Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

20.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51766

⸱

14 sierpnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Streszczenie

Podczas stanu zapalnego, leukocyty opuszczają krążenie i przechodzą przez śródbłonek, aby zwalczać atakujące patogeny w leżących poniżej tkankach. Proces ten jest znany jako migracja przezśródbłonkowa leukocytów. Opisano dwie drogi przenikania leukocytów przez monowarstwę śródbłonka: drogę parakomórkową, tj. przez połączenia komórka-komórka oraz drogę transkomórkową, tj. przez ciało komórki śródbłonka. Jednak z technicznego punktu widzenia trudno było rozróżnić drogę para- i transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test in vitro do badania rozkładu endogennej kadheryny VE i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji neutrofili w fizjologicznych warunkach przepływu. Przed perfuzją neutrofili komórki śródbłonka krótko potraktowano znakowanymi fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko VE-kadherynie i PECAM-1. Przeciwciała te nie zakłócały funkcji obu białek, co stwierdzono za pomocą wykrywania impedancji elektrycznej komórki-substratu i pomiarów FRAP. Korzystając z tego testu, byliśmy w stanie śledzić rozkład endogennej kadheryny VE i PECAM-1 podczas migracji przezśródbłonkowej w warunkach przepływu i rozróżnić para- i transkomórkowe drogi migracji leukocytów przez śródbłonek.

Wprowadzenie

Efektywna i ściśle kontrolowana transśródbłonkowa migracja leukocytów (TEM) ma kluczowe znaczenie w procesach fizjologicznych, takich jak nadzór immunologiczny i ostre stany zapalne. Jednak w pewnych stanach patofizjologicznych obserwuje się niekontrolowane i nadmierne TEM skutkujące przewlekłymi chorobami zapalnymi (np. reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżyca, astma). Również podczas przerzutów do komórek nowotworowych proces migracji przezśródbłonkowej ma zasadnicze znaczenie dla komórek nowotworowych, które opuszczają krążenie w celu uzyskania przerzutów1-3. Aby specyficznie ingerować w nadmierną ilość leukocytów lub komórek nowotworowych TEM, wymagane jest szczegółowe zrozumienie regulacji tego procesu.

Uważa się, że proces TEM przebiega w różnych etapach. Przełomowe badania, zrecenzowane dwie dekady temu przez Butchera i Springera, doprowadziły do powstania wieloetapowego modelu opisującego proces TEM4,5. Ten model jest nadal aktualny, chociaż uwzględniono kilka dodatkowych kroków6. Alon i wsp.opisywał potrzebę obecności unieruchomionych chemokin na powierzchni śródbłonka7. Ostatnio wykazali, że śródbłonek sam wytwarza chemokiny, które są prezentowane na powierzchni wierzchołkowej śródbłonka8. Co więcej, ta sama grupa zwróciła uwagę na znaczenie warunków przepływu podczas TEM7. Ostatnio pojawiło się kilka publikacji poświęconych dwóm różnym drogom, jakie mogą przebyć leukocyty na końcowym etapie diapedezy TEM. Mogą one przechodzić przez połączenia komórka-komórka, tj. Drogę migracji parakomórkowej, lub przechodzić przez ciało komórki śródbłonka, znane jako droga migracji międzykomórkowej9. Carman i współpracownicy szczegółowo zbadali te szlaki i doszli do wniosku, że leukocyty preferencyjnie wybierają drogę migracji parakomórkowej (90%) nad drogą transkomórkową (10%) podczas przekraczania monowarstwy śródbłonka żyły pępowinowej10. Jednak, gdy wykorzystano komórki śródbłonka o innym pochodzeniu, np. mózgu lub mikrokrążenia, więcej leukocytów korzystało z drogi transkomórkowej (30%)11. Grupa Vestweber wykazała niedawno, że gdy połączenia komórka-komórka nie były w stanie oddzielić się od siebie za pomocą modelu zwierzęcego typu knock-in, zastępując endogenną VE-kadherynę chimerą VE-kadheryna-alfa-katenina, TEM leukocytów był całkowicie zablokowany12. Co zaskakujące, autorzy zauważyli, że TEM był zablokowany w kilku, ale nie we wszystkich tkankach. Ogólnie rzecz biorąc, te eleganckie eksperymenty wykazały, że leukocyty preferowały drogę parakomórkową nad drogą transkomórkową, chociaż sygnały regulacyjne, które wywołują tę decyzję, są nadal nieznane.

