Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Podsumowanie

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Streszczenie

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA) jest prostą, ale użyteczną techniką lokalizacji pojedynczych fluoroforów z nanometrową precyzją w płaszczyźnie x-y. Poniżej przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz pokrótce opisano przykłady badań, które zostały przeprowadzone przy użyciu FIONA. W pierwszej kolejności opisano, jak skonfigurować sprzęt wymagany do eksperymentów FIONA, tj. mikroskopię fluorescencyjną z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), ze szczegółami dotyczącymi ustawiania optyki. Następnie, jak przeprowadzić prosty eksperyment FIONA polegający na lokalizacji unieruchomionych pojedynczych cząsteczek Cy3-DNA przy użyciu odpowiednich protokołów, a następnie użycie FIONA do pomiaru rozmiaru kroku 36 nm pojedynczego skróconego silnika Va miozyny oznaczonego kropką kwantową. Na koniec doniesiono o niedawnych wysiłkach zmierzających do rozszerzenia stosowania FIONA na grube próbki. Wykazano, że przy użyciu obiektywu zanurzonego w wodzie i kropek kwantowych nasączonych głęboko w zol-żelach i rogówkach w kształcie oka królika (>200 μm) można osiągnąć precyzję lokalizacji 2-3 nm.

Wprowadzenie

Około 1882 roku Ernst Abbe odkrył, że rozdzielczość mikroskopu światła widzialnego wynosi ok. λ/2NA, czyli ok. 200 nm (gdzie λ oznacza długość fali, a NA aperturę numeryczną).^1,2W związku z tym każdy obiekt mniejszy od tego wymiaru będzie widoczny w mikroskopie optycznym jako plamka ograniczona dyfrakcyjnie. Możliwe jest jednak wyznaczenie środka tej plamki, a zatem położenia obiektu, z znacznie większą precyzją.³Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością do jednego nanometra (FIONA) to prosta, lecz przydatna technika lokalizacji pojedynczych fluoroforów z nanometrową precyzją w płaszczyźnie x-y.⁴Precyzja lokalizacji, σ_µ (t.j., błąd standardowy średniej), zależy od całkowitej liczby zebranych fotonów, , gdzie N to liczba fotonów, s to odchylenie standardowe plamki fluorescencyjnej, a to rozmiar piksela detektora obrazującego, a b to odchylenie standardowe tła^3,4W przypadku fluoroforu emitującego ok. 10 000 fotonów, metoda FIONA pozwala na osiągnięcie precyzji rzędu ok. 1 nm.⁴.

Metodę FIONA można wykorzystać do dokładnego określenia pozycji emitera stacjonarnego lub ruchomego (zakładając, że obrazy mogą być rejestrowane wystarczająco szybko). FIONA może być stosowana sekwencyjnie do klatek filmu, co pozwala na śledzenie ruchu pojedynczej cząsteczki^4-8. Konieczne może być zastosowanie odczynników fotoprotekcyjnych, aby zapobiec fotodegradacji próbki. Co więcej, sam obiekt fluorescencyjny może mieć dowolny rozmiar, mniejszy lub większy od granicy dyfrakcyjnej — np. może to być organellum (~1 µm) z wieloma białkami fluorescencyjnymi rozproszonymi w jego błonie. Zastosowanie FIONA nadal pozwala na uzyskanie bardzo dokładnej (nanometrycznej) średniej wartości jego środka masy. Znaczna poprawa precyzji lokalizacji dzięki FIONA umożliwia rozdzielenie ruchów w skali nanometrycznej w czasie. Przeniosło to mikroskopię na skalę długości cząsteczkowych^4-8.

