Artykuł metodologiczny

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

DOI:

10.3791/51763

⸱

12 sierpnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne modele gwiaździaków mają ograniczoną zdolność do definiowania ról mutacji onkogennych w określonych typach komórek mózgowych podczas patogenezy choroby i ich użyteczność dla przedklinicznego rozwoju leków. W celu zaprojektowania lepszego systemu modelowego dla tych zastosowań, fenotypowo dzikie astrocyty korowe i nerwowe komórki macierzyste (NSC) od warunkowych, genetycznie modyfikowanych myszy (GEM), które zawierają różne kombinacje floksowanych alleli onkogennych, zostały zebrane i wyhodowane w hodowli. Rekombinację genetyczną indukowano in vitro za pomocą rekombinacji za pośrednictwem adenowirusa Cre, w wyniku której prowadzono do ekspresji zmutowanych onkogenów i delecji genów supresorowych nowotworów. Fenotypowe konsekwencje tych mutacji zostały zdefiniowane poprzez pomiar proliferacji, transformacji i odpowiedzi na leki in vitro. Ortotopowe modele alloprzeszczepów, w których przekształcone komórki są stereotaktycznie wstrzykiwane do mózgów immunokompetentnych, syngenicznych rodzeństwa z miotu, zostały opracowane w celu określenia roli mutacji onkogennych i typu komórki w nowotworzeniu in vivo. W przeciwieństwie do większości uznanych ksenoprzeszczepów linii komórkowej glejaka ludzkiego, wstrzyknięcie przekształconych astrocytów korowych pochodzących z GEM do mózgów kompetentnych immunologicznie rodzeństwa z miotu spowodowało powstanie gwiaździaków, w tym najbardziej agresywnego podtypu, glejaka, który rekapitulował histopatologiczne cechy charakterystyczne ludzkich gwiaździaków, w tym rozlaną inwazję normalnego miąższu mózgu. Obrazowanie bioluminescencyjne ortotopowych alloprzeszczepów z przekształconych astrocytów zmodyfikowanych do ekspresji lucyferazy wykorzystano do monitorowania wzrostu guza in vivo w czasie. W związku z tym modele gwiaździaków wykorzystujące astrocyty i NSC zebrane z GEM z warunkowymi allelami onkogennymi zapewniają zintegrowany system do badania genetyki i biologii komórki patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo i mogą być przydatne w przedklinicznym opracowywaniu leków na te wyniszczające choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gwiaździaki są najczęstszym pierwotnym guzem mózgu, a glejak (GBM), gwiaździak IV stopnia, jest najczęstszym i najbardziej agresywnym podtypem z medianą przeżycia 12-15 miesięcy1,2. Inwazja rozlanych gwiaździaków, zwłaszcza GBM, wyklucza całkowitą resekcję chirurgiczną, ogranicza skuteczność terapii adjuwantowych i nieuchronnie prowadzi do nawrotu po leczeniu3. U pacjentów początkowo występuje albo gwiaździak de novo (pierwotny), albo gwiaździak o niższym stopniu złośliwości, który nieuchronnie postępuje do (wtórnego) GBM4. GBM jest genomowo heterogeniczny i charakteryzuje się wzajemnie wykluczającymi się i współwystępującymi mutacjami w genach, które rządzą trzema podstawowymi szlakami sygnałowymi: punktem kontrolnym cyklu komórkowego G1 / S (Rb), receptorową kinazą tyrozynową (RTK) i szlakami TP53 5-7. GBM składa się z czterech podtypów genomowych o odrębnych profilach ekspresji, które przypominają różne typy komórek mózgowych, co sugeruje, że na podtyp GBM wpływa komórka, z której pochodzi6,8,9. Potrzebne są lepsze modele gwiaździaków, aby określić rolę określonych kombinacji mutacji w określonych typach komórek podczas patogenezy gwiaździaka. Wykorzystanie tych modeli do bardziej efektywnego przedklinicznego opracowywania leków ostatecznie przyczyni się do poprawy wyników leczenia pacjentów. Obecne modele gwiaździaków obejmują ustalone linie komórek ludzkich, ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), genetycznie zmodyfikowane normalne ludzkie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste (NSC) oraz genetycznie zmodyfikowane myszy (GEM)10-14. Opracowaliśmy alternatywny, niezarodkowy model GEM (nGEM)15 wykorzystujący pierwotne komórki mózgowe – astrocyty korowe i NSC – pobrane z GEM zawierające różne kombinacje floksowanych alleli onkogennych. Celem było wygenerowanie modeli gwiaździaków z genetycznie zdefiniowanymi komórkami, które można by scharakteryzować fenotypowo zarówno in vitro, jak i in vivo, i potencjalnie wykorzystać do przedklinicznego opracowania leków u myszy kompetentnych immunologicznie.

Uznane linie komórek ludzkich są najczęściej używanym modelem patogenezy gwiaździaka i odpowiedzi na leki in vitro i in vivo. Są one technicznie proste, szeroko dostępne i mają zdefiniowaną kinetykę i rakotwórczość po ortotopowym ksenoprzeszczepie u myszy z niedoborem odporności10,11,16-18. Ich wady obejmują niezdolność do generowania ustalonych linii komórkowych z gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości, ograniczając badanie tylko do gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości; brak zdefiniowanej komórki pochodzenia; obecność złożonych nieprawidłowości genomowych, często z profilami genomowymi, które znacznie różnią się od oryginalnej próbki pobranej od pacjenta; oraz podatność na dryf fenotypowy i genotypowy podczas hodowli seryjnej w surowicy11,17,19-22. Fenotypowe konsekwencje poszczególnych mutacji onkogennych w ustalonych ludzkich liniach komórkowych GBM mogą być maskowane przez mnogość nieprawidłowości, które są faktycznie obecne, co często uniemożliwia wyjaśnienie bezpośrednich konsekwencji genotypowo-fenotypowych.