Mimo że większość leukocytów preferuje drogę migracji parakomórkowej, nadal trudno jest rozróżnić obie te ścieżki. Ponadto, pomimo kilku badań koncentrujących się na roli połączeń komórka-komórka śródbłonka, dynamika tych połączeń, w szczególności białek połączeniowych VE-kadheryna i PECAM-1, podczas krzyżowania leukocytów jest nadal przedmiotem dyskusji. Opracowaliśmy stosunkowo prosty test, w którym te cząsteczki połączeniowe mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym podczas diapedezy leukocytów w fizjologicznych warunkach przepływu przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Przeciwciała te nie zakłócały ani nie blokowały integralności połączeń lub ruchliwości docelowych białek. Ten test pozwala nam śledzić dynamikę białek połączeniowych podczas procesu parakomórkowego TEM. Dodatkowo test ten pozwala również na rozróżnienie między szlakami migracji para- i transkomórkowej.

Protokół

Neutrofile zostały wyizolowane od zdrowych ochotników, którzy podpisali świadomą zgodę. Badania zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka.

1. Poszycie i pielęgnacja komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej

  1. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zgodnie z instrukcjami producenta. Hoduj HUVEC na szalkach pokrytych fibronektyną (FN) (10 μg/ml, rozpuszczonych w wodzie demineralizowanej) przy użyciu pożywki (pożywka Endothelial Basal Medium (EBM-2) uzupełniona pojedynczymi kwotami Endothelial Growth Medium (EGM-2)). Do eksperymentów należy użyć hodowli komórkowej między 4-8 pasażami.
  2. Dzień 1: Pokryć komory przepływowe 100 μl fibronektyny (10 μg/ml w PBS) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Dzień 2: Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, trypsynizuj komórki po dokładnym umyciu solą fizjologiczną buforowaną fosforanem RT (PBS) o pH 7,4, odwiruj przy 800 x g i ponownie zawieś przy 800 000 komórek/ml za pomocą pożywki. Umieść 80 000 komórek w każdym kanale komór przepływowych pokrytych FN i delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół. Hodowla O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Dzień 3: Odświeżyć pożywkę w szkiełku komory przepływowej, delikatnie przechylając szkiełko pod kątem 45°. (patrz rysunek 1A).
    UWAGA: Zaleca się usuwanie mediów tylko ze zbiorników, a nie z samego kanału. Usunięcie pożywki z kanałów może spowodować utratę komórek śródbłonka i śmierć z powodu siły ciągnięcia pożywki spowodowanej pipetowaniem.
  5. Sprawdź za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, czy komórki śródbłonka utworzyły monowarstwę (tj. 100% zlewającą się). Jeśli komórki nie są w 100% zlewne, zmieniaj pożywkę dwa razy dziennie, aż osiągną 100% konfluencję.
  6. Gdy komórki osiągną zbieżność, stymulować je pożywką (patrz krok 1.1) zawierającą mediator stanu zapalnego (TNF-α (10 ng / ml)). Stymulacja HUVEC O/N (tj. 12 godzin) za pomocą TNF-α powoduje fenotyp zapalny śródbłonka, tj. regulację w górę cząsteczek adhezyjnych komórek, takich jak ICAM-1 i VCAM-1 13.

