż olej i podłoże rozproszą się pod ciężarem szkiełka nakrywkowego. Uformuje się kształt podobny do krzyża (rysunki 3C i 3D).
7. Krytyczny krok: Opuść szkiełko nakrywkowe na powierzchnię mózgu, usuwając nadmiar podłoża za pomocą z bibuły (ryc. 3C). Zrób to, obserwując próbkę pod lunetą sekcyjną. W miarę usuwania podłoża szkiełko nakrywkowe będzie się obniżać. Zatrzymaj się, gdy szkiełko nakrywkowe dotknie mózgu. Nie przesadzaj, ponieważ spowoduje to zniekształcenie tkanek lub eksplozje mózgu.
8. W przypadku obrazowania grzbietowych NB (ryc. 3E) przejdź do kroku 3.9. W przypadku obrazowania przednio-brzusznych NB, szkiełko nakrywkowe należy lekko przesunąć (delikatnie popychając je kleszczami) w kierunku końcówek brzusznego rdzenia nerwowego. Powoduje to obracanie się mózgu, co powoduje, że płaty mózgowe stykają się bezpośrednio ze szkiełkiem nakrywkowym, aby ułatwić obrazowanie (ryc. 3F).
9. Uszczelnić komorę, otaczając szkiełko nakrywkowe niewielką ilością oleju halowęglowego (rysunek 3D). Nadmiar oleju sączący się ze szkiełka nakrywkowego należy zminimalizować i zetrzeć chusteczką.

4. Obrazowanie na żywo centralnych neuroblastów mózgu

Uwaga: Do tej pracy użyto mikroskopu konfokalnego (mikroskopu odwróconego) firmy Nikon Eclipse Ti do obrazowania na żywo; szczegóły naszej konfiguracji zostały wcześniej opublikowane³¹. Alternatywnie, próbka może być obrazowana za pomocą systemu pionowego.

1. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do szkiełka nakrywkowego tuż nad zamontowanymi mózgami. Pomoże to wyśrodkować obiektyw bezpośrednio nad próbką.
2. Krok krytyczny: Utrzymuj mózgi w stałej temperaturze 25 °C za pomocą inkubatora stopniowego. Delikatnie umieść zamontowaną próbkę w inkubatorze ze stopniem i przykryj komorę pokrywą.
3. Zlokalizuj NB w centralnym mózgu za pomocą światła przechodzącego, skupiając się na dużych, okrągłych komórkach, które znajdują się w centralnych i przyśrodkowych obszarach płatów wzrokowych; Nie używaj epi-fluorescencji. Wraz z praktyką staje się to łatwiejsze. Bardzo ważne jest, aby wystawić próbkę na jak najmniejszą ilość światła. Nie trać czasu na obrazowanie uszkodzonych mózgów.
4. Po umieszczeniu na miejscu wykonaj szybkie ekspozycje za pomocą konfokalnego, aby określić właściwe położenie i głębokość. Ogranicz głębokość do pierwszych 10-15 μm. Dostosuj w razie potrzeby i wykonaj kolejny obraz testowy.
   1. Opcjonalny krok: Zbierz film testowy brzusznego rdzenia nerwowego, aby upewnić się, że nie ma dryfu x-y. W przypadku wykrycia dryftu należy odczekać 15-30 minut, aż próbka się uspokoi. Jeżeli dryft nie ustąpi w ciągu 30 minut, należy przygotować nową próbkę. Duży dryft można zwykle przypisać dodatkowi nadmiaru oleju lub nierównej wielkości kropel oleju podczas montażu.
5. Aby wyeliminować dryft osiowy (z-drift), należy użyć urządzenia do ciągłego automatycznego ustawiania ostrości, które wykorzystuje diodę LED na podczerwień. Alternatywnie można ręcznie skorygować płaszczyznę ogniskowej.
6. Po zidentyfikowaniu interesującego NB należy przystąpić do schematu obrazowania. Podobnie jak w przypadku wszystkich obrazowania żywych komórek, ilość światła laserowego, czas naświetlania, łączenie kamery, powiększenie obiektywu, czas i/lub interwał kroku Z muszą być empirycznie zoptymalizowane dla konkretnego eksperymentu, aby odpowiedzieć na pytanie. Celem jest zminimalizowanie uszkodzeń spowodowanych światłem przy jednoczesnym gromadzeniu przydatnych danych. Zobacz dyskusję, aby uzyskać dodatkowe wskazówki.
   1. Zobrazuj całą objętość NB, zbierając 12-14 obrazów oddalonych od siebie o 1 μm w osi z. Dostosuj rozdzielczość czasu, aby uchwycić jeden lub wiele cykli komórkowych tego samego NB. Jako ogólną wskazówkę należy stosować odstępy 10-30 sekund w przypadku obrazowania cyklu pojedynczej komórki i 1-3 minuty w przypadku wielu cykli komórkowych.
7. Krok krytyczny: Upewnij się, że próbka jest zdrowa, monitorując czas trwania mitozy. Jeśli mitoza trwa dłużej niż 15 minut, przejdź do innego mózgu. Zdrowy mózg pokaże wiele NB w tym samym polu widzenia, przechodząc kilka rund mitozy. Należy pamiętać, że każdy cykl komórkowy jest nieco dłuższy niż poprzedni z powodu uszkodzenia przez światło.
8. Po zakończeniu obrazowania zdemontuj komorę inkubacyjną i wyrzuć wszystko oprócz przepuszczalnych dla gazu naczyń do hodowli. Opłucz powierzchnię naczynia hodowlanego 95% etanolem i dobrze wytrzyj chusteczką. Powtórz jeszcze dwa razy.