PDX są generowane przez podskórne przechodzenie izolowanych przez pacjenta komórek gwiaździaka u myszy z niedoborem odporności lub poprzez ich hodowlę jako nieprzylegające sferoidy w określonym, wolnym od surowicy pożywce przed wstrzyknięciem ortotopowym do mózgów myszy z niedoborem odporności12,23. PDX dokładniej utrzymuje krajobraz genomiczny ludzkich gwiaździaków, ale podobnie jak w przypadku ustalonych ludzkich linii komórkowych, fenotypowy efekt poszczególnych mutacji onkogennych może być maskowany ze względu na ich złożoność genomową19,24. Aby określić fenotypowe konsekwencje określonych mutacji onkogennych, szczególnie w odpowiedzi na nowe terapie, często wykorzystuje się panele ustalonych ludzkich linii komórkowych lub PDX w celu ustalenia korelacji genotyp-fenotyp, wykazania możliwości uogólnienia i zminimalizowania prawdopodobieństwa wystąpienia efektów specyficznych dla linii komórkowej. Podczas gdy PDX dokładnie podsumowuje histopatologiczne cechy charakterystyczne gwiaździaków u ludzi, w tym inwazję, ksenoprzeszczepy ortotopowe ustalonych linii komórek ludzkich na ogół nie21,23,25. Dodatkowo, normalne ludzkie astrocyty i NSC zostały genetycznie zmodyfikowane ze zdefiniowanymi mutacjami onkogennymi w celu modelowania nowotworzenia gwiaździaka in vitro i in vivo13,14,26. Komórki te nie mają złożoności genomowej ustalonych ludzkich linii komórkowych i PDX i dokładnie podsumowują histopatologię ludzkiego gwiaździaka, ale wymagają ksenoprzeszczepu u gryzoni z niedoborem odporności in vivo. Ponieważ wszystkie modele komórek ludzkich wymagają gospodarzy gryzoni z niedoborem odporności, aby zapobiec odrzuceniu ksenoprzeszczepu za pośrednictwem układu odpornościowego, modele te nie są w stanie odtworzyć natywnych interakcji guz-zrąb w systemie syngenicznym i nie mają nienaruszonego układu odpornościowego, co ogranicza badania przedkliniczne terapii ukierunkowanych na zrąb i immunomodulujących10,11.

GEM pozwala na badanie fenotypowych konsekwencji z góry określonych kombinacji mutacji onkogennych in vivo podczas nowotworzenia in situ. Podczas gdy bezwarunkowy GEM ma mutacje we wszystkich tkankach podczas rozwoju, warunkowy GEM ma floksowane allele onkogenne, które umożliwiają celowanie w mutacje poprzez ograniczenie rekombinacji za pośrednictwem Cre do określonych typów komórek poprzez zastosowanie promotorów specyficznych dla typu komórki10,11,15,18. Gwiaździak warunkowy GEM został wykorzystany do wyjaśnienia funkcjonalnych ról mutacji onkogennych w różnych typach komórek w nienaruszonym mózgu11. Przedkliniczna użyteczność glejakogenezy in situ przy użyciu warunkowego GEM jest ograniczona przez szereg czynników, w tym: 1) brak korelatu in vitro, 2) trudności w generowaniu dużych kohort myszy o złożonych genotypach, 3) długie opóźnienie rozwoju guza in situ, 4) i stochastyczna progresja guza. Ponieważ nowotworzenie in situ nie ma odpowiadającego mu modelu in vitro, testy narkotykowe in vitro nie mogą być przeprowadzane przy użyciu konwencjonalnych warunkowych modeli GEM. W przeciwieństwie do innych nowotworów, warunkowe modele gwiaździaków GEM rzadko są indukowane przez pojedyncze mutacje onkogenne11. W związku z tym do wygenerowania warunkowego GEM z wieloma mutacjami onkogennymi potrzebne są złożone schematy hodowlane. Co więcej, inicjacja gwiaździaka następuje ze zmienną penetracją po długim okresie utajenia w tych modelach, podczas gdy progresja do gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości zwykle zachodzi w niejednolity, stochastyczny sposób i ostatecznie prowadzi do powstania guzów o złożonych krajobrazach genomowych i kinetyce szybkiego wzrostu27,28. Zmienna penetracja i stochastyczny charakter progresji nowotworu złośliwego w warunkowych modelach GEM wymaga, aby poszczególne myszy były badane przesiewowo za pomocą obrazowania radiograficznego w celu wykrycia obecności i lokalizacji gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości przed włączeniem ich do przedklinicznych badań klinicznych. Podsumowując, ograniczenia te utrudniają generowanie i testowanie dużych kohort warunkowych GEM wymaganych do przedklinicznych testów leków.

System RCAS-tva GEM, który wykorzystuje ptasie wektory retrowirusowe (RCAS) do infekowania GEM zaprojektowanego do ekspresji receptora wirusowego (tva) na określonych typach komórek nerwowych, był szeroko stosowany do modelowania nowotworów gwiaździaków11. W przeciwieństwie do warunkowego GEM, ten model umożliwia wprowadzanie wielu mutacji onkogennych w określonych typach komórek bez konieczności stosowania skomplikowanych schematów hodowlanych. Jest jednak ograniczony przez zmienną penetrację, wymóg aktywnego podziału komórek w celu osiągnięcia integracji wirusa oraz losowe wprowadzanie transgenów do genomu gospodarza29.