2. Izolacja leukocytów wielojądrzastych za pomocą gradientów Percoll

  1. Przygotować bufor kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) (zwanego dalej: buforem przepływowym) przed wyizolowaniem leukocytów wielojądrzastych (PMN). Bufor przepływowy służy do mycia izolowanych PMN oraz jako bufor w teście przepływowym. Aby przygotować bufor przepływowy: rozcieńczyć 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO4•7H2O (1 mM), K2HPO4•3H2O (1,2 mM) w 1 l wody zdemineralizowanej i dostosować do pH 7,4 (ten bulion można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni).
  2. Dodać świeże 100 μl 1 M CaCl2 (1 mM), 2,5 ml albuminy ludzkiej o stężeniu podstawowym 200 g/l (0,5% v/v) i 0,1 g glukozy do 100 ml (0,1% w/v) buforu przepływowego. Następnie przefiltruj bufor przepływowy za pomocą filtra 0,45 μm. UWAGA: Ten bufor przepływu musi być przygotowywany na świeżo do każdego eksperymentu.
  3. Przed izolacją PMN należy przygotować 10% roztwór cytrynianu trisodowego (TNC) w PBS o pH 7,4.
  4. Zbierz 20 ml krwi pełnej w wakuetach heparyny sodowej od zdrowego ochotnika. Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1 10% PBS/TNC w probówkach o pojemności 50 ml i ostrożnie odpipetować 20 ml rozcieńczonej krwi na 12,5 ml Percollu (23% (w/w) roztworu koloidalnego w wodzie o gęstości 1,130 g/ml) w nowej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie umieścić probówki w wirówce i wirować przez 20 minut przy 800 x g z niskim przyspieszeniem i bez przerwy ustawionej na RT.
    UWAGA: Podczas dodawania rozcieńczonej krwi do Percollu, przechyl probówkę zawierającą Percoll pod kątem 45° i delikatnie pipetuj rozcieńczoną krew w probówce przy najwolniejszym ustawieniu pipetownika.
  5. Usuń cały płyn, a następnie napełnij probówkę lodowatym buforem do lizy erytrocytów (4,15 g NH4Cl [0,155 M], 0,5 g KHCO3 [0,01 M] i 18,5 mg EDTA (triplex III) [0,1 mM] do 500 ml lodowategoH2O) w celu lizy erytrocytów. Pozostawić probówkę na lodzie, od czasu do czasu odwracając probówkę, aż zawiesina zmieni kolor na ciemnoczerwony, a następnie odwirować 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C z włączonymi przerwami.
    UWAGA: Frakcja osadu zawiera PMN (neutrofile, eozynofile, bazofile) wraz z erytrocytami.
  6. Usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć osad w lodowatym buforze do lizy o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zawiesić osad z buforem przepływowym w temperaturze pokojowej i określić stężenie PMN za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić PMN w buforze przepływowym o stężeniu 1 x 106 komórek/ml i utrzymywać w temperaturze pokojowej uwagi.

3. Oznakowanie śródbłonkowej złącza VE-kadheryny i PECAM-1

  1. Dodać przeciwciało PECAM Alexa Fluor 647 (klon WM59) w rozcieńczeniu 1:100 i niezależne od wapnia przeciwciało VE-kadheryna-FITC (klon 55-7H1) w rozcieńczeniu 1:50 do pożywki hodowlanej HUVEC (patrz krok 1.1) i inkubować przez 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu przepływowego, aby uwidocznić dynamikę połączeń komórek śródbłonka podczas migracji neutrofili w fizjologicznych warunkach przepływu.
    UWAGA: Przed dodaniem bezpośrednio znakowanych przeciwciał do komór przepływowych należy upewnić się, że objętość w każdym kanale nie przekracza 100 μl. Pomaga to utrzymać wydatki na przeciwciała na jak najniższym poziomie.