Od czasu wynalezienia FIONA opracowano jego warianty. Na przykład obrazowanie w polu jasnym z dokładnością do jednego nanometra (bFIONA)⁹, będące niewielką modyfikacją FIONA, umożliwia obrazowanie i lokalizację gęstych obiektów, takich jak melanosomy in vivo (ciemne obiekty zawierające pigment melaninę) przy użyciu światła przechodzącego. Ponadto FIONA była wykorzystywana do rozróżniania wielu barwników. Przykładowo, opracowano obrazowanie pojedynczych cząsteczek o wysokiej rozdzielczości z fotoblaknięciem (SHRImP)^10,11 lub kolokalizację pojedynczych cząsteczek o wysokiej rozdzielczości (SHREC)¹², aby rozróżnić dwa barwniki w odległości około 10 nm. (Należy zauważyć, że chodzi tutaj o rozdzielczość, t.j. o to, jak dokładnie można odróżnić od siebie identyczne barwniki). W ostatnim czasie analiza FIONA przyczyniła się do procesu lokalizacji w niektórych metodach mikroskopii superrozdzielczej, takich jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna (STORM)^13-15 oraz mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej (PALM)¹⁶, w których wzbudzane są tymczasowo ciemne fluorofory, a następnie lokalizowana jest ich fluorescencja. Poprzez wielokrotne wzbudzanie barwników o dość niskiej gęstości (mniej niż jeden na obszar ograniczony dyfrakcją), a następnie zbieranie fluorescencji i analizę każdego z nich za pomocą FIONA, można stworzyć mapę o wysokiej rozdzielczości. Rozdzielczość jest wówczas ograniczona jedynie liczbą fotonów emitowanych przez każdy barwnik, a także takimi czynnikami jak utrzymanie próbki w bezruchu (w tym, np., stolika mikroskopu) podczas akwizycji.

W niniejszej pracy przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz krótko opisano przykłady badań przeprowadzonych z jej wykorzystaniem. W pierwszej kolejności omówiono sposób konfiguracji sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia eksperymentów FIONA, t. j.omawiano mikroskopię fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), z uwzględnieniem szczegółów dotyczących ustawiania optyki. Następnie zilustrowano sposób przeprowadzenia prostego eksperymentu FIONA w celu lokalizacji unieruchomionych pojedynczych cząsteczek Cy3-DNA z wykorzystaniem odpowiednich protokołów. Po tym przedstawiono zastosowanie metody FIONA do pomiaru wielkości kroku wynoszącej 36 nm dla pojedynczego, skróconego motoru miozyny Va znakowanego kropką kwantową. Miozyna Va jest niezbędnym procesywnym białkiem motorowym, które transportuje ładunek komórkowy, przemieszczając się wzdłuż filamentów aktynowych. W niniejszym badaniu zastosowano skrócony konstrukt miozyny Va w celu usunięcia domen nieistotnych dla wielkości kroku, z dodanym do końca C-końca znacznikiem FLAG, aby ułatwić znakowanie kropkami kwantowymi funkcjonalizowanymi przeciwciałami anty-FLAG. Eksperyment ten przeprowadzono przy niskim stężeniu ATP, aby spowolnić miozynę i umożliwić zastosowanie wystarczająco długich czasów ekspozycji w celu uzyskania dobrej liczby fotonów w każdej klatce. W poniższym protokole można zastąpić znacznik dowolną wystarczająco jasną etykietą fluorescencyjną. Na koniec opisano niedawne próby rozszerzenia zastosowania metody FIONA na próbki grube. Jako dowód koncepcji kropki kwantowe zostały wprowadzone do sol-żeli oraz rogówek oczu królika, a następnie obrazowane i lokalizowane za pomocą FIONA. Do obrazowania wykorzystano obiektyw imersyjny z wodą 60X o aperturze numerycznej NA=1,2, ponieważ obiektyw ten posiada większą odległość roboczą niż wcześniej stosowany obiektyw imersyjny z olejem 100X. Aby zrekompensować utratę powiększenia w obiektywie, w torze emisji umieszczono dodatkową soczewkę powiększającą (3,3X lub 4,0X). Ponadto, w celu dotarcia do głębokich obszarów w grubych próbkach, konieczne było zastosowanie mikroskopii epifluorescencyjnej (nie TIR). Wykazano, że kropki kwantowe wprowadzone głęboko w sol-żele oraz w rogówki oczu królika (Z > 200 µm) można zlokalizować z precyzją 2-3 nm.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Tkanka rogówki królików została pobrana zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use University of Illinois.

1. Konfiguracja TIRFM

UWAGA: Przez cały czas należy nosić gogle ochronne do laserów.