Modele GEM bez linii zarodkowej (nGEM), które wykorzystują komórki zebrane z GEM, stają się coraz ważniejsze, ponieważ pokonują wiele ograniczeń innych systemów modelowych15. Rola inicjowania typu komórki i współwystępujących mutacji w patogenezie gwiaździaka jest trudna do określenia przy użyciu ustalonych ludzkich linii komórkowych GBM lub PDX, ponieważ pochodzą one z guzów w końcowym stadium, które zgromadziły rozległe mutacje genetyczne w nieokreślonych typach komórek w trakcie progresji nowotworu. W przeciwieństwie do tego, wszystkie stopnie gwiaździaków mogą być modelowane za pomocą nGEM poprzez indukowanie określonych mutacji genetycznych w określonych oczyszczonych typach komórek mózgowych11,30. W ten sposób wpływ określonych mutacji genetycznych i typu komórki na fenotypy komórkowe i molekularne można określić in vitro i in vivo. Podobnie jak w przypadku ustalonych ludzkich linii komórkowych GBM, wstępne testy leków in vitro z wykorzystaniem nGEM mogą być wykorzystane do ustalenia priorytetów leków do testów in vivo z wykorzystaniem tych samych komórek. Nowotworzenie in vivo można następnie określić poprzez ortotopowe przeszczepy allograficzne komórek nGEM do mózgów kompetentnych immunologicznie syngenicznych rodzeństwa z miotu30. Te ortotopowe modele przeszczepów allogenowych umożliwiają zatem testowanie in vivo nie tylko konwencjonalnych terapii cytotoksycznych i celowanych, ale także terapii immunomodulacyjnych i ukierunkowanych na zręb. Wreszcie, rolę mikrośrodowiska w inicjacji i progresji guza można określić, porównując wyniki między nGEM a konwencjonalnymi modelami GEM wykorzystującymi te same mutacje w tych samych typach komórek.

My i inni opracowaliśmy gwiaździaka nGEM przy użyciu komórek pierwotnych - astrocytów, NSC lub komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) - pobranych z GEM30-34. Przesłanką do opracowania gwiaździaka nGEM było stworzenie modelu do określenia fenotypowych konsekwencji mutacji onkogennych w określonych typach komórek, który mógłby potencjalnie zostać wykorzystany do przedklinicznych testów leków in vitro i in vivo u zwierząt kompetentnych immunologicznie. Pobraliśmy fenotypowo astrocyty korowe WT i NSC z nieeksprymującego Cre, warunkowego GEM utrzymywanego na tle >94% C57 / Bl6 z floksowanym szlakiem RB - Rb1loxP / loxP lub TgGZT121 - i floxowanym szlakiem RTK / RAS / PI3K - Nf1loxP / loxP, KrasG12D, PtenloxP / loxP - geny w różnych kombinacjach35-39. Przeprowadziliśmy indukcję genetyczną in vitro za pomocą wektorów adenowirusowych kodujących rekombinazę Cre. Ponieważ zbiory astrocytów korowych zawierają mieszaninę typów komórek, użyliśmy wektorów Ad5GFAPCre lub dominujących transgenów onkogennych, takich jak TgGZT121 napędzanych przez ludzki promotor GFAP, aby wzbogacić astrocyty korowe GFAP + w tych kulturach. Określiliśmy fenotypowe konsekwencje mutacji szlaku G1 / S (Rb), MAPK i PI3K w astrocytach korowych i NSC in vitro i in vivo. Aktywowane szlakiem MAPK i PI3K astrocyty z defektem G1 / S naśladowały molekularnie ludzki proneuronalny GBM i po wstrzyknięciu ortotopowym tworzyły guzy w określonej lokalizacji o jednolitej kinetyce wzrostu, krótkich opóźnieniach i histopatologicznych cechach charakterystycznych ludzkiego GBM30. Podłużne monitorowanie wzrostu guza in vivo wspomaga przedkliniczne testowanie leków poprzez normalizację kohort leczenia i ilościową analizę wzrostu guza w odpowiedzi na leczenie40. Określiliśmy kinetykę wzrostu guza za pomocą podłużnego obrazowania bioluminescencyjnego myszy, którym wstrzyknięto astrocyty korowe z ekspresją lucyferazy. W związku z tym astrocyty korowe i NSC pochodzące z warunkowego GEM stanowią wykonalny system modelowy do definiowania funkcjonalnych konsekwencji mutacji związanych z gwiaździakiem oraz potencjalny system modelowy do przedklinicznego opracowywania leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Północnej Karoliny.