4. Test PMN TEM w przepływie

  1. Umieścić PMN w łaźni wodnej na 15 minut w temperaturze 37 °C przed wstrzyknięciem ich do systemu przepływowego.
  2. Podłącz rurkę do pustej komory przepływowej i napełnij ją ciepłym (np. 37 °C) buforem przepływowym (patrz krok 4.3), aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas ustawiania systemu przepływu.
  3. Podłączyć jedną stronę pustej komory przepływowej do systemu przepływu pompy strzykawkowej za pomocą silikonowej rurki zawierającej strzykawkę o pojemności 20 ml i umieścić komorę przepływową w stoliku mikroskopu.
  4. Podłączyć drugą stronę pustej komory przepływowej do kolby zbiornika wypełnionej buforem przepływowym o temperaturze 37 °C (rysunek 1B) i uruchomić pompę strzykawkową w celu napełnienia całego przewodu buforem przepływowym. Pompa przeciągnie bufor przepływowy ze zbiornika przez komorę przepływową do strzykawki. UWAGA: Ten przewód zawiera również wbudowany port do wstrzykiwania Luer, który umożliwia wstrzykiwanie PMN za pomocą igły do działającego eksperymentu bez zatrzymywania przepływu i tworzenia pęcherzyków powietrza.
  5. Zastąp pustą komorę przepływową komorą przepływową zawierającą HUVEC nasączone TNF-α, podłącz rurkę zawierającą bufor przepływowy i umieść ją w stoliku mikroskopu (Rysunek 1C). Ściśnij rurki przed odłączeniem i ponownym podłączeniem ich do komór zawierających HUVEC, ponieważ brak ściśnięcia może spowodować tworzenie się pęcherzyków powietrza wewnątrz przewodów i/lub komór przepływowych.
  6. Ustawić prędkość przepływu na 1 dyn/cm2, zgodnie z fizjologiczną prędkością przepływu w żyłkach podkapilarnych (1-5 dyn/cm2).
  7. Rejestruj jednocześnie kontrast interferencyjny różnicowy (DIC), FITC (488 nm) i Alexa Fluor 647 (647 nm) za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.
  8. Wstrzykiwać PMN (krok 4.1) powoli do systemu przepływowego przez wbudowany port do wstrzykiwań Luer (rysunek 1D) za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml.
  9. Po kilku minutach pojawiają się leukocyty, przylegają i migrują. Przerwij eksperyment w dowolnym momencie, odłączając rurkę od komory przepływowej i pipetując utrwalacz (3,7% formaldehydu w PBS) do komory przepływowej. Pozostawić do utrwalenia na 10 minut, a następnie przemyć PBS. Dane są analizowane za pomocą oprogramowania do obrazowania (patrz tabela materiałów i sprzętu).
    UWAGA: Eksperyment należy przeprowadzić przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w komorę klimatyczną o stałej temperaturze 37 °C, 5%CO2 i obiektyw olejowy 63X.

Wyniki

W pierwszej kolejności sprawdzono, czy przeciwciała nie zakłócają funkcji barierowej endotelium. Opór monowarstw endotelialnych zmierzono przy użyciu elektrycznej spektroskopii impedancyjnej (ECIS). Szczegóły opisano w pracy Van Buul et al.13 Nie zaobserwowano zmian oporu po dodaniu do komórek przeciwciała anty-VE-cadherin znakowanego fluorescencyjnie (Ryc. 2A). Przeciwciało anty-VE-cadherin, powszechnie uznane za blokujące funkcję VE-cadherin, doprowadziło do gwałtownego spadku oporu (Ryc. 2A). Ponadto przeciwciała wykorzystane do obrazowania nie zmieniają dynamiki VE-cadherin, co oceniono poprzez pomiar fluorescencyjnego powrotu po fotowybieleniu (FRAP) VE-cadherin-GFP (Ryc. 2B).