5. Przygotowanie mózgów do immunofluorescencji

1. Zebrać 20 lub więcej eksplantowanych mózgów do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej około 0,2 ml uzupełnionej pożywki.
2. Wyjąć pożywkę z probówki i raz przepłukać mózgi 0,5 ml PBSTx (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS, z 0,3% Triton X-100). Niech mózgi osiądą na dnie rurki między wszystkimi wymianami płynu. Detergent Triton X-100 służy do przepuszczalności tkanki. Płukanie trwa zwykle mniej niż 30 sekund; po prostu usuń PBSTx, gdy mózgi osiądą na dnie rurki.
3. Zastąp roztwór 0,5 ml paraformaldehydu klasy 9% do mikroskopii elektronowej, rozcieńczonego w PBSTx. Inkubować z nutacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Utrwalacz utylizować zgodnie z przepisami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
5. Płukać próbki 0,5 ml PBSTx przez 15 minut. Powtórzyć etap płukania ze świeżym PBSTx jeszcze dwa razy.
6. Zastąp roztwór 0,5 ml PBT (PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% Tween-20). Inkubować z nutacją przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ten krok blokuje niespecyficzne wiązanie przeciwciała z tkanką.
7. Zastąp roztwór 0,5 ml przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBT uzupełnionego 4% normalną surowicą kozią (NGS). Inkubować z nutacją przez noc w temperaturze 4 °C.
8. Wyrzuć lub zachowaj rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe.
9. Umyć próbki 0,5 ml PBT przez 15 minut. Powtórzyć etap płukania ze świeżym PBT jeszcze dwa razy.
10. Zastąp roztwór 0,5 ml zmodyfikowanego PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20 i 4% NGS). Inkubować z nutacją przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
11. Zastąp roztwór 0,5 ml przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w zmodyfikowanym PBT. Inkubować z nutacją przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
12. Zastąp roztwór 0,5 ml PBST (PBS 0,1% Tween-20). Inkubować z nutacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz etap mycia ze świeżym PBST jeszcze dwa razy.