1. Należy upewnić się, że wszystkie niezbędne komponenty optyczne wymienione w Liście Materiałów są dostępne i gotowe do wyrównania. W razie potrzeby należy zastosować zamienniki o równoważnych funkcjach innych firm. Należy upewnić się, że lustra i soczewki posiadają powłoki antyrefleksyjne (AR) dopasowane do używanego lasera.
2. Należy ustawić wysokość wszystkich komponentów optycznych na poziomie centrum tylnego portu mikroskopu.
3. Należy zamontować laser, migawkę laserową oraz filtr(y) ND. Należy użyć filtrów ND, aby osłabić moc lasera do możliwie najniższej wartości, przy której wiązka pozostaje widoczna. Śruby należy dokręcić odpowiednimi kluczami imbusowymi.
4. Należy zaplanować tor wiązki i zaznaczyć go taśmą lub markerem na stole optycznym (niebieskie linie przerywane na Rysunku 1). Dla ułatwienia należy zachować proste odcinki wzdłuż linii otworów na stole optycznym.
5. Należy umieścić lustro M1 (Rysunek 1) w miejscu pierwszego zakrętu kątowego. Dwie przysłony należy umieścić wzdłuż drugiego prostego odcinka zaplanowanego toru wiązki. Należy dostosować położenie i nachylenie M1 tak, aby wiązka lasera przechodziła przez przysłony.
6. Należy umieścić lustro M2 (Rysunek 1) w miejscu drugiego zakrętu kątowego. Rozszerzacz wiązki 10X (L1 i L2, Rysunek 1) należy umieścić wzdłuż trzeciego prostego odcinka toru. Należy dostosować jego nachylenie tak, aby rozszerzacz wiązki był równoległy zarówno do stołu optycznego, jak i zaplanowanego toru wiązki.
   1. Należy iteracyjnie regulować M1 i M2 tak, aby laser przechodził prosto przez centra obu soczewek rozszerzacza wiązki. Krok ten należy powtarzać do momentu, aż profil rozszerzonej wiązki będzie miał postać nieobciętego rozkładu Gaussa.
7. Należy iteracyjnie regulować M1, aby wycentrować wiązkę na L1 (Rysunek 1), oraz M2, aby wycentrować wiązkę na L2 (Rysunek 1). Zły profil wiązki zazwyczaj oznacza, że wiązka lasera jest obcinana; aby sprawdzić profil wiązki wzrokowo, należy zablokować ją za rozszerzaczem za pomocą kawałka białego papieru. Do precyzyjnej analizy należy użyć optycznego profilometru wiązki.
8. Należy dostosować odległość między L1 a L2 tak, aby wiązka była skolimowana. W razie potrzeby należy powtórzyć kroki 1.8 i 1.9.
   UWAGA: Gdy rozmiar wiązki nie zmienia się wraz z odległością, wiązka jest wystarczająco skolimowana dla układu TIRFM. Aby dalej poprawić kolimację wiązki, można użyć narzędzi takich jak interferometr ścinający. Typowy rozmiar wiązki po rozszerzeniu wynosi ~20 mm.
9. Należy zamknąć migawkę lasera. Należy wykręcić obiektyw mikroskopu i wkręcić fluorescencyjny cel wyrównawczy. Lustra M3 i M4 (Rysunek 1) należy ustawić tak, aby skierować rozszerzoną wiązkę do portu mikroskopu i na lustro dichroiczne wewnątrz rewolweru. Należy upewnić się, że wiązka lasera odbija się od lustra dichroicznego w stronę sufitu.
10. Należy wyregulować M3, aby wycentrować najjaśniejszą część wiązki na celu fluorescencyjnym, oraz M4, aby ustawić nachylenie wiązki w pionie.
11. Należy zamknąć migawkę lasera i ponownie wkręcić obiektyw. Jeśli wyrównanie w poprzednim kroku zostało wykonane prawidłowo, z obiektywu powinna wyjść symetryczna plamka. Należy precyzyjnie dostroić nachylenie M3 i M4, aby zoptymalizować moc lasera i profil wiązki wychodzącej z obiektywu.
12. Należy zamontować kamerę EMCCD do mikroskopu i podłączyć ją do komputera. Następnie należy uruchomić oprogramowanie kamery.
13. Należy umieścić fluorescencyjną próbkę (roztwór fluoroforów) w mikroskopie. Należy obserwować jasną fluorescencyjną plamkę na obrazie z kamery. Należy sprawdzić, czy plamka nie przesuwa się na ekranie podczas zmiany ostrości.
14. Soczewkę TIR (L3, Rysunek 1) należy umieścić na stole translacyjnym XYZ w odległości od tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu równej ogniskowej L3 (~30 cm). Położenie L3 należy dostosować tak, aby laser przechodził przez środek soczewki.
15. Należy przesuwać L3 wzdłuż toru wiązki, aby dostosować jej kolimację. Należy upewnić się, że wiązka jest nadal wycentrowana na monitorze i ma symetryczny kształt.
    UWAGA: Obszar oświetlenia w płaszczyźnie próbki zwiększa się wraz ze zmniejszaniem ogniskowej soczewki TIR. Zasadniczo należy używać najkrótszej ogniskowej, która zmieści się w układzie.
16. Należy przesuwać L3 prostopadle do toru wiązki, aby pochylić wiązkę wychodzącą z obiektywu. Soczewkę TIR należy przesuwać do momentu uzyskania całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR). Należy obserwować próbkę kuleczek fluorescencyjnych za pomocą kamery EMCCD i precyzyjnie dostroić L3, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu (SNR).