1. Hodowla astrocytów korowych od noworodków myszy

  1. preparat
    1. Zgnieć 2-3 delikatne chusteczki i umieść na dnie kolby zawierającej 70% etanolu. Umieść nożyczki preparacyjne, zakrzywione kleszcze i 2 pary prostych mikrokleszczyków w tej kolbie. Chusteczki są używane, aby uniknąć zginania mikrokleszczy.
    2. Dodać 1 ml HBSS do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm. Przygotuj osobne danie dla każdego zwierzęcia i utrzymuj naczynia na lodzie.
    3. Znieczulaj zwierzęta zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    4. Ogrzać 7 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną (kompletny DMEM) dla każdego zwierzęcia w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 1.1.1-1.1.4 zajmą ~15 minut.
  2. Pobieranie tkanek
    1. Złóż w ofierze nowonarodzoną mysz (dzień 1-3) zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    2. Wyjmij nożyczki preparacyjne z etanolu, pozwól im ociekać do wyschnięcia i wykonaj strzałkowe nacięcie w skórze nad czaszką od rdzenia kręgowego do nosa.
    3. Wykonaj nacięcie w czaszce wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od rdzenia kręgowego i rozciągając się poza opuszki węchowe. Uważaj, aby końcówki nożyczek znajdowały się blisko wewnętrznej powierzchni czaszki, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki mózgowej.
    4. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie oderwij każdą półkulę czaszki bocznie od mózgu.
    5. Za pomocą prostych mikrokleszczyków delikatnie uszczypnij grzbietową część każdej półkuli korowej i umieść ją w naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym HBSS. Uważaj, aby ominąć móżdżek i opuszkę węchową. Nie pobieraj żadnych tkanek poniżej ciała modzelowatego.
    6. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i 2 par mikrokleszczyków delikatnie usuń opony mózgowe z każdej półkuli korowej. Umieść naczynie z kulturą tkankową z powrotem w lodzie, aż do rozpoczęcia homogenizacji tkanek.
    7. Powtórzyć kroki od 1.2.1 do 1.2.6 dla każdego dodatkowego zwierzęcia. UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 1.2.1-1.2.7 zajmą ~30 min.
  3. Homogenizacja tkanek
    1. Używając czystej żyletki, pokrój półkule korowe w drobną kostkę i przenieś płytkę do kaptura do hodowli tkankowych.
    2. Przenieś pokrojoną w kostkę tkankę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyć płytkę 1 ml lodowatego HBSS i przenieść do probówki zawierającej chusteczkę.
    3. Poczekaj, aż tkanka osiądzie na dnie probówki, a następnie ostrożnie usuń nadmiar HBSS za pomocą pipety.
    4. Dodać 2 ml trypsyny/EDTA o temperaturze pokojowej. Pipeta ~10x pipetą 1 ml w celu dalszej dysocjacji komórek.
    5. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut. Ostrożnie mieszać przez odwrócenie co 5 minut.
    6. Dodaj 3 ml kompletnego DMEM, aby zahamować trypsynę. Pipetę ~10x pipetą 1 ml wymieszać roztwór.
    7. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie zasysać podłoża, ponieważ osad może być luźny.
    9. Zawiesić osad w 4 ml pełnego DMEM o temperaturze 37 °C. Przenieść zawiesinę komórek do zakręcanej kolby do hodowli tkankowych o średnicy 75 cm. UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 1.3.1-1.3.9 zajmą ~50 minut.
    10. Około 16 godzin po pobraniu astrocytów przemyć kolbę 4 ml HBSS o temperaturze 37 °C, a następnie dodać 4 ml pełnego DMEM o temperaturze 37 °C. Utrzymuj astrocyty korowe w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . UWAGA: Etap mycia jest ważny dla usunięcia nieprzylegających komórek i zanieczyszczeń z naczynia hodowlanego.
    11. Gdy kultura jest w ~95% zlewna, wstrząsnąć przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , usunąć pożywkę zawierającą oderwane komórki, a następnie umyć kolbę 4 ml HBSS o temperaturze 37 °C. Dodać 4 ml kompletnego DMEM o temperaturze 37 °C i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . UWAGA: Ten krok jest ważny dla wzbogacenia kultur astrocytów korowych, ponieważ zanieczyszczające komórki progenitorowe mikrogleju i oligodendrocytów odłączają się w tej procedurze i są usuwane z hodowli41.
    12. Powtórz kroki 1.3.1-1.3.11 dla każdego zwierzęcia.
  4. Indukcja rekombinacji genetycznej
    1. Po upływie 24 godzin od zakończenia etapu 1.3.11 zastąpić pożywkę 2 ml kompletnego DMEM o temperaturze 37 °C. Dodać 1 ml roztworu SCM o temperaturze 37 °C zawierającego 1 μl >10,10 pfu/ml Ad5CMVCre lub Ad5GFAPCre. Inkubować przez 6 godzin w temperaturze 32 °C w 5% CO2 . UWAGA: Stosuj środki ostrożności BSL2 podczas obchodzenia się z rekombinowanym adenowirusem.
    2. Usunąć pożywkę zawierającą wirusa i dodać do astrocytów korowych cały DMEM o temperaturze 37 °C bez wirusa. UWAGA: Stosuj środki ostrożności BSL2 podczas obchodzenia się z rekombinowanymi adenowirusami i wyrzuć pożywki zawierające wirusa zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. UWAGA: W przypadku 5 kultur astrocytów kroki 1.4.1 - 1.4.3 zajmą ~15 minut, nie licząc 6-godzinnej inkubacji.
    3. Rozszerzenie kultur astrocytów korowych w celu charakterystyki in vitro i in vivo. UWAGA: Określić obecność mutacji po rekombinacji Cre za pomocą PCR ze starterami specyficznymi dla rekombinowanego genu lub przez immunobloty dla specyficznego zmutowanego białka lub jego konsekwencji sygnalizacyjnych. Czas potrzebny do stabilizacji fenotypowej kultur astrocytów korowych po rekombinacji Cre będzie zależał od zastosowanych mutacji i musi być określony empirycznie (ryc. 2).