Po 1-2 min neutrofile przylgnęły do aktywowanej warstwy endotelialnej, co można było zwizualizować w kanale DIC (Rysunek 3A). Po pełzaniu przez 5-30 s zdecydowana większość neutrofili transmigrowała przez warstwę endotelialną poprzez połączenia międzykomórkowe, które zostały znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko PECAM-1 i VE-cadherin. W procesie diapeksji monitorowano w czasie rzeczywistym rozkład VE-cadherin i PECAM-1 (Rysunek 3B). W miejscach diapeksji neutrofili VE-cadherin ulegał lokalnej dezorganizacji, a PECAM-1 przybrał strukturę bardziej pierścieniowatą. Po zakończeniu diapeksji połączenia zamykają się, a VE-cadherin i PECAM-1 wyraźnie relokalizują się w miejscach diapeksji (Rysunek 3C). Należy zauważyć, że fragmenty przeciwciała anty-PECAM-1 zostały wykryte na powierzchni neutrofila w momencie, gdy dotarł on do strony bazolateralnej endotelium. Nie zapobiegło to jednak neutrofilom przekroczeniu endotelium. Obserwowana dynamika VE-cadherin w czasie rzeczywistym podczas transendotelialnej migracji neutrofili była zgodna z pracą Shawa i współpracowników, którzy wykazali przy użyciu mikroskopii konfokalnej i komórek endotelialnych transfekowanych VE-cadherin-GFP, że VE-cadherin-GFP dyfunduje lateralnie podczas przekraczania połączeń międzykomórkowych endotelium przez leukocyty14. Praca Su i współpracowników potwierdziła również nasze obserwacje dotyczące PECAM-1. Wykazali oni, że obok lateralnej dyfuzji VE-cadherin podczas przejścia leukocytów, PECAM-1 ulega lokalnej redystrybucji w pierścień wokół transmigrującego neutrofila15.

Wielokanałowa pipeta w użyciu, mikroskop i układ rurek do analizy przepływu w środowisku laboratoryjnym.
Rycina 1. In vitro komora przepływowa. (A) Strzałka wskazuje zbiornik, z którego należy odświeżyć medium. (B) Rurka silikonowa łącząca komorę przepływową z liniowym portem wtryskowym Luer, służącym do wstrzykiwania PMN bez odłączania rurek (grot strzałki). (C) Podłączenie pustej komory przepływowej do kolby zbiornika wypełnionej buforem przepływowym o temperaturze 37 °C (grot strzałki). (D) Podłączenie komory przepływowej z HUVEC traktowanymi TNF-α do rurek zawierających bufor przepływowy i umieszczenie jej na stoliku mikroskopu (grot strzałki).

Wykresy analizy oporności i FRAP; impedancja w funkcji czasu oraz krzywe powrotu fluorescencji.
Rysunek 2. Przeciwciała przeciwko VE-kadherynie nie zakłócają dynamiki ani funkcji połączeń.**(A) Impedancję monowarstwy komórek śródbłonka zmierzono za pomocą ECIS. Oś Y przedstawia impedancję w omach, a oś X reprezentuje czas w godzinach. Klon przeciwciała przeciwko VE-kadherynie 55-7H1, znakowany ALEXA647 (linia niebieska), lub kontrola izotypowa IgG-ALEXA647 (linia czerwona) nie zmieniają impedancji monowarstwy komórek śródbłonka, podczas gdy blokujące przeciwciało przeciwko VE-kadherynie cl75 (linia czarna) obniżyło impedancję. (B) W komórkach HUVEC wykazano ekspresję VE-cadherin-GFP, a analiza FRAP z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej nie wykazała zmian w powrocie fluorescencji w obecności lub w nieobecności przeciwciała 55-7H1 przeciwko VE-kadherynie.