Rycina 1. Konfiguracja optyczna dla mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).

2. FIONA na Cy3-DNA

1. Czyszczenie szkiełek przedmiotowych i nakrywek: wypłukanie szkiełek przedmiotowych i nakrywek w ddH₂O oraz izopropanolu, a następnie osuszenie ich strumieniem azotu; umieszczenie szkiełek i nakrywek w oczyszczaczu plazmowym na 5 min w plazmie argonowej.
2. Konstrukcja komór z próbką (zgodnie ze schematem na Rysunku 2).
   1. Umieszczenie chusteczki na blacie, a następnie położenie na niej kawałka papieru do soczewek. Położenie szkiełka na papierze do soczewek. Należy upewnić się, że czysta strona szkiełka jest skierowana do góry.
   2. Naklejenie dwóch pasków taśmy dwustronnej na szkiełko wzdłuż dłuższych krawędzi, pozostawiając przerwę 3-5 mm w środku. Umieszczenie oczyszczonej nakrywki na szkiełku. Należy upewnić się, że czysta strona nakrywki przylega do szkiełka.
   3. Użycie końcówki pipety do dociśnięcia taśmy dwustronnej. Usunięcie nadmiaru taśmy ze szkiełka za pomocą żyletki w taki sposób, aby taśma pozostała jedynie pod nakrywką.
      UWAGA: Otwarte końce komory pozostają odsłonięte i służą jako wlot oraz wylot. Objętość komory wynosi kilka mikrolitrów.

Rycina 2. Schemat typowej komory z próbką. (a) Widok z góry; (b) Widok z boku od prawej strony; (c) Widok z boku od przodu.