2. Hodowla nerwowych komórek macierzystych od noworodków myszy

  1. preparat
    1. Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować 4 ml roztworu trawiącego na mózg, dodając 3,1 mg papainy i 1,3 mg cysteiny do 4 ml pożywki dysocjacyjnej - 98 mM Na2SO4, 30 mM K2SO4, 5,8 mM MgCl2, 0,25 mM CaCl2, 1 mM HEPES (z 1 M HEPES pH 7,4 zapasu) 20 mM glukozy, 0,001% czerwieni fenolowej i 0,125 mM NaOH. Dodanie papainy i cysteiny do pożywki dysocjacyjnej zmieni kolor roztworu na żółty.
    2. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Mieszać okresowo przez inwersję.
    3. Dodawać kroplami 0,1 M NaOH, aż roztwór mineralizujący powróci do jasnoczerwonego koloru.
    4. W kapturze do hodowli tkankowej sterylnie przefiltruj roztwór wytrawiający za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów 0,22 μm). Utrzymuj roztwór trawiący na lodzie.
    5. Przygotować 50 ml pożywki z komórek macierzystych (SCM), mieszając 44,5 ml pożywki podstawowej NSC, 5 ml suplementu NSC, 0,5 ml penicyliny-streptomycyny, 50 μl 0,2% heparyny, 10 μl 100 μg/ml EGF i 10 μl 100 μg/ml bFGF. SCM jest stabilny przez 1 tydzień przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotować kompletny HBSS (cHBSS) mieszając 50 ml 10x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glukozy, 5 ml 100 mM CaCl2, 5 ml 100 mMMgSO4 i 2 ml 1 M NaHCO3. Doprowadzić całkowitą objętość do 500 ml za pomocą ddH2O.
    7. Filtr sterylizować cHBSS za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    8. Zgnieć 2-3 delikatne chusteczki i umieść na dnie kolby zawierającej 70% etanolu. Umieść nożyczki preparacyjne, zakrzywione kleszcze i 2 pary prostych mikrokleszczyków w tej kolbie. Chusteczki są używane, aby uniknąć zginania mikrokleszczy. UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 2.1.1-2.1.8 zajmą ~45 minut.
  2. Pobieranie tkanek
    1. Poświęć myszy noworodkowe (dzień 1-3) zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    2. Wyjmij nożyczki preparacyjne z 70% etanolu, pozwól im wyschnąć i wykonaj strzałkowe nacięcie w skórze nad czaszką od rdzenia kręgowego do nosa.
    3. Wykonaj nacięcie w czaszce wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od rdzenia kręgowego i rozciągając się poza opuszki węchowe. Uważaj, aby końcówki nożyczek znajdowały się blisko wewnętrznej powierzchni czaszki, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki mózgowej.
    4. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie oderwij każdą półkulę czaszki bocznie od mózgu.
    5. Delikatnie wyjmij cały mózg i umieść w lodowatym cHBSS.
    6. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ostrożnie usuń opony mózgowe z mózgu za pomocą drobnych narzędzi preparacyjnych.
    7. Umieść mózg na jego dolnej powierzchni i usuń móżdżek / tyłomózgowie i opuszkę węchową / korę czołową za pomocą pionowych (koronalnych) cięć za pomocą skalpela w rozmiarze 11.
    8. Obróć pozostały mózg o 90°, aby umieścić go na części ogonowej, generując w ten sposób koronalny widok mózgu. Zlokalizuj komory boczne.
    9. Wytnij przekrój sześcienny zawierający strefę podkomorową (SVZ).
    10. Przenieś tkankę zawierającą SVZ do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm ze świeżym, lodowatym cHBSS i zmieloną tkanką za pomocą skalpela w rozmiarze 11.
    11. Przenieść zmieloną tkankę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Umieść rurkę na lodzie.
    12. Umyj szalkę Petriego 1-2 ml lodowatego cHBSS. Przenieść roztwór do przemywania do probówki zawierającej chusteczkę.
    13. W razie potrzeby powtórz kroki 2.2.1-2.2.12 z dodatkowymi noworodkami na myszach. Przenieś wszystkie probówki o pojemności 15 ml do kaptura do hodowli tkankowej na pozostałą część protokołu. UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 2.2.1 - 2.2.13 zajmą ~45 minut.
  3. Homogenizacja tkanek
    1. Umieścić roztwór wytrawiający (przygotowany w kroku 2.1.1) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut. Podgrzej również 2 ml SCM na mózg w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Ostrożnie usunąć sklarowany osad z tkanki mielonej za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie aspirować.
    3. Dodać 2 ml roztworu wytrawiającego o temperaturze 37 °C na probówkę o pojemności 15 ml i dokładnie wymieszać przez odwrócenie.
    4. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Mieszać metodą inwersji co 5 minut.
    5. Dodać kolejne 2 ml roztworu do wytrawiania o temperaturze 37 °C do każdej probówki i powtórzyć krok 2.3.4.
    6. Pozwolić, aby komórki opadły grawitacyjnie na dno probówki, a następnie usunąć supernatant z trawionej tkanki za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    7. Dodać 2 ml 10 μM E-64 rozcieńczonego w cHBSS i dokładnie wymieszać przez odwrócenie.
    8. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    9. Pozwól komórkom opaść grawitacyjnie na dnie probówki, a następnie usuń supernatant z trawionej tkanki.
    10. Dodać 1 ml cHBSS o temperaturze 37 °C i homogenizować za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml (~20 uderzeń). Należy unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza podczas homogenizacji tkanek.
    11. Przepuścić homogenat tkankowy przez sitko o wielkości porów 40 μm, a następnie przepłukać sitko 5 ml cHBSS o temperaturze 37 °C.
    12. Odwirować homogenat tkankowy o stężeniu 125 x g przez 5 minut.
    13. Usunąć 95% supernatantu za pomocą pipety o pojemności 1 ml, nie naruszając osadu komórkowego. Ostrożnie zawiesić osad komórkowy w 200 μl 37 °C SCM za pomocą końcówki do pipety 200 μl.
    14. Dodać 1,8 ml smm o temperaturze 37 °C i przenieść zawiesinę komórek do studzienki sterylnej płytki 6-dołkowej. UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 2.3.1-2.3.14 zajmą ~75 minut.
  4. Hodowla nerwowych komórek macierzystych
    1. Uzupełnij pożywkę po 3 dniach, dodając kolejne 2 ml smku o temperaturze 37 °C.
    2. Po 7 dniach przenieś neurosfery do probówki o pojemności 15 ml i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie przez >5 minuty.
    3. Usunąć sklarowany nad osadem i dodać 2 ml sm. o temperaturze 37 °C.
    4. Przenieś neurosfery do nowej studzienki na płytce 6-dołkowej.
    5. Dodawać 2 ml spm o temperaturze 37 °C co 3-4 dni i całkowicie zmieniać podłoże co 7 dni.
    6. Jeśli neurosfery mają > średnicy 100 μm, ostrożnie zdysocjuj roztworem dysocjacyjnym komórek macierzystych i ponownie pokryj NSC w pożądanej gęstości komórek.
  5. Indukcja rekombinacji genetycznej
    1. Dodać 1 ml SCM o temperaturze 37 °C zawierającej 1 μl >10,10 pfu/ml Ad5CMVCre lub Ad5GFAPCre do 2 ml SCM znajdujących się obecnie na komórkach. UWAGA: Stosuj środki ostrożności BSL2 podczas obchodzenia się z rekombinowanym adenowirusem.
    2. Inkubować przez 6 godzin w temperaturze 32 °C w 5% CO2 .
    3. Przenieś SCM z neurosferami do probówki o pojemności 15 ml i pozwól kulkom osiąść grawitacyjnie przez 5 minut.
    4. Usunąć supernatant najpierw za pomocą pipety o pojemności 1 ml, a następnie pipety o pojemności 200 μl. UWAGA: Stosuj środki ostrożności BSL2 podczas obchodzenia się z rekombinowanymi adenowirusami i wyrzuć pożywki zawierające wirusa zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    5. Dodać 2 ml SCM o temperaturze 37 °C bez wirusa do NSC, a następnie przenieść do płytki 6-dołkowej. UWAGA: W przypadku 5 kultur NSC kroki 2.5.1-2.5.5 zajmą ~15 minut, nie licząc 6-godzinnej inkubacji.
    6. Następnego dnia powtórz kroki 2.5.1-2.5.5, a następnie, jeśli to konieczne, przejdź przez neurosferę. Kule mogą być teraz rozszerzane przez 2-3 pasaże przed charakterystyką in vitro i wstrzyknięciem ortotopowym do mózgów myszy in vivo. UWAGA: Określić obecność mutacji po rekombinacji Cre za pomocą PCR ze starterami specyficznymi dla rekombinowanego genu lub przez immunobloty dla specyficznego zmutowanego białka lub jego konsekwencji sygnalizacyjnych. Czas potrzebny do stabilizacji fenotypowej kultur NSC po rekombinacji Cre będzie zależał od zastosowanych mutacji i musi być określony empirycznie (ryc. 2 i 3).