Mikroskopia fluorescencyjna: PECAM-1 Alexa 647, VE-kadheryna FITC, DIC, merge; badanie interakcji komórkowych.
Rycina 3. Rozkład VE-kadheryny i PECAM-1 podczas TEM neutrofili w czasie rzeczywistym. (A) Neutrofil (zaznaczony białą linią) przylegający do śródbłonka i przekraczający połączenie międzykomórkowe bez wpływu na rozkład VE-kadheryny i PECAM-1. (B) Neutrofil przekraczający monowarstwę śródbłonka poprzez połączenia międzykomórkowe. Lokalna dyspersja VE-kadheryny i PECAM-1 jest obserwowalna, gdy neutrofil przebija się przez połączenia międzykomórkowe. Biała linia ilustruje obecność neutrofila wciąż nad śródbłonkiem. Żółta linia wskazuje błonę neutrofila, która znajduje się już pod śródbłonkiem. (C) Neutrofil w pełni przekroczył monowarstwę śródbłonka. VE-kadheryna i PECAM-1 uległy relokacji w miejscach diapedazy. Żółta linia ilustruje granice transmigrowanego neutrofila. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W przypadku tego protokołu kluczowe znaczenie ma zapobieganie tworzeniu się pęcherzyków powietrza w komorach przepływowych, ponieważ spowoduje to apoptozę komórek i zakłócenie monowarstwy. Aby tego uniknąć, pragniemy podkreślić, aby zwrócić szczególną uwagę na kroki 4.2 i 4.5, w których rurki są podłączone do komory przepływowej. Kolejnym krytycznym krokiem w protokole jest zalewanie PMN, które są utrzymywane w temperaturze pokojowej poprzez inkubację przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C przed wstrzyknięciem do komory przepływowej (krok 4.1). Powoduje to pobudzenie integryn leukocytów, umożliwiając im przyleganie do cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1 lub VCAM-1 w śródbłonku.

Protokół ten nie ogranicza się do badania transmigracji neutrofili. Można również stosować inne typy leukocytów, takie jak monocyty lub limfocyty. Należy pamiętać, że krok 4.1, tj. przygotowanie leukocytów, może się różnić w zależności od typu leukocytów. Można również stosować inne rodzaje komórek śródbłonka. W tym celu kluczowe znaczenie ma stymulacja komórek śródbłonka odpowiednimi bodźcami zapalnymi, takimi jak TNF-α lub IL-1β. Jeśli neutrofile nie reagują podczas transmigracji, można rozważyć krótkie leczenie neutrofili (5 min) peptydem N-formylo-L-metionylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny (fMLP)16. To jeszcze bardziej pobudzi neutrofile, w szczególności ich integryny, czyniąc je bardziej podatnymi na przyleganie do śródbłonka.

Zazwyczaj stosuje się prędkość przepływu 1 dyn/cm2 . Ta prędkość przepływu jest mierzona w żyłkach zakapilarnych, miejscach, w których zachodzi większość migracji przezśródbłonkowej leukocytów17. Za pomocą opisanych komór przepływowych możliwe jest zwiększenie prędkości przepływu do 10 dyn/cm2. Nie zaleca się jednak dalszego zwiększania ścinania. Może to spowodować niepożądany wyciek rurki i odłączenie ogniw od komory przepływowej.

Wyniki opisane na rycinie 3 wskazują, że przeciwciała te można wykorzystać do wizualizacji i badania dynamiki połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas diapedezy leukocytów. W szczególności, oprócz istniejących testów transmigracji, protokół ten pozwala na odróżnienie migracji parakomórkowej od transkomórkowej w fizjologicznych warunkach przepływu w czasie rzeczywistym. Ponieważ przeciwciała barwią połączenia komórka-komórka, można ocenić liczbę leukocytów, które przecinają połączenia VE-kadheryna/PECAM-1-dodatnie w porównaniu z niedodatnimi miejscami VE-kadheryna/PECAM-1. W ten sposób migrację transkomórkową można odróżnić od migracji parakomórkowej.