3. Immobilizacja Cy3-DNA na wewnętrznych powierzchniach komór z próbką.
   1. Przygotować bufor T-50 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl). Przygotować BSA-biotynę w buforze T-50 o stężeniu końcowym 1 mg/ml. Przygotować bufor T50-BSA poprzez rozpuszczenie BSA w buforze T-50 do stężenia końcowego 10 mg/ml.
   2. Przygotować neutrawidynę w stężeniu 0,5 mg/ml w buforze T50-BSA. Przygotować biotynilowany DNA znakowany Cy3 (Cy3-DNA) w buforze T50-BSA o stężeniu końcowym 5-10 pM.
   3. Pipetować 10 µl BSA-biotyny (1 mg/ml) do komory z próbką. Odczekać 5 min.
   4. Przemyć komorę 40 µl buforu T50-BSA. Pipetować 10 µl neutrawidyny (0,5 mg/ml) do komory z próbką. Inkubować przez 5 min.
   5. Przemyć komorę 40 µl buforu T50-BSA. Pipetować 20 µl Cy3-DNA do komory z próbką. Inkubować przez 5 min, a następnie przemyć komorę 80 µl buforu T50-BSA.
4. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek Cy3-DNA przy użyciu TIRFM.
   1. Przygotować bufor obrazujący (100 µl), mieszając 1 µl protokatechuanu-3,4-dioksygenazy (PCD, 5 µM), 4 µl kwasu protokatechowego (PCA, 62,5 mM), 50 µl kwasu 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylchromanu-2-karboksylowego (Trolox, 2 mM w buforze T-50) oraz 45 µl buforu T50-BSA.
   2. Pipetować 30 µl buforu obrazującego i odczekać 8-10 min.
   3. Zamontować próbkę do obrazowania na mikroskopie TIRFM wyposażonym w zielony laser (532 nm), obiektyw imersyjny olejowy 100X (1,45 NA) oraz kamerę EMCCD.
   4. Ustawić czas ekspozycji od 100 do 500 msec oraz wzmocnienie EM od 25 do 100. Nagrać film z próbki obejmujący 1000 klatek.
5. Przeprowadzenie analizy danych FIONA na zarejestrowanych obrazach Cy3-DNA.
   1. Wyznaczyć efektywny rozmiar piksela (tj. współczynnik konwersji z pikseli na nanometry), dzieląc fizyczny rozmiar piksela (odczytany z karty specyfikacji kamery EMCCD) przez całkowite powiększenie (powiększenie obiektywu mikroskopu pomnożone przez wszelkie dodatkowe powiększenia).
   2. Wyznaczyć współczynnik konwersji intensywności pikseli na liczbę fotonów, dzieląc czułość CCD (tj. liczbę elektronów na zliczenie A/D, odczytaną z karty specyfikacji kamery CCD) przez wzmocnienie mnożnika elektronów (EM) użyte podczas akwizycji obrazu.
   3. Skompilować i uruchomić program FIONA.pro do analizy FIONA. Użyć tego programu IDL do importu zarejestrowanego obrazu, wprowadzenia efektywnego rozmiaru piksela (z kroku 2.5.1) oraz współczynnika konwersji intensywności na liczbę fotonów (z kroku 2.5.2), a także do wybrania obszarów do analizy FIONA.
      UWAGA: Na koniec program wyświetli wyniki dopasowania funkcjami Gaussa 2D, a także całkowitą liczbę fotonów i precyzję lokalizacji. Typowy wynik przedstawiono w sekcji wyników reprezentatywnych oraz na rycinach 4c-4d.
   4. Skompilować i uruchomić program phcount.pro w celu określenia liczby fotonów. Użyć tego programu IDL do pomiaru średniej liczby fotonów emitowanych przez fluorofor przed fotowyblaknięciem, do importu zarejestrowanego obrazu oraz do wprowadzenia współczynnika konwersji intensywności na liczbę fotonów (z kroku 2.5.2).
      UWAGA: Program automatycznie wykryje plamy fluorescencyjne (opcjonalnie dostępny jest wybór ręczny), obliczy liczbę fotonów w funkcji numeru klatki i wyświetli ślady liczby fotonów.
      1. Odrzucić błędne ślady i określić zakresy klatek po fotowyblaknięciu do korekcji linii bazowej. Na koniec program wyświetli listę całkowitych liczb fotonów dla wszystkich punktów, które nie zostały odrzucone. Następnie narysować rozkład liczb fotonów i dopasować do rozkładu zanik wykładniczy, aby uzyskać średnią liczbę fotonów. Typowy wynik przedstawiono w sekcji wyników reprezentatywnych oraz na rycinach 4e-4f.