3. Ortotopowe wstrzykiwanie rekombinowanych komórek do mózgu biorców myszy nieimmunokompetentnych

  1. Preparat z 5% metylocelulozy
    1. Rozpuścić 5 g 15 cS metylocelulozy w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 ml w zakrętce o pojemności 100 ml. Dodawać proszek powoli, mieszając w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zbrylaniu. Mieszanie w temperaturze 4 °C może zająć do 24 godzin, zanim cała metyloceluloza dostanie się do roztworu.
    2. Zważ butelkę i zapisz wagę.
    3. Autoklaw 5% roztworu metylocelulozy. Po autoklawizowaniu metyloceluloza stanie się żelem półstałym.
    4. Zważ butelkę i oblicz wagę utraconą podczas autoklawowania.
    5. Aseptycznie dodawać 1 ml sterylnej wody na każdy utracony gram wagi.
    6. Ułóż na lodzie i dodaj 50 ml lodowatego lodu 2x DMEM.
    7. Mieszać przez noc za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C. Użyć sterylnej techniki, aby podzielić 5% roztwór metylocelulozy na 20 ml podwielokrotności. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy lub do momentu wygaśnięcia 2x DMEM. UWAGA: Przygotowanie 5% roztworu metylocelulozy w krokach 3.1.1-3.1.7 zajmie ~2,5 dnia.
  2. Przygotowanie astrocytów korowych do wstrzyknięcia
    1. Zbierz astrocyty korowe, gdy ~ 90% zlewa się.
    2. Aby zebrać, należy odessać cały DMEM i umyć płytki o równej objętości 37 °C HBSS.
    3. Dodaj tyle trypsyny, aby przykryć talerz. Delikatnie przechyl i postukaj w płytkę, aż komórki zaczną się odłączać.
    4. Dezaktywować trypsynę o równej objętości 37 °C całkowicie DMEM.
    5. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umyć płytkę tą samą objętością 37 °C pełnym DMEM, użytym w ppkt 3.2.4.
    6. Przenieść pożywkę płuczącą do probówki zawierającej komórki. Wirować przy 200 x g przez 3 min.
    7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pełnego DMEM o temperaturze 37 °C.
    8. Policz zawiesinę komórek za pomocą hemocytometru lub innego odpowiedniego licznika komórek, aby określić liczbę komórek/μl.
    9. Przenieś żądaną liczbę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 3 min.
    10. Zawiesić komórki w 800 μl pełnego DMEM o temperaturze 37 °C. Określić objętość osadu komórkowego (całkowita objętość zawiesiny komórek – 800 μl). UWAGA: Niezbędne jest uzyskanie dokładnego stężenia komórek do wstrzykiwań. W związku z tym na tym etapie należy określić objętość osadu komórkowego w celu obliczenia objętości 5 % metylocelulozy, która ma zostać dodana w kroku 3.2.12.
    11. Przenieść komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie wirować przy 200 x g przez 3 minuty.
    12. Odessać supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić astrocyty korowe w odpowiedniej objętości lodowatej 5% metylocelulozy (pożądana objętość całkowita – objętość osadu komórkowego), aby uzyskać pożądaną liczbę komórek/μl.
    13. Umieść komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
    14. Umieścić szklaną strzykawkę o pojemności 250 μl w dozowniku powtarzającego się antygenu, a następnie umieścić igłę 18 G na strzykawce.
    15. Powoli wyjmować tłok z igłą w korowej zawiesinie astrocytów; nad komórkami pojawi się pęcherzyk powietrza, który musi zostać usunięty, ponieważ pęcherzyki powietrza będą się ściskać i zmniejszać objętość faktycznie wstrzykniętą do mózgu.
    16. Przytrzymaj końcówkę igły tuż nad zawiesiną astrocytów korowych i szybko wepchnij tłok. Pęcherzyk powietrza będzie poruszał się szybciej niż zawiesina komórek i zostanie w większości wydalony.
    17. Powtarzać krok 3.2.16 aż do usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza z igły.
    18. Napełnić strzykawkę do około ~200 μl, następnie przytrzymać igłę do góry i pociągnąć tłok do tyłu, aż się zatrzyma. Małe pęcherzyki powietrza można usunąć, przytrzymując końcówkę igły do góry i szybko wciskając tłok w około 50 μl, a następnie powoli wycofując się do pełnej pojemności.
    19. Trzymaj końcówkę pionowo i powtórz krok 3.2.18 4-5 razy.
    20. Wyrzucić igłę o rozmiarze 18 i założyć igłę 27 G na strzykawkę.
    21. Naciskać przycisk na dozowniku antygenu, aż płyn zostanie usunięty z igły. UWAGA: Dla 1 linii komórek astrocytów kroki 3.2.1-3.2.21 zajmą ~60 minut.
  3. Przygotowanie NSC do wstrzykiwań
    1. Gdy neurosfery osiągną > średnicę 100 μm, przenieś do probówek o pojemności 15 ml i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie przez >5 minuty.
    2. Usunąć supernatant i zdysocjować neurosfery delikatnym odczynnikiem dysocjacyjnym, takim jak roztwór dysocjacyjny komórek macierzystych lub akutaza zgodnie z instrukcjami producenta lub %0,05 trypsyny-EDTA, jak opisano42.
    3. Zahamować działanie odczynników dysocjacyjnych zgodnie z instrukcjami producenta bez narażania NSC na działanie surowicy. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