6. Montaż próbek do immunofluorescencji

1. Ostrożnie przenieść próbki w postaci kropli na szklane szkiełko, ograniczając kroplę w kierunku lewej strony środka szkiełka.
2. Dodaj dużą kroplę (o średnicy około 2 cm) medium montażowego (na przykład Aqua-Poly/Mount) na środek szkiełka. Unikaj kałuży PBST znajdującej się po lewej stronie.
3. Użyj kleszczy, aby przenieść mózg z puli PBST do puli pożywki montażowej. Dodawanie pożywki montażowej bezpośrednio na mózg może zakłócić ich orientację i należy tego unikać.
4. Pod mikroskopem świetlnym ułóż próbki w podłożu montażowym stroną, która będzie obrazowana, skierowaną do góry.
5. Trzymając szkiełko pod mikroskopem świetlnym, powoli opuść szklane szkiełko nakrywkowe #1.5 na próbki. Opcjonalny krok: Usuń drobne pęcherzyki powietrza, lekko naciskając szkiełko nakrywkowe.
6. Pozostawić podłoże montażowe do polimeryzacji przez kilka godzin lub na noc, leżąc na płasko, chronione przed światłem, w temperaturze pokojowej.
7. Slajdy mogą być obrazowane następnego dnia lub przechowywane przed obrazowaniem.

Wyniki

Obrazowanie na żywo pozwoliło wyjaśnić szereg mechanizmów regulujących ACD w NB. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazów konieczne jest określenie optymalnych warunków obrazowania. Należy zachować równowagę między częstotliwością przechwytywania klatek a czasem trwania obrazowania żywych komórek. W przypadku szczegółowej analizy komórkowej może być wymagana, na przykład, wyższa rozdzielczość czasowa i optyczna. Podczas wizualizacji pojedynczego cyklu komórkowego NB (Rysunek 4A) częstotliwość przechwytywania...

Dyskusja

Obrazowanie żywych komórek jest nieocenionym podejściem stosowanym do badania mechanizmów regulujących ACD komórek macierzystych, różnicowania linii komórkowych i morfogenezy złożonych tkanek. Chociaż grupy badawcze historycznie stosowały różne techniki do wizualizacji NB ACD, podejścia te można ogólnie podzielić na dwie kategorie, które przede wszystkim różnią się pod względem tego, czy tkanka mózgowa pozostaje nienaruszona, czy zdysocjowana.

Obrazowanie zdysocjowanych nanolitów ma swoje zale...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie do hodowli tkankowych Lumox 50 x 12 mm	Sarstedt	94.6077.410	Naczynie hodowlane wielokrotnego użytku z gazoprzepuszczalną i optycznie przezroczystą podstawą foliową.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antybiotyk-Antybiotyk (100x)	Invitrogen	15240-062	Suplement zawierający penicylinę (10 000 U/ml), streptomycynę (10 000 μ g/ml) i amfoterycyna B (25 μ g/ml), który jest dodawany do pożywki S2 firmy Schneider w celu zapobieżenia skażeniu bakteryjnemu i grzybiczem.
Szkiełka nakrywkowe szklane, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Olej halowęglowy 700	Sigma-Aldrich	H8898	Obojętny olej o wysokiej lepkości, który jest klarowny i bezbarwny.
Para niklowanych uchwytów na szpilki o długości 17 cm	Fine Science Tools	26018-17
Para kleszczyków Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20
Igła/sonda preparcyjna z plastikowym uchwytem	Fisher Scientific	08-965-A
Filtr strzykawkowy, 0,22 i #956; m wielkość porów	Fisher Scientific	09-719A
Strzykawka, 5 ml	BD Biosciences	309646
Plastikowa pipeta transferowa	Fisher Scientific	S30467-1
Paraformaldehyd, 32% Mikroskopia	elektronowa klasy EM Sciences	15714	UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny; należy się z nim obchodzić w dygestorium. Postępuj zgodnie z wytycznymi MSDS, aby zapewnić bezpieczną obsługę.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)	Invitrogen	D1306	Barwnik, który znakuje DNA i jest wzbudzany przez światło UV.