3. Zastosowanie FIONA do ilościowego określenia dynamiki silników molekularnych (np. miozyny na aktynie) w skali nanometrycznej

1. Polimeryzację aktyny (t.j. przygotowanie F-aktyny) przeprowadź na jeden dzień przed eksperymentem FIONA.
   1. Rekonstytuuj G-aktynę (monomer) oraz biotynylaną G-aktynę (monomer) do stężenia 10 mg/ml w ogólnym buforze do aktyny. Mieszaj, aby upewnić się, że obie substancje są całkowicie rozpuszczone, i przechowuj obie na lodzie.
   2. W probówce mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml wymieszaj 10 µl G-aktyny (monomeru) z 1,7 µl biotynylaną G-aktyną. Dodaj 100 µl lodowatego buforu do polimeryzacji aktyny.
   3. Pozostaw mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C (do utworzenia F-aktyny), a następnie dodaj ddH₂O do całkowitej objętości 1 ml.
   4. Przechowuj filamenty aktynowe (F-aktynę) w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia w eksperymentach.
      UWAGA: Filamenty z czasem ulegają dezintegracji i skracaniu, ale mogą być używane przez co najmniej dwa tygodnie.
2. Przygotuj próbkę do obrazowania.
   1. Przygotuj komorę do próbki (zgodnie z opisem w Protokole 2.1 i 2.2). Pipetuj 20 µl biotynilowanego BSA o stężeniu 1 mg/ml w ddH₂O. Inkubuj przez 10 min. Przepłucz 30 µl ddH₂O.
      UWAGA: Służy to zablokowaniu powierzchni szkła i naniesieniu biotyny w celu wiązania filamentów aktynowych. Podobną funkcję może pełnić biotynilowana poli-L-lizyna – glikol polietylenowy (PLL-PEG).
   2. Pipetuj 0,5 mg/ml neutrawidyny. Inkubuj przez 2 min, a następnie przemyj komorę 30 µl buforu M5.
   3. Pipetuj przygotowaną F-aktynę rozcieńczoną 25-krotnie w ogólnym buforze do aktyny, do stężenia końcowego ~0,004 mg/ml. Odczekaj 10 min, przepłucz komorę 30 µl buforu.
   4. Rozcieńcz miozynę Va z tagami FLAG 30-krotnie w buforze M5 (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) do stężenia końcowego 250 nM. Wymieszaj 1 µl miozyny z 1 µl Anti-FLAG-Qdot705 (~1 µM, sprzężonego z przeciwciał Anti-FLAG i Qdot705 przy użyciu zestawu Qdot705 Antibody Conjugation Kit zgodnie z instrukcją producenta). Dodaj 8 μl M5, aby dopełnić objętość do 10 µl. Pipetuj w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Inkubuj przez 10 min na lodzie.
      UWAGA: W ten sposób uzyskuje się mieszaninę w stosunku 1 motor na 4 kropki kwantowe, przy stężeniu miozyny ~25 nM.
3. Obrazowanie ruchu miozyny po aktynie.
   1. Przygotuj bufor do obrazowania (100 µl), mieszając 84 µl M5-BSA (bufor M5 z 1 mg/ml BSA), 1 µl ATP (50 µM w ddH₂O), 2 µl DTT (500 mM w ddH₂O), 1 µl CK (500 U/ml), 5 µl CP (200 mM), 1 µl PCD, 4 µl PCA, 1 µl miozyny-qdot po ponownym 10-krotnym rozcieńczeniu do stężenia miozyny 2,5 nM oraz 1 µl BME.
   2. Pipetuj 20 µl buforu do obrazowania do komory z próbką i inkubuj przez 8-10 min.
   3. Wykonaj obrazowanie próbki na mikroskopie TIRF przy czasie ekspozycji 30 msec. Pozyskaj co najmniej 1000 klatek. W razie potrzeby skoryguj objętość miozyny-qdot w kroku 3.3.1.
4. Przeprowadź analizę danych i wyznacz długość kroku ruchu miozyny.
   1. Otwórz plik wideo w programie ImageJ¹⁷ i przytnij wideo wokół poruszającej się plamki. Wytnij obszar wystarczająco duży, aby plamka nigdy nie zbliżyła się na odległość mniejszą niż 20 pikseli do krawędzi, i upewnij się, że w wideo nie ma innych plamek. Upewnij się, że plamka porusza się po linii prostej.
   2. Śledź plamkę w wideo, aby wygenerować współrzędne x i y w funkcji czasu, w pikselach, stosując analizę FIONA (krok 2.5.3) do każdej klatki wideo.
   3. Przelicz piksele na nanometry, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji.
   4. Oblicz przemieszczenie z pozycji początkowej jako funkcję czasu.
   5. Przeprowadź test t dla przemieszczenia, aby wyznaczyć kroki ruchu miozyny.
      UWAGA: Program dostarczony do testu t (step_t_test.zip) jest napisany w języku IDL i składa się z 14 podprogramów w folderze.
      1. Otwórz wszystkie podprogramy w IDL i skompiluj je dwukrotnie. Następnie uruchom mtltyanalysis_ttest.pro i wybierz plik tekstowy zawierający wyłącznie dane o odległości w jednej kolumnie. Zostanie wygenerowany plik wynikowy w formacie Excel, zawierający surowe dane, dopasowanie i długość kroku.
   6. Usuń wszystkie wartości zero z kolumny długości kroku. Przedstaw rozkład długości kroków za pomocą programu Origin lub MATLAB. Dopasuj rozkład Gaussa do histogramu.
      UWAGA: Wartości zerowe długości kroku muszą zostać usunięte, ponieważ krok o wartości zero oznacza, że między poprzednią a obecną klatką nie nastąpiło przemieszczenie. Dopasowanie daje szczyt w okolicy 36 nm (jak pokazano na Ryc. 5).