    4. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml cHBSS o temperaturze 37 °C w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki.
    5. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub innego odpowiedniego licznika komórek, aby określić liczbę komórek/μl.
    6. Przenieść żądaną ilość NSC do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
    7. Zawiesić komórki w 800 μl HBSS o temperaturze 37 °C. Określić objętość osadu komórkowego (całkowita objętość zawiesiny komórek – 800 μl). UWAGA: Niezbędne jest uzyskanie dokładnego stężenia komórek do wstrzykiwań. W związku z tym na tym etapie należy określić objętość osadu komórkowego w celu obliczenia objętości 5% metylocelulozy, która ma zostać dodana w kroku 3.3.9.
    8. Przenieść komórki do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie wirować przy 100 x g przez 5 minut.
    9. Odessać supernatant i zakończyć przygotowanie komórek do wstrzyknięcia ortotopowego, jak w ppkt 3.2.12-3.2.21. UWAGA: Dla 1 linii komórkowej NSC kroki 3.3.1-3.3.9 zajmą ~60 min.
  4. Przygotowanie myszy do wstrzyknięcia
    1. Znieczulić zwierzę biorcy poprzez wstrzyknięcie dożylnie 250 mg/kg avertin (2,2,2 tribromoetanolu) lub 100 mg/kg ketaminy plus 10 mg/kg ksylazyny, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi IACUC. UWAGA: Wykorzystuje się tu myszy w wieku 3-6 miesięcy jako gospodarzy przeszczepu allogenicznego. Myszy w różnym wieku mogą być wykorzystane do zbadania mikrośrodowiskowego wpływu rozwojowego wieku mózgu na nowotworzenie nowotworów.
    2. Ogol skórę głowy w miejscu nacięcia maszynką do strzyżenia lub nożyczkami.
    3. Wysterylizuj miejsce operacyjne za pomocą 3 naprzemiennych wacików zawierających 70% etanol i betadynę.
    4. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym utratą odruchu mrugania.
    5. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału (szczypania palców). UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 3.4.1-3.4.5 zajmą ~15 minut.
  5. Implantacja ortotopowa
    1. Zabezpiecz zwierzę w ramie stereotaktycznej.
    2. Wykonaj nacięcie nad szwem strzałkowym o długości około 0,5 cm między uszami a oczami.
    3. Zlokalizuj przecięcie szwów koronalnych i strzałkowych (Bregma), a także przecięcie szwów lambdoidalnych i strzałkowych (Lambda). Upewnij się, że Bregma i Lambda znajdują się w tej samej płaszczyźnie poziomej.
    4. Przymocować strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek i dozownik powtarzającego się antygenu do ramki stereotaktycznej nad głową. Doprowadzić końcówkę igły 27 G do kontaktu z lekiem Bregma. Jest to początek, który będzie używany do manipulowania współrzędnymi trójwymiarowymi.
    5. Lekko podnieść igłę z powierzchni czaszki i przesunąć się o 2 mm w bok i 1 mm rostralnie od Bregmy.
    6. Ostrożnie opuścić igłę przez czaszkę do miejsca przeznaczenia 4 mm brzusznie od Bregmy. UWAGA: Wykorzystaliśmy te współrzędne stereotaktyczne, aby celować w zwoje podstawy. Różne współrzędne stereotaktyczne mogą być wykorzystane do zbadania mikrośrodowiskowego wpływu różnych regionów mózgu na nowotworzenie nowotworów.
    7. Wstrzyknąć 5 μl zawiesiny komórek, aktywując jednorazowo dozownik powtarzającego się antygenu. Pozostawić igłę na miejscu przez 2 minuty, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia śródczaszkowego.
    8. Powoli wyjmować igłę przez 30 sekund. Za pomocą bawełnianego wacika uciskać krwawienie, które może wystąpić.
    9. Przybliż krawędzie rany i zamknij nacięcie za pomocą kleju tkankowego. Podawać 20 μl lidokainy podskórnie w miejsce nacięcia. UWAGA: W przypadku 5 myszy kroki 3.5.1-3.5.9 zajmą ~50 min. UNC IACUC zatwierdziło pooperacyjne stosowanie wyłącznie znieczulenia miejscowego. Zaleca się konsultację z lokalną instytucją IACUC w sprawie wymagań dotyczących pooperacyjnego stosowania leków przeciwbólowych po tej procedurze.
  6. Opieka pooperacyjna
    1. Umieść zwierzęta w czystej, ciepłej klatce, aby mogły dojść do siebie. Zwierząt nie należy umieszczać bezpośrednio w ściółce, ponieważ może dojść do przypadkowego zachłyśnięcia.