Należy podkreślić, że przeciwciała te nie zakłócają funkcji białek, z którymi się wiążą: przeciwciało PECAM-1 użyte w tym badaniu jest skierowane przeciwko drugiej domenie zewnątrzkomórkowej. Komórki śródbłonka, które zostały posiane w obecności przeciwciała, nie wykazywały żadnych wad w rozprzestrzenianiu się lub tworzeniu monowarstwy, co sugeruje, że przeciwciało przynajmniej nie zakłócało homotypowych interakcji między komórkami śródbłonka. Ponadto oba przeciwciała nie upośledzają zdolności neutrofili do migracji przez monowarstwę śródbłonka. Ponadto liczba neutrofili, które migrują przez monowarstwę śródbłonka pod nieobecność lub obecność przeciwciał, nie ulega zmianie (dane nie pokazane). Co ważne, konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa daje nam możliwość jednoczesnej rejestracji różnych kanałów fluorescencyjnych i DIC.

Tak więc test ten pozwala na badanie dynamiki kadheryny VE i PECAM-1 w tym samym czasie, gdy neutrofile przecinają połączenie komórka-komórka śródbłonka i pomoże zrozumieć, dlaczego leukocyty wybierają jedną drogę zamiast drugiej, tj. parakomórkową w porównaniu z transkomórkową.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. P.L. Hordijkowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Defibrylator AED jest wspierany przez stypendium Fundacji Landsteiner na rzecz Badań nad Transfuzją Krwi (LSBR) (grant #1028). JK jest wspierany przez Holenderską Fundację Kardiologiczną (2005T3901). JDvB jest stypendystą NHS Dekker (grant #2005T039).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
μ-Slide VIIBIDI80606Komora przepływowa
0,45 μ Filtr M Whatman/GE Lifesciences10462100
Strzykawka 1 ml BD Plastipak300013
20 ml Igła BD Discardit II366296
21 G BD Microlance301155
Albumina Sanquin15522644
Chlorek amonu (NH4Cl)Merck1009245000
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-Aldrich449709
EBM-2 Basal Medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Czynniki wzrostuLonzaCC-3156 + CC-4176
media EDTA (Titriplex III)Probówki Merck1370041000
Falcon Corning Life Sciences352096
FibronectinSigma-AldrichF1141-2MGFN
GlukozaSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH3375
Port do wstrzykiwania Luer w linii IBIDI10820
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4• 7H2O)Merck105886
PECAM-1-ALEXA-647 BD Pharmingen561654klon WM59
Percoll GE Healthcare Life Sciences17-0891-09
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFresenius Kabi  NederlandM090001/01NLPBS
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541
Wodorowęglan potasu (KHCO3)Merck1048540500
Fosforan potasu dwuwodny trójwodny (K2HPO4)Sigma-AldrichP5504
Silikonowy wąż Tygon 3350VWR228-4331rurka
Chlorek sodu (NaCl)Calbiochem (Millipore)567441
Pompa strzykawkowa Numer modelu aparatu Harvard55-5920
TNF-α  Peprotech300-01Aczynnik martwicy nowotworu
Cytrynian trisodowy Merck1.06447.5000TNC
VacuettesGreiner, Niemcy980044
VE-Cadherin-FITC Klon 560411 BD Pharmingen55-7H1
Zeiss LSM510 META Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Niemcy
Zen Software 2008Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Niemcy
Strzykawka

Bibliografia

  1. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
  3. Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224(2008).
  4. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
  5. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
  6. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  7. Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
  8. Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
  9. Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
  10. Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
  11. Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
  12. Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
  13. Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
  14. Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
  15. Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
  16. Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
  17. Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Z cza kom rek r db onkarozk ad VE kadherynylokalizacja PECAM 1fizjologiczne warunki przep ywumikroskopia konfokalnatest w komorze przep ywowejizolacja leukocyt w polimorfoj drowychstymulacja TNF alfaznakowanie przeciwcia ami fluorescencyjnymi

Powiązane artykuły