4. Przygotowanie grubych próbek do metody FIONA

1. Przygotowanie kropek kwantowych zamkniętych w matrycy sol-gel.
   1. Wymieszać 4,5 ml TMOS, 1 ml ddH₂O oraz 100 µl HCl (120 mM). Sonicować mieszaninę w lodzie przez 30 min w myjce ultradźwiękowej określonej w Liście Materiałów (częstotliwość = 40 kHz, grzanie = wyłączone). Mieszać roztwór co 10 min.
   2. Rozcieńczyć 1,5 µl Qdot605 w 1,5 ml HEPES (50 mM pH 7,2). Wymieszać roztwór z 1,5 ml TMOS z poprzedniego kroku.
   3. Wlać mieszaninę do szalki z szklanym dnem. Uszczelnić szalkę Parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 ºC przez 1,5 h.
   4. Dodać 2 ml 1% BME w PBS do szalki z próbką i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min przed obrazowaniem.
2. Przygotowanie próbki rogówki barwionej kropkami kwantowymi.
   UWAGA: Oczy królika zostały przekazane przez dr Marinę Marjanovic.
   1. Oddzielić rogówkę od oczu i pociąć ją na kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm.
   2. Rozcieńczyć 1 µl Qdot 605-streptawidyny w 1 ml PBS. Inkubować tkankę rogówki z 1 nM roztworem Qdots w temperaturze 4 ºC przez 1 h. Przepłukać tkankę PBS.
   3. Przygotować czyste szkiełko podstawne i lamellkę nr 1,5. Nanieść 4 warstwy taśmy dwustronnej na szkiełko wzdłuż dłuższej krawędzi, a następnie nałożyć kolejne 4 warstwy taśmy dwustronnej równolegle do poprzednich, pozostawiając między nimi kanał o szerokości około 1 cm. Umieścić tkankę z poprzedniego kroku na środku kanału i przykryć ją lamellką.
   4. Delikatnie docisnąć boki lamellki, aby przylgnęła do taśm. Nawilżyć kanał 50 µl PBS przed obrazowaniem.
3. Obrazowanie kropek kwantowych w sol-gel i rogówce.
   1. Do obrazowania FIONA w grubych próbkach należy użyć obiektywu imersyjnego wodnego 60X z odległością roboczą 0,27 mm lub obiektywu imersyjnego wodnego 60X z odległością roboczą 0,28 mm.
   2. Zamontować próbkę w mikroskopie. Ustawić soczewkę TIRF tak, aby osiągnęła tryb epi-fluorescencji (tzn. wiązka lasera wychodzi z obiektywu pod kątem względem lamellki). Wstawić dodatkową soczewkę powiększającą (3,3X lub 4,0X).
   3. Przesunąć płaszczyznę ogniskowej obiektywu do pożądanej pozycji z (np. >200 µm). Rejestrować obrazy nieruchomych kropek kwantowych w próbce.
4. Przeprowadzić analizę FIONA zgodnie z opisem w sekcji 2.5 niniejszego protokołu.