    2. Obserwuj zwierzęta pod kątem powrotu do normalnego zachowania, takiego jak pielęgnacja, jedzenie i wypróżnianie. UWAGA: Powrót do normalnego zachowania może zająć ~60 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy model nGEM z wykorzystaniem astrocytów korowych i NSC pozyskanych z noworodkowych GEM posiadających floksowane warunkowe allele onkogenne, które mogą być charakteryzowane fenotypowo in vitro oraz in vivo (Rycina 1). Aby zbadać konsekwencje mutacji onkogennych specyficznie w astrocytach korowych in vitro, kluczowe jest najpierw wzbogacenie populacji astrocytów. Materiał z astrocytów korowych zawiera mieszaninę mikrogleju, astrocytów, oligodendrocytów, OPC i neuronó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznymi krokami w celu zapewnienia prawidłowego zbioru i hodowli astrocytów korowych są: 1) wycięcie kory bez pobierania tkanki poniżej ciała modzelowatego, 2) usunięcie opon mózgowych, 3) dokładna dysocjacja komórek i 4) wzbogacenie astrocytów GFAP+ . Chociaż zastosowaliśmy metody mechaniczne (wstrząsanie) i genetyczne (ograniczenie rekombinacji genetycznej za pomocą wektora Ad5GFAPCre lub wykorzystanie dominującego transgenu transformującego (TgGZT121) pod kontrol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM jest badaczem klinicznym Damon Runyon-Genentech. Praca ta była częściowo wspierana przez granty dla CRM z Fundacji Badań nad Rakiem Damona Runyona (CI-45-09), Departamentu Obrony (W81XWH-09-2-0042) i Funduszu Badań nad Rakiem Uniwersytetu Karoliny Północnej (UCRF). Autorzy pragną podziękować Danielowi Rothowi za pomoc w hodowli myszy. Autorzy pragną również podziękować Hannah Chae, Carterowi McCormickowi, Demi Canoutas, Stephanie Gillette i Susannah Krom za pomoc w hodowli tkanek i immunofluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM można również kupić od innych dostawców, w tym GIBCOSigma i Cellgro
Płodowa surowica bydlęca, RegularCellgro35-010-CV
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140122
Ostre nożyczki preparacyjneFisher Scientific08-395
Kleszczyki do chrząstek kciuka, zakrzywioneFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 Kleszcze jubilerskie, drobne, 4Miltex17-301
Etanol (200 dowodów)Decon Labs2710
ŻyletkiVWR55411-050
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x), płynInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Czerwień fenolowaInvitrogen12605-010Inne roztwory trypsyny są również odpowiednie do hodowli astrocytów korowych i naczyń
hodowlanych, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
15 ml ProbówkiBD Biosciences352096
50 ml BDBiosciences352070
Zapas adenowirusaTransfer genów Vector Core, U. IowaAd5CMVCreSklep w 5 & mikro; l podwielokrotności przy -80 °C. Niebezpieczne. Stosować środki ostrożności Bsl2
Siarczan sodu (Na2SO4) Sigma-Aldrich238597
Siarczan potasu (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Chlorek wapnia (CaCl2)Sól
HEPESSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlukozaSigma-AldrichG8270 
Phenol RedSigma-AldrichP3532
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainaWorthingtonLS003127
L-Cysteina-HClSigma-AldrichC1276
Filtr strzykawkowy (0,22 i mikro; m wielkość porów)MilliporeSLGP033NS
Zestaw do proliferacji Neurocult, myszStemcell Technologies5702Ten zestaw zawiera NeuroCult NSC Basal Medium i suplement NeuroCult NSC potrzebny do hodowli
NSC 0,2% roztwór heparynyStemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Siarczan magnezu (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Zrób 10 mM zapasów DMSO, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Płytki 6-dołkoweFisher Scientific07-200-83
Sitko do komórek (40 &mikro; m wielkość porów)Corning352340
Roztwór do dysocjacji komórek macierzystychStemcell Technologies5707Alternatywnie użyj delikatnych roztworów enzymatycznych, takich jak Accutase
Metyloceluloza 15 cPSigma-AldrichM7027
Zmodyfikowany Eagle's Media firmy Dulbecco 2xMiliporeSLM-202-BDo sporządzania 5% roztworu metylocelulozy
1,7 ml Snap Cap Rurka do mikrowirówkiCorning3620
Strzykawka Hamilton, 250 i mikro; l LT bez igłyFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Dozownik antygenuHamilton  83700
Jednorazowe igły 18 GFisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" Igła z końcówką luerFisher Scientific14-826-48
2,2,2-tribromoetanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube Maść okulistycznaFisher Scientific
Model 900 Rama stereotaktycznaKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Klej do tkanek 
Lidokaina ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
Poliklonalne królicze białko kwasowe przeciwglejowe fibrylarne (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerDo obrazowania in vivo
D-Lucyferyna - Sól K+ Podłoże bioluminescencyjnePerkinElmer122796Do obrazowania bioluminescencyjnego in vivo
Zestaw do obrazowania EdU InvitrogenC10340
MSCV Lucyferazy PGK-hygroAddgene18782
potasowa Sigma-Aldrich 746495 NC9689910

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522(2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638(2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modelowanie astrocytomamyszy kondycjonalneadenowirusowy Creallograft ortotopowyobrazowanie bioluminescencyjnerekombinacja genetycznatest tumorigenezybadanie odpowiedzi na leki

Powiązane artykuły