Wyniki

Typowy układ TIRFM z zastosowaniem obiektywu przedstawiono na Rysunku 3. W pierwszej kolejności wykonano obraz próbki Cy3-DNA unieruchomionej na powierzchni. Typowy obraz przedstawiono na Rysunku 4a. Obraz został wykonany przy czasie ekspozycji 0,5 s, z wzmocnieniem EM = 50 oraz czułością CCD = 12,13 dla kamery. Funkcję rozproszenia punktu (PSF) pojedynczej cząsteczki Cy3-DNA przedstawiono na Rysunku 4b (dla punktu wskazanego strzałką na Rysunku 4a), gdz...

Dyskusja

FIONA to technika lokalizacji położenia emitera fluorescencyjnego (fluoroforu organicznego lub kropki kwantowej) z nanometryczną precyzją i rozdzielczością czasową do 1 ms^4-8. Gdy zbierze się wystarczająca ilość fotonów, technika ta pozwala na określenie położenia emitera fluorescencyjnego znacznie dokładniej niż granica dyfrakcji (~200 nm), a tym samym technika ta otwiera drogę do obserwacji tego, czego nie zaobserwowano za pomocą konwencjonalnej/tradycyjnej mikroskopii optycznej^4-8...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taśma dwustronna	3M		~75 µ m gruba
kamera EMCCD	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Myjka ultradźwiękowa	Branson	2510
Zestaw filtrów fluorescencyjnych	Chroma	49016
Bufor polimeryzacyjny aktyny	Cytoszkielet	BSA02
Biotyna G-aktynowy	cytoszkielet	AB07
G-aktyna	Cytoszkielet	AKL95
Ogólny bufor aktynowy	Cytoszkielet	BSA01
Migawka laserowa (ze sterownikiem)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Rozwiązania informacji wizualnej
	Fisher Scientific	PI-31000
Szkiełko nakrywkowe	Fisherbrand	o grubości 22X30-1,5	0,16-0,19 mm
Mikroszkiełka	ze złotą pieczęcią	30103X1	Grubość 0,93-1,05 mm
Środek do czyszczenia plazmowego	Harrick Plasma	PDC-001
Naczynie ze szklanym dnem	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N Cy3-DNA
oligonukleotydy	Zintegrowane technologie		5'-Cy3/GCCTCCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Koraliki fluorescencyjne	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptawidyna	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Zestaw do koniugacji przeciwciał	Invitrogen	Q22061MP
MATLAB	MathWorks
Stół optyczny	Newport Corp		Seria RS4000
Obiektyw 60X	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X		Olympus PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Obiektyw	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX71/IX70/IX81
Pochodzenie	OriginLab
Przeciwciało anty-FLAG	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotyna	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Fosfokinaza kreatynowa z mięśni królika
CP	Sigma Aldrich	P1937	Sól di(tris) fosfokreatyny
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Ditiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′ -tetraoctowy
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Kwas protokatechowy
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protokatechuniano-3,4-dioksygenaza
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Ortokrzemian tetrametylu
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy
szerokopasmowe lustra dielektryczne o średnicy 1" z mocowaniami	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Ilość: 2
i frac12; ” średnica słupków	Thorlabs	TR4	ilość ≥ 6
ekspander wiązki 10X	Thorlabs	Obiektyw BE10M-A
o średnicy 2" f = 300 mm z mocowaniem	Thorlabs	LA1256-A, soczewka TIR LMR2
Cel wyrównania fluorescencyjnego	Szpitale
Laserowe gogle ochronne	Thorlabs	ND LG3
	Thorlabs	FW1AND
Profilometr wiązki optycznej	Thorlabs	BP209-VIS
Przysłona irysowa montowana na słupku	Thorlabs	ID25	Ilość: 2
Interferometr ścinający	Thorlabs	SI100
XYZ, ½ ” podróże	Szpitale	T12XYZ
Laser World	